一种利用生物发光报告系统判定抗生素作用机制的方法与流程

文档序号：18793544发布日期：2019-09-29 19:13阅读：182来源：国知局

本发明涉及一种利用生物发光报告系统判定抗生素作用机制的方法。属于生物技术领域。

背景技术：

抗生素是人类对抗细菌感染的主要武器。抗生素的广泛使用造成了严重的抗生素耐药性问题，使得已有抗生素迅速失效，细菌感染重新成为人类健康的重大威胁。据统计，当前全球因为抗生素耐药死亡约70万人。在2050年，人们预计因为抗生素耐药全球每年将死亡1000万人，成为人类的头号死因。因为这种威胁的存在，使得新抗生素发现的重要性日益提高，对新抗生素的发现也成为科学界和医药界研究和工作的重点。

抗生素可以通过多种机制实现对细菌的杀灭，如阻止细胞壁合成、阻止蛋白质合成、阻止dna复制等。不同的杀菌机制导致了不同的杀菌效果。因此对抗生素杀菌机制的判断是对抗生素进行筛选的重要指标之一。然而，抗生素杀菌机制的鉴定需要复杂、耗时的分子机制研究，往往在抗生素上市后仍然无法完全确定，这降低了抗生素筛选的效率，也降低了对抗生素使用的效果。

细菌可以使用lux基因所编码的荧光素酶来实现生物发光。在细菌的lux基因中，luxa和luxb的作用是编码催化发光的亚基，而luxc、luxd和luxe则编码底物合成的相关蛋白。细菌的荧光素酶被广泛应用于各种报告系统，其中也包括了可以探测抗生素的系统中。

迄今为止，已有的鉴定抗生素作用机制的方法严重依赖于复杂的生物化学、分子生物学、遗传学研究，耗时耗力，且依赖于高水平科学研究，仍未有一种能够快速判定抗生素作用机制的方法。这一现状严重影响了抗生素的快速筛选、发现、鉴定和作用机制的研究。经检索，尚未有使用由分子伴侣基因clpx、groe、dnaj、dnak的启动子片段和与分子伴侣基因启动子相连的luxabcde基因片段构建而成的发光报告系统进行抗生素作用机制判定的报道出现。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种利用生物发光报告系统判定抗生素作用机制的方法。

本发明所述的利用生物发光报告系统判定抗生素作用机制的方法，步骤是：

(1)使用生物发光报告系统制备金黄色葡萄球菌lux报告株；其中，所述发光报告系统由pamilux-clpx-luxabcde质粒、pamilux-dnaj-luxabcde质粒、pamilux-dnak-luxabcde质粒、pamilux-groe-luxabcde质粒组成；所述pamilux-clpx-luxabcde质粒的核苷酸序列如seqidno：1所示，所述pamilux-dnaj-luxabcde质粒的核苷酸序列如seqidno：2所示，所述pamilux-dnak-luxabcde质粒的核苷酸序列如seqidno：3所示，所述pamilux-groe-luxabcde质粒的核苷酸序列如seqidno：4所示；所述金黄色葡萄球菌lux报告株是由四种质粒pamilux-clpx-luxabcde质粒、pamilux-dnaj-luxabcde质粒、pamilux-dnak-luxabcde质粒、pamilux-groe-luxabcde质粒分别转化入金黄色葡萄球菌中，制成的四株金黄色葡萄球菌报告株，分别命名为：报告菌株s1、报告菌株s2、报告菌株s3、报告菌株s4；

(2)制备含有四株金黄色葡萄球菌报告株的琼脂糖双层平板，将灭菌的滤纸片在琼脂糖双层平板中央或培养基表面有序排布并与培养基紧密相贴；

(3)将待检含有抗生素的溶液滴加到滤纸片上，继续培养并拍摄细菌发光图片；

(4)将发光图片转化为发光曲线，提取发光曲线特征同已知抗生素特征发光曲线比对进行层级聚类，若所检测抗生素发光曲线和已知作用机制的抗生素的发光曲线聚类在一起，则判定待检的抗生素作用机制与已知作用机制的抗生素相同。

上述利用生物发光报告系统判定抗生素作用机制的方法中：步骤(2)所述滤纸片优选是用打孔器将新华1号定性滤纸打成直径6mm的圆形小纸片。

上述利用生物发光报告系统判定抗生素作用机制的方法中：步骤(3)所述将待检含有抗生素的溶液滴加到滤纸片上以后，优选将平板倒置于培养箱中，37℃培养20～25h。

上述利用生物发光报告系统判定抗生素作用机制的方法中，步骤(4)所述将发光图片转化为发光曲线或已知抗生素特征发光曲线的绘制方法是：

1)以平板中心为原点(x0,y0)，将平板半径等分为一个特定份数(如300或1200份)，所得到的每个圆环中平均距离记为其中点到原点的最大距离和最小距离的平均值d；

2)设a为某个圆环中所有点的平均发光强度，则平均发光强度为d的函数：a＝f(d)；

3)应用设定的函数绘制成发光曲线。

上述利用生物发光报告系统判定抗生素作用机制的方法中：所述已知抗生素是达托霉素(dap)，多粘菌素b(pmb)，亚胺培南(ipm)，青霉素g(pen)，万古霉素(van)，红霉素(ery)，卡那霉素(kan)，壮观霉素(spe)，链霉素(str)，四环素(tet)，丝裂霉素c(mmc)，环丙沙星(cip)，加替沙星(gat)，甲氧苄啶(tmp)，利福平(rif)，腐草霉素(phl)。

上述利用生物发光报告系统判定抗生素作用机制的方法中：步骤(4)所述依据特征发光曲线进行层级聚类分析的方法是：

1)将每个从抑菌圈边缘到平板边缘部分的特征发光曲线记为由300个发光强度所表征的一个向量(发光强度表征向量)，每一个发光强度代表发光图片中从抑菌圈边缘到平板边缘部分每个圆环即抑菌圈边缘到平板边缘部分1/300的圆环中的平均发光强度；

2)将每一个抗生素所对应的生物发光系统中四株金黄色葡萄球菌报告株的特征发光曲线合并成一个由1200个发光强度所表征的合并发光强度表征向量；

3)使用欧几里得距离计算方法，计算抗生素的合并发光强度表征向量之间的距离，并构建抗生素的距离矩阵；

4)使用r语言中的hclust函数，用upgma算法，对抗生素的合并发光强度表征向量之间进行聚类分析，根据待检的抗生素是否同已知作用机制的抗生素聚类在一起判断其抗生素作用机制的类型。

本发明公开的方法可以快速而简便的判定抗生素作用机制类型，具有较高的临床应用价值。在用于抗生素发现、抗生素机制鉴定，并进一步用于指导细菌感染治疗方案等方面具有重要意义。

本发明是利用生物发光报告系统和数据分析方法，将生物发光报告系统转化入金黄色葡萄球菌后，根据含有生物发光报告系统的金黄色葡萄球菌在载有含抗生素的纸片的双层平板上发光的现象，拍摄发光图片，并将发光图片转化为发光曲线，计算发光的特征曲线，并对特征曲线进行聚类分析。通过对不同抗生素的发光特征曲线的分析表明：本方法可以通过发光特征曲线的聚类分析将具有相同的作用机制的抗生素的发光特征曲线聚类，从而通过判断抗生素的发光特征曲线与哪些已知作用机制的抗生素发光特征曲线聚类在一起判定抗生素作用机制，检测的灵敏度和特异性均达到了0.89以上，从而证明了本发明的作用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

避免了复杂的基础机制研究方法，可以快速对抗生素作用机制进行判定，从而提高新抗生素的发现速度，提高新抗生素作用机制的鉴定速度，利用本发明方法发现的抗生素能够在临床上用于治疗细菌感染，包括多重耐药菌感染，从而带来巨大的社会经济利益。

附图说明

图1：抗生素(环丙沙星)使得生物发光报告系统(pamilux-clpx-luxabcde)发光。

图2：不同抗生素的特征发光曲线。

其中：clpx、dnaj、dnak、groe指的是本发明所述发光报告系统中的四种质粒。三条线(从左到右)分别指示纸片半径、抑菌圈半径、平板半径。rlu，相对发光单位。cip，环丙沙星；dap，达托霉素；ery，红霉素；gat，加替沙星；ipm，亚胺培南；kan，卡那霉素；mmc，丝裂霉素c；pen，青霉素；phl，腐草霉素；pmb，多粘菌素b；rif，利福平；spe，壮观霉素；str，链霉素；tet，四环素；tmp，甲氧苄啶；van，万古霉素。

图3：用于抗生素作用机制判定的聚类分析。

具体实施方式

以下将通过具体实施例对本发明作进一步的说明，但是如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

下述实施例中所述方法内容若无特殊说明，则均为常规性实验方法。涉及的试剂、载体、菌株若无特殊说明，则均为公知的销售渠道获得。

实施例1

实验菌株及质粒:

escherichiacolidh5α：用于感受态制备，中国普通微生物菌种保藏管理中心获取(cgmcc1.12873)。

escherichiacolidh10b：用于感受态制备，thermofisherscientific公司获取(货号18297010)

staphylococcusaureusrn4220：用于感受态制备及发光检测，beiresources获取。

pmd19-t:购于大连宝生物公司(takara)

pamilux：来自加拿大英属哥伦比亚大学(文献：mesaklr,yimg,daviesj,improvedluxreportersforuseinstaphylococcusaureus,plasmid,2009,61(3):182-187.)

实验所需培养基及其配制:

lb培养基：配置每升培养基，应在950ml去离子水中加入胰蛋白胨(10g)、氯化钠(10g)、酵母提取物(5g)，并用磁力搅拌器搅拌至溶解。滴加5mol/l氢氧化钠调至ph7.0，用去离子水定容至1l后，分装并于121℃条件下高压蒸汽灭菌20min备用。若需固体培养基，则需按1.5％的比例加入琼脂粉。

nye培养基：配制1升培养基，应在950ml去离子水中加入酪蛋白水解物(10g)、酵母提取物(5g)、氯化钠(5g)，用磁力搅拌器搅拌至溶解。滴加5mol/l氢氧化钠调至ph7.2左右，用去离子水定容至1l后，分装并于121℃条件下高压蒸汽灭菌20min备用。若需固体培养基，则需按1.5％的比例加入琼脂粉。

实验所需抗生素及其配制:

氨苄青霉素(amp)溶液:称取100mg氨苄青霉素，溶解于1ml无菌超纯水中并涡旋振荡混匀，使其终浓度为100mg/ml，存放于-20℃冰箱中备用。使用时，按1:1000的比例加入培养基中。

氯霉素(chl)溶液：称取10mg氯霉素，溶解于1ml无水乙醇中并涡旋振荡混匀，使其终浓度为10mg/ml，存放于-20℃冰箱中备用。使用时，按1:1000的比例加入培养基中。

实验所需溶液及其配制:

感受态缓冲液:用电子天平称取0.333gcacl2、0.105g3-丙磺酸钠盐(mops)、0.148gmncl2·4h2o,溶解于40ml去离子水中，用移液枪量取7.5ml甘油加入上述溶液后，用去离子水定容至50ml，并用naoh调至ph至7左右。将缓冲液用0.22μm滤膜过滤除菌后，转移到50ml无菌离心管中于冰上预冷，备用。该缓冲液现用现配。

80％(v/v)甘油:量取80ml甘油溶于20ml超纯水中，121℃条件下高压蒸汽灭菌20min备用。

50×tae电泳缓冲液：称取tris242g，edta18.612g于烧杯中，加入700ml超纯水和57.1ml的冰醋酸，充分搅拌溶解。随后，加入naoh调节ph至8.3，最后定容至1l，常温下储存备用，用时稀释50倍即可。

实验所需试剂及仪器:

实验所需试剂:ezup柱式细菌基因组dna抽提试剂盒(sangongbiotech,shanghai,china)、ez-10柱式质粒小量抽提试剂盒(sangongbiotech,shanghai,china)、ez-10柱式dna胶回收试剂盒(sangongbiotech,shanghai,china)、pmd^tm19-tvectorcloningkit(takara,dalian,china)、flycutbamhi快速内切酶(transgenebiotech,beijing,china)、t4dnaligase(takara,dalian,china)、4sgreenplus无毒核酸染料(sangongbiotech,shanghai,china)、normalruntmprestained250bp-idnaladder(generaybiotech,shanghai,china)、1×t3superpcrmix(tsingke,beijing,china)、无菌滤膜(0.22μm)。

实验所需仪器:

dnp-9082型恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司)、恒温振荡培养箱(江苏太仓实验仪器厂)、hh-s恒温水浴锅(江苏金坛市医疗仪器厂)、微波炉(格兰仕)、超净工作台(江苏净化实验设备厂)、分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司)、涡旋振荡器(江苏省其林贝尔仪器制造有限公司)、离心机(艾本德中国有限公司)、pcr仪(伯乐生命医学产品(上海)有限公司)、dyy-6c型电泳仪(北京六一仪器厂)。

实验步骤：

步骤1.菌株活化和纯化

将冻存的甘油保藏的大肠杆菌(15％甘油)按1：300的比例接入到lb培养基中，37℃条件下振荡培养过夜。

大肠杆菌使用lb培养基培养，金黄色葡萄球菌使用nye培养基培养。吸取活化好的菌液10μl滴加到培养皿上，随后烧红接种环，待其冷却后蘸取菌液进行划线。注意划线时不要过疏或过密，否则难以分离得到单菌落。在37℃条件下先正放培养1h，待菌液完全吸收后倒置培养过夜。

步骤2.细菌基因组dna提取

本实验采用ezup柱式细菌基因组dna抽提试剂盒，步骤如下：

菌体收集：

金黄色葡萄球菌：取1ml过夜培养的细菌菌液到1.5ml离心管中，8000-12000rpm离心1min,尽量将上清液去除干净。加入180μl的溶菌酶溶液(使用前将溶菌酶加入enzymaticlysisbuffer中，配制成30mg/ml的溶菌酶溶液)，用移液枪反复吹打重悬菌体，于37℃条件下水浴至少3h。随后，加入20μlproteinasek,颠倒或振荡混匀，于56℃水浴中孵育至少1h至ep管中的液体澄清如蛋清状。此步骤非常关键，因金黄色葡萄球菌细胞壁厚，若裂解不完全，难以提取其基因组dna。

加入200μlbufferbd,混匀。

加入200μl无水乙醇，混匀。

将试剂盒中的吸附柱放于收集管中，用移液枪加入bufferbd和无水乙醇后的液体全部转移至吸附柱中，静置2-3min,随后12000rpm离心3min,弃去收集管中的废液。

将吸附柱放回收集管，滴加500μlpwsolution,12000rpm离心1min,弃去收集管中的废液。

将吸附柱放回收集管，加500μlwsshsolution,12000rpm离心1min。

将吸附柱放回收集管中，12000rpm离心5min,以除去残留的漂洗液。

取出吸附柱，置于新的1.5mlep管中，加入50-100μl无菌超纯水静置2min,12000rpm离心2min得到dna溶液。

步骤3.启动子-t载体的构建

基因groes-el、dnak、dnaj、clpx启动子片段的扩增:

以金黄色葡萄球菌基因组dna为模板,利用primerpremier5.0软件设计相应引物后(针对clpx、dnak、dnaj、groe启动子序列)，在上游、下游引物的5’端分别加上bamhⅰ酶切位点：ggatcc。此外，由于许多限制性内切核酸酶难以切割靠近dna分子末端的识别序列，为了解决这一问题，应当在寡核苷酸引物的5’端设计额外的保护碱基(如cgc)，引物序列如表1所示。

表1重组质粒构建和验证所需引物

pcr反应体系以superpcrmix说明书为参考(表2)：

表2pcr反应体系

pcr程序中的退火温度可根据扩增状况来调整，若杂带较多则提高退火温度，若目的条带难以扩增则降低退火温度。延伸时间与目的基因的片段大小有关，正常的扩增速度为1kb/min。

表3pcr反应程序

staphylococcusaureusrn4220琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物：

(1)配制0.8％的琼脂糖凝胶，称取0.8g琼脂糖，与100ml1×tae电泳缓冲液混合后于微波炉加热直至琼脂糖完全融化，直到获得清亮透明的溶液。

(2)于室温下冷却至50℃左右，按1：1000的比例加入核酸染料混匀，浇入模具内并插上合适的梳子，然后等待其凝结。梳齿底部的位置应当距离托盘面0.5-1mm，若梳齿太接近托盘面，在拔出梳子时容易破坏凝胶的点样孔，造成样品泄露。

(3)待胶凝固后，放置到装有1×tae电泳缓冲的电泳槽中，用移液枪将pcr产物和dnamarker分别点到胶孔中。关上电泳槽盖，接好电极插头，120v电压下进行电泳。

配胶所用的电泳液与电泳槽中放置的电泳液尽量为同一批次，因为即使是很小的离子强度改变都有可能导致凝胶性能异常，影响dna的迁移速率。

(4)将电泳完成后的琼脂糖凝胶放入成像仪内，在300nm的紫外灯下观察并拍照。

pcr产物纯化：

(1)使用凝胶成像仪观察琼脂糖凝胶，将含有目的条带的胶块用干净的刀片切下，切去边缘，使胶块体积尽可能小。随后，称量胶块重量，并将胶块转移到1.5mlep管中。

(2)每100mg的胶块加入300μlbindingbufferⅱ,在50-60℃的水浴锅中孵育10min,期间不断轻柔地晃动ep管，直至胶块融化。

(3)将收集管放置到2ml的ep管中，将上一步得到的混合液转移到收集管中，在室温下静置2min，12000rpm离心1min,弃去ep管中的废液。

(4)加入500μlwashsolution到收集管中,12000rpm离心1min,弃去ep管中的废液。

(5)重复步骤(4)。

(6)将收集管放回ep管中，12000rpm离心1min以除去残留的washsolution。

(7)将收集管放置在新的1.5mlep管中，向滤膜上加入30-40μl无菌超纯水，50℃水浴中孵育10min,12000rpm离心1min即可得到目的dna溶液。

启动子与t载体的连接：

构建中间载体是为了使启动子序列酶切完全。采用pmd^tm19-tvectorcloningkit，连接体系如下(10μl)：

表4.连接体系

将以上连接体系轻弹混匀，放置于4℃冰箱中过夜。

大肠杆菌感受态细胞的制作：

(1)接种10μl甘油管菌体到新鲜的3mllb试管中，37℃过夜培养。

(2)按1％-5％的比例将活化后的菌体接种于新鲜的100mllb培养基中，37℃、150r转速震荡培养至od值为0.3-0.6,然后置于冰上至少30min，终止细菌的快速生长,此步骤是感受态制作成功的关键，不可省略。

(3)将菌液转移至50ml无菌ep管中，使用4℃低温离心机5000rpm离心10min,弃上清。

(4)加入5ml预冷的感受态缓冲液,用枪头轻柔地重悬菌体，冰浴10min。

(5)使用4℃低温离心机5000rpm离心10min,弃上清。加入1ml预冷的感受态缓冲液，用枪头轻柔地重悬菌体，随后按每管100μl的体积分装于无菌ep管中，冻存在-80℃冰箱中备用。

(6)检测：取10μl感受态菌液，接种到3ml含有amp的新鲜lb培养基中，37℃过夜培养。若第二天培养基未见菌体生长，则说明感受态未染菌，可以正常使用。若培养基变浑浊，则这批感受态应该弃之不用，重新制作。

转化(热击法)：

(1)将含有100mllb琼脂培养基的锥形瓶放置于微波炉中加热至完全融化，在室温下冷却至60℃左右，向培养基中加入100μl氨苄青霉素(100mg/ml)。轻轻摇动锥形瓶，注意不要有气泡，然后倾倒在灭菌培养皿中制成氨苄青霉素抗性平板。

(2)将冰盒中装满冰，放置于-80℃冰箱旁边。从冰箱中取出保存的感受态细胞，并利用手掌的温度使其快速解冻。当感受态刚刚融化时，立即插入冰中。

(3)将10μl启动子与t载体连接反应完成后的反应体系加入到100μl感受态细胞中，轻弹ep管混匀，冰浴30min。

(4)冰浴后的混合液于42℃水浴锅中热击90s，此步骤的温度和时间都非常关键，注意热击时不可晃动ep管。

(5)热击后，迅速将ep管转移至冰上，冰浴5min。

(6)向ep管中加入800μl新鲜的不含抗生素的lb培养基，37℃条件下150r恢复培养1h。随后，3000r离心，弃去部分上清液后混匀,取150μl涂布于含有相应抗生素的lb平板上。37℃条件下先正置培养1h,待菌液被培养基吸收完全后，再倒置培养过夜。

阳性克隆的鉴定：

在ep管中加入10μl无菌超纯水，挑取平板上的单克隆在水中混匀。取1μl用作pcr模板进行菌落pcr，剩余9μl用于接种(表5)。

表5pcr反应程序：

将扩增得到的pcr产物经电泳后得到目的条带，则可进行测序，测序结果利用bioedit软件进行序列比对后，即可筛选出正确的阳性克隆，从而制备成功生物发光报告系统，由pamilux-clpx-luxabcde质粒、pamilux-dnaj-luxabcde质粒、pamilux-dnak-luxabcde质粒、pamilux-groe-luxabcde质粒组成；所述pamilux-clpx-luxabcde质粒的核苷酸序列如seqidno：1所示，所述pamilux-dnaj-luxabcde质粒的核苷酸序列如seqidno：2所示，所述pamilux-dnak-luxabcde质粒的核苷酸序列如seqidno：3所示，所述pamilux-groe-luxabcde质粒的核苷酸序列如seqidno：4所示。

表6构建的t质粒

步骤4.发光报告系统的构建

酶切：将质粒pamilux、pm1、pm2、pm3、pm4用bamhⅰ进行酶切。反应体系如下(表7)：

表7酶切体系

上述混合液在37℃下孵育1h,随后80℃孵育20min使内切酶失活，失活步骤不可省略，以免内切酶出现星活性。推荐使用pcr仪进行温度控制。

载体去磷酸化：质粒pamilux经单酶切后，去除5’端的磷酸基团能够抑制质粒dna发生自连和环化。在体外连接反应中，只有当一个核苷酸含有5’-磷酸基团且另一个带有3’-羟基末端时，才能被dna连接酶催化形成磷酸二酯键。因此，利用碱性磷酸酶处理质粒dna，使其脱去5’-端的磷酸基团，可以有效防止自身环化的发生。反应体系如下(表8)：

表8载体去磷酸化体系

37℃条件下反应1h,随后75℃加热5min使碱性磷酸酶失活。启动子片段无需去磷酸化，载体去磷酸化时间也不宜过长，以免降低连接效率。

dna纯化：参考试剂盒纯化流程。

连接：将酶切、纯化后的启动子片段和质粒pamilux用t4连接酶连接，体系如下(表9)：

表9连接体系

将连接体系混匀后，放置于4℃冰箱中过夜连接。

转化及阳性克隆的筛选：由于金黄色葡萄球菌细胞壁很厚，质粒的转化操作较为困难，所以要先将连接产物用热击法转化进e.colidh5α中，便于阳性克隆的筛选。然后从bamhⅰ位点两侧设计引物(luxf,luxr)，以便进行片段插入方向的验证。

金黄色葡萄球菌电转化感受态的制备：

金黄色葡萄球菌感受态全程要在常温下制备。

(1)取过夜生长的s.aureusrn4220，按2％的比例接种到新鲜的100mlnye液体培养基中，37℃、150r振荡培养至od为0.2-0.3。

(2)将菌体收集至50ml无菌ep管中，5000rpm离心10min。

(3)弃去上清液，加入25ml无菌超纯水，用枪头轻轻吹打使菌体重悬，5000rpm离心十分钟。

(4)弃去上清液，加入10ml无菌超纯水，重悬菌体，5000rpm离心10min。

(5)弃去上清液，加入5ml10％甘油，重悬菌体，5000rpm离心10min。

(6)重复步骤(5)。

(7)向菌体中加入1ml10％的甘油，重悬，按每管70μl的体积分装到无菌ep管中，-80℃保存备用。

制作电转化感受态的过程中，必须用去离子水充分洗涤菌体，以去除培养基中所含的盐离子，防止电击时爆杯。

金黄色葡萄球菌电转化：

(1)将含有100mlnye琼脂培养基的锥形瓶放置于微波炉中加热至完全融化，在室温下冷却至60℃左右，向培养基中加入100μl氯霉素(10mg/ml)。轻轻摇动锥形瓶，注意不要有气泡，然后倾倒在灭菌培养皿中制成氯霉素抗性平板。

(2)从-80℃冰箱中取出适当数量的冷冻感受态细胞置于常温，待其刚刚解冻时，向其中加入10μlpamilux-clpx-luxabcde质粒，或pamilux-groe-luxabcde质粒，或pamilux-dnaj-luxabcde质粒，或pamilux-dnak-luxabcde质粒，轻弹ep管壁混匀，在常温下孵育30min。有文献报道孵育时间以30min为佳，超过或不足30min将会降低转化效率。

(3)将混合液转移到2mm电转杯中，最好是将移液器吸头沿着电转杯壁插入，将细胞加到槽的一端，并在平整的桌面上轻叩电转杯，以震出液体里含有的气泡。随后将电转杯盖上盖子装入电转仪中，选择预设程序：sta，按下pulse键，听到蜂鸣声后迅速将电转杯拿出，在30s之内向电转杯中加入800μl新鲜的nye培养基。

感受态细胞与dna的混合液中含有的离子会增加溶液的电导率，导致电弧的产生，这时电转杯会发生爆裂，极大降低电转化的效率。若出现这种情况，要考虑感受态细胞制作时是否洗涤不完全，或是溶解质粒dna的溶液中是否含有某些离子，应逐一排查并解决。

(4)将液体转移到无菌ep管中，37℃条件下100r恢复培养1.5h。电击后细菌菌体非常脆弱，不可剧烈振摇。

(5)将复苏后的菌液3000rpm离心5min，弃去部分上清，剩余的450μl上清液与菌体重悬后用来涂板，每板涂布150μl。37℃正置培养1h，待菌液吸收后倒置培养24-48h，方能出现肉眼可见的菌落。不建议将离心浓缩后的细菌悬液全部涂到一个平板上，因为电转化会产生大量死细胞，这些细胞附着在培养基表面可能会抑制本就稀少的转化子生长。

上述四种质粒pamilux-clpx-luxabcde质粒、pamilux-dnaj-luxabcde质粒、pamilux-dnak-luxabcde质粒、pamilux-groe-luxabcde质粒分别转化入金黄色葡萄球菌中得到的四株金黄色葡萄球菌lux报告株分别命名为：报告菌株s1、报告菌株s2、报告菌株s3、报告菌株s4。

实施例2特征发光曲线的绘制

实验菌株：实验所用菌株为的四株金黄色葡萄球菌lux报告株：s1、s2、s3、s4。

实验所需培养基及其配制

1.nye琼脂培养基

2.0.7％琼脂：用天平称取0.7g琼脂加入到锥形瓶中，再加入100ml去离子水，121℃条件下高压蒸汽灭菌20min备用。

实验所需抗生素及其配制

1.达托霉素(dap)溶液：取30mg达托霉素溶解于1ml超纯水中，使其终浓度为30mg/ml，0.22μm滤膜过滤除菌；

2.多粘菌素b(pmb)溶液：取100mg多粘菌素b溶解于1ml超纯水中，使其终浓度为100mg/ml，0.22μm滤膜过滤除菌；

3.亚胺培南(ipm)溶液：取10mg亚胺培南溶解于1ml超纯水中，使其终浓度为10mg/ml，0.22μm滤膜过滤除菌；

4.青霉素g(pen)溶液：取10mg青霉素g溶解于1ml超纯水中，使其终浓度为10mg/ml，0.22μm滤膜过滤除菌；

5.万古霉素(van)溶液：取30mg万古霉素溶解于1ml超纯水中，使其终浓度为30mg/ml，0.22μm滤膜过滤除菌；

6.红霉素(ery)溶液：取15mg红霉素溶解于1ml无水乙醇中，使其终浓度为30mg/ml，0.22μm滤膜过滤除菌；

7.卡那霉素(kan)溶液：取30mg卡那霉素溶解于1ml超纯水中，使其终浓度为30mg/ml，0.22μm滤膜过滤除菌；

8.壮观霉素(spe)溶液：取100mg壮观霉素溶解于1ml超纯水中，使其终浓度为100mg/ml，0.22μm滤膜过滤除菌；

9.链霉素(str)溶液：取10mg链霉素溶解于1ml超纯水中，使其终浓度为10mg/ml，0.22μm滤膜过滤除菌；

10.四环素(tet)溶液：取30mg四环素溶解于1ml超纯水中，使其终浓度为30mg/ml，0.22μm滤膜过滤除菌；

11.丝裂霉素c(mmc)溶液：取5mg丝裂霉素c溶解于1ml超纯水中，使其终浓度为5mg/ml，0.22μm滤膜过滤除菌；

12.环丙沙星(cip)溶液：取5mg环丙沙星溶解于1ml超纯水中，使其终浓度为5mg/ml，0.22μm滤膜过滤除菌；

13.加替沙星(gat)溶液：取5mg加替沙星溶解于1ml超纯水中，使其终浓度为5mg/ml，0.22μm滤膜过滤除菌；

14.甲氧苄啶(tmp)溶液：取5mg甲氧苄啶于500ml超纯水中，缓慢滴加稀盐酸，直至全部溶解，用超纯水定容至1ml，使其终浓度为5mg/ml，0.22μm滤膜过滤除菌；

15.利福平(rif)溶液：取10mg利福平溶解于1mldmso中，使其终浓度为10mg/ml，0.22μm滤膜过滤除菌；

16.腐草霉素(phl)溶液：取5mg腐草霉素溶解于1ml超纯水中，使其终浓度为5mg/ml，0.22μm滤膜过滤除菌。

实验所需仪器：超净工作台(江苏净化实验设备厂)、电热恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司)、lumazonepylon2048b植物活体成像系统(博益伟业仪器有限公司)。

实验步骤

步骤1、平板制备

1.将报告菌株s1、报告菌株s2、报告菌株s3、报告菌株s4在nye平板上划线，37℃过夜培养，然后用封口膜包好，放入4℃冰箱备用。

2.取新华1号定性滤纸，用打孔器打成直径6mm的圆形小纸片，放置在玻璃培养皿中，用牛皮纸包好，121℃灭菌20min，在烘箱中烘干备用。

3.将nye琼脂培养基用微波炉加热至琼脂完全融化后，放置于室温冷却至60℃左右，倾倒平板，每块板的厚度尽量均匀一致。

4.挑取报告菌株s1、或报告菌株s2、或报告菌株s3、或报告菌株s4单菌落溶解于200μl无菌超纯水中，然后按1：1000的比例将菌悬液加入0.7％的琼脂中，混匀后倾倒在nye平板的上层，相应制成含有菌株s0、报告菌株s1、报告菌株s2、报告菌株s3、报告菌株s4的双层平板各16个。

5.待双层平板凝固后，将镊子在火焰上灼烧一下，冷却后夹取滤纸片轻轻贴在培养基表面。为了使纸片与培养基紧密相贴，可用镊子轻轻按压纸片。为了能够准确的观察结果，纸片在培养基表面的位置应当有序分布。

6.培养基在冷却的过程中，表面可能出现冷凝水滴。为防止冷凝水将药物冲散影响抑菌圈的形状，纸片加药前可先将培养基的盖子打开，利用超净台内的无菌空气蒸发掉多余水分。

7.在所制备的含有菌株s1的双层平板(共16个)中，用移液枪取1μl抗生素溶液滴加到各个平板中预置的滤纸片上，将平板倒置于培养箱中，37℃培养20h。其中，所述抗生素是cip，dap，ery，gat，ipm，kan，mmc，pen，phl，pmb，rif，spe，str，tet，tmp，或van，按每一个平板1μl分别滴加。

8.在所制备的含有菌株s2的双层平板(共16个)中，用移液枪取1μl抗生素溶液滴加到各个平板中预置的滤纸片上，将平板倒置于培养箱中，37℃培养20h。其中，所述抗生素是cip，dap，ery，gat，ipm，kan，mmc，pen，phl，pmb，rif，spe，str，tet，tmp，或van，按每一个平板1μl分别滴加。

9.在所制备的含有菌株s3的双层平板(共16个)中，用移液枪取1μl抗生素溶液滴加到各个平板中预置的滤纸片上，将平板倒置于培养箱中，37℃培养20h。其中，所述抗生素是cip，dap，ery，gat，ipm，kan，mmc，pen，phl，pmb，rif，spe，str，tet，tmp，或van，按每一个平板1μl分别滴加。

10.在所制备的含有菌株s4的双层平板(共16个)中，用移液枪取1μl抗生素溶液滴加到各个平板中预置的滤纸片上，将平板倒置于培养箱中，37℃培养20h。其中，所述抗生素是cip，dap，ery，gat，ipm，kan，mmc，pen，phl，pmb，rif，spe，str，tet，tmp，或van，按每一个平板1μl分别滴加。

步骤2、平板成像

lumazone成像系统由三部分组成，分别是ccd相机、暗箱和光源。具体操作步骤如下：

1.打开ccd相机电源开关、暗箱开关、电源开关，打开电脑和软件。

2.打开液氮开关，此时开始向ccd相机中加注液氮，大约2h后温度即可降至-110℃。

3.将需要成像的培养皿放置于暗箱中，打开软件的“acquire”选项，选择“明场”，曝光时间为100ms,采样频率为1mhz,然后单击“acquire”获取明场图像，保存为tif格式。

4.获取生物发光图像时，打开软件的“acquire”选项，选择“luc”，曝光时间为10min,采样频率为50khz,然后单击“acquire”获取图像，保存为tif格式。

5.使用完毕后，首先关闭分析软件，然后关闭暗箱电源和光源电源。注意：ccd相机的电源不可马上关闭，要等24h后ccd相机的温度升到室温后再关闭。

发光报告系统对抗生素的发光响应的举例如图1所示。

步骤3、绘制特征发光曲线

1.以平板中心为原点(x0,y0)，将平板半径等分为一个特定份数(如300或1200份)，所得到的每个圆环中平均距离记为其中点到原点的最大距离和最小距离的平均值d。

2.设a为某个圆环中所有点的平均发光强度，则平均发光强度为d的函数：a＝f(d)。

3.应用设定的函数绘制成为特征发光曲线。

绘制所得的特征发光曲线如图2所示。

实施例3特征发光曲线的聚类分析

实验步骤

步骤1、聚类分析

1.将每个特征发光曲线(从抑菌圈边缘到平板边缘的部分)记为由300个发光强度所表征的一个向量(发光强度表征向量)，每一个发光强度代表实施例2发光图片中从抑菌圈边缘到平板边缘部分每个圆环(跨度为抑菌圈边缘到平板边缘部分的1/300)中的平均发光强度。

2.将每一个抗生素所对应的四个报告菌株的特征发光曲线合并成一个由1200个发光强度所表征的合并发光强度表征向量。

3.使用欧几里得距离计算方法，计算抗生素的合并发光强度表征向量之间的距离，并构建抗生素的距离矩阵。

4.使用r语言中的hclust函数，使用upgma算法，对抗生素的合并发光强度表征向量之间进行聚类分析。

5.获取16种抗生素的合并发光强度表征向量(各3个平行)：cip，环丙沙星；dap，达托霉素；ery，红霉素；gat，加替沙星；ipm，亚胺培南；kan，卡那霉素；mmc，丝裂霉素c；pen，青霉素；phl，腐草霉素；pmb，多粘菌素b；rif，利福平；spe，壮观霉素；str，链霉素；tet，四环素；tmp，甲氧苄啶；van，万古霉素。

6.对16种抗生素的合并发光强度表征向量进行聚类分析，发现对于不同报告菌株，同一个作用机制的抗生素聚类在一起。聚类结果如图3所示。

7.对相同作用机制的抗生素的聚类分析结果进行分析(表10)，说明通过聚类分析进行抗生素作用机制判断的灵敏度和特异性都大于等于0.89。

表10抗生素作用机制判断的灵敏度和特异性

步骤2、抗生素作用机制的判定

使用四种报告菌株s1、s2、s3、s4检测同一种抗生素溶液。

使用如实施例2和实施例3中所述的方法制备含有四株金黄色葡萄球菌报告株的琼脂糖双层平板，将灭菌的滤纸片在琼脂糖双层平板中央或培养基表面有序排布并与培养基紧密相贴；将待检含有抗生素的溶液滴加到滤纸片上，继续培养并拍摄细菌发光图片；将发光图片转化为发光曲线，提取发光曲线特征同已知抗生素特征发光曲线比对进行层级聚类，若所检测抗生素发光曲线和已知作用机制的抗生素的发光曲线聚类在一起，则判定待检的抗生素作用机制与已知作用机制的抗生素相同。

其中，上述滤纸片是用打孔器将新华1号定性滤纸打成直径6mm的圆形小纸片。上述将待检含有抗生素的溶液滴加到滤纸片上以后，将平板倒置于培养箱中，37℃培养25h。

上述将发光图片转化为发光曲线的绘制方法是：

1)以平板中心为原点(x0,y0)，将平板半径等分为一个如300或1200份的特定份数，所得到的每个圆环中平均距离记为其中点到原点的最大距离和最小距离的平均值d；

2)设a为某个圆环中所有点的平均发光强度，则平均发光强度为d的函数：a＝f(d)；

3)应用设定的函数绘制成发光曲线。

上述依据特征发光曲线进行层级聚类分析的方法是：

1)将每个从抑菌圈边缘到平板边缘部分的特征发光曲线记为由300个发光强度所表征的一个向量，每一个发光强度代表发光图片中从抑菌圈边缘到平板边缘部分每个圆环即抑菌圈边缘到平板边缘部分1/300的圆环中的平均发光强度；

2)将每一个抗生素所对应的生物发光系统中四株金黄色葡萄球菌报告株的特征发光曲线合并成一个由1200个发光强度所表征的合并发光强度表征向量；

3)使用欧几里得距离计算方法，计算抗生素的合并发光强度表征向量之间的距离，并构建抗生素的距离矩阵；

序列表

<110>山东大学

<120>一种利用生物发光报告系统判定抗生素作用机制的方法

<141>2019-6-11

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>12432

<212>dna

<213>人工序列

<221>pamilux-clpx-luxabcde质粒序列

<400>1

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<212>dna

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<400>2