本发明属于低剂量辐射损伤评价
技术领域：
，具体涉及一种低剂量电离辐射损伤分子标志物牛磺酸的筛选与验证方法。
背景技术：
：电离辐射通过产生自由基直接或间接损害细胞和组织，并对机体产生不良影响，引起炎症、癌症甚至是死亡。随着核电、同位素和放射治疗的广泛应用，人们受到低剂量电离辐射的机会越来越多，自2011年福岛核事故之后，低剂量辐射对人体健康的影响已引起广泛关注。高剂量电离辐射的健康效应已较为明确，但有关于低剂量辐射所引起的生物学效应及损伤标志物仍未探明。个体暴露于低剂量电离辐射后，可能在几小时或几天内不会出现明显的症状，也可能在数年后才表现出造血系统和免疫系统的进行性损伤及致癌效应。目前我们尚不能对低剂量辐射暴露的危害风险进行评估，这在一定程度上是由于我们对低剂量辐射所引起的生物学效应认识不足，且相关研究也较为缺乏。因此，寻找可靠的生物效应标志物，对早期低剂量辐射风险的评估和暴露人群的医疗分类管理都具有十分重要的意义。传统方法中，细胞遗传学是辐射损伤生物效应标志物研究的标准方法。但当低剂量电离辐射引起的分子改变较为轻微时，细胞遗传学方法则缺乏一定的敏感性。代谢组学可以对生物样本中轻微变化的小分子物质进行定性和定量评估，快速测定代谢物含量，已成功应用于毒性评估、疾病诊断和标志物寻找等领域。非靶向代谢组学方法主要用于代谢物的广泛评估与筛查，存在重复性差和容易产生峰对齐误差的缺点；靶向代谢组学方法用于特定代谢物的定量分析，存在代谢物研究范围相对狭窄的情况。因此，结合靶向和非靶向代谢组学方法进行研究，可以快速、准确地筛选和验证低剂量辐射损伤标志物，并对低剂量辐射诱导的代谢通路紊乱进行评估。目前，低剂量辐射诱导的代谢通路紊乱效应及辐射损伤生物标志物的研究通常采用小鼠、大鼠和非灵长类动物进行。但不同种属的代谢会存在一定的差异，因而对动物的相关研究结果并不能完全适用于人类。技术实现要素：针对上述情况，本发明提供了一种人体低剂量电离辐射损伤分子标志物牛磺酸的筛选与验证方法。首先以铀矿山一线工人作为低剂量辐射暴露组，以办公室人员作为对照组，采用非靶向代谢组学方法对低剂量辐射职业暴露人群进行潜在低剂量辐射损伤分子标志物的广泛筛选，然后基于非靶向代谢组学研究结果以及潜在低剂量辐射损伤分子标志物的相关生理学意义，进一步利用靶向代谢组学方法对筛选出的代谢物进行靶向定量验证。在此基础上利用非靶向和靶向代谢组学方法对两组人群血液中牛磺酸的表达水平进行统计分析。在非靶向代谢组学统计分析结果中，筛选的牛磺酸满足p<0.05以及变化倍数小于0.82或大于1.2，且在靶向代谢组学结果中，牛磺酸均值在两组人群中有显著差异（p<0.05）。因此，确认牛磺酸可作为人体低剂量电离辐射损伤分子标志物。该方法可以用来筛选和验证低剂量辐射损伤的分子标志物，以评估职业人群的低剂量辐射损伤情况，具有所需时间短、特异性强、可靠性高、环境风险小等多重优点。具体步骤包括：（1）对象纳入；（2）样本采集；（3）非靶向代谢组学初筛；（4）靶向代谢组学定量验证；（5）统计分析确定低剂量辐射损伤分子标志物。其进一步的措施是：所述对象纳入的具体方法为：在某省某铀矿山通过查阅矿山记录，将有辐射暴露的32名一线工人作为暴露组，将无辐射暴露的的32名办公室人员作为对照组，两组人群在年龄和性别构成上相似。纳入标准：①该铀矿山的全部工作人员；②该铀矿山工人健康信息表问卷资料填写完整者（见附表1）；③收集到血液样本者。排除标准：①有糖尿病者；②有严重血液系统疾病者；③有长期服药史者。所述样本采集的具体方法为：利用装有肝素钠抗凝剂的离心管进行空腹采样，采集全血2ml，采集到的血液样本在室温下离心5min（3000rpm），取0.2ml的上清液装于离心管中，共装4管，–80℃冰箱冻存。所述非靶向代谢组学初筛的具体方法为：上样前样本处理：将置于–80℃的样本在4℃下解冻后，移取100μl样本至EP管中，加入300μl甲醇及10μl内标，涡旋混匀30s后，超声10min（冰水浴），然后在–20℃下静置1h。再在4℃下将静置液在13000rpm的转速下离心15min，取出200μl上清于自带内插管的进样瓶中。②上机检测：1）色谱条件：采用WatersACQUITYUPLC（色谱柱为UPLCHSST:1.7μm2.1mm×100mm）作为分析仪器，正离子模式流动相的组成为0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，负离子模式流动相组成为5mM醋酸铵水溶液(A)-乙腈(B)。洗脱梯度为0min，1%B；1min，1%B；8min，99%B；10min，99%B；10.1min，1%B；12min，1%B。流速为0.5ml/min，进样量为1μl。2）质谱条件：采用ThermoQExactiveOrbitrap对数据进行采集，正负离子喷雾电压分别为3.8和3.1kV，毛细管温度为320℃，鞘气为40arb，辅助气为15arb，扫描范围为70-1000，分辨率为70000，碰撞电压为20/40/60eV。③数据处理和物质验证：获得的质谱原始数据利用ProteoWizard软件转成mzML格式，再利用XCMS做保留时间矫正、峰过滤、峰识别、峰提取、峰积分、峰对齐等。使用CompondDiscoverer（Version2.0,Thermo）及OSI-SMMS（Version1.0,大连达硕信息技术有限公司）软件配合mzCloud数据库及自建数据库进行物质验证。④潜在效应生物标志物筛选及代谢通路分析采用t检验法，利用两独立样本分析暴露组和对照组代谢物的差异表达情况。用变化倍数（foldchange）来表示暴露组差异代谢物的水平与对照组相比是呈上升（变化倍数大于1.2）还是下降的趋势（变化倍数小于0.82）。本次差异代谢物的筛选标准为：p<0.05以及变化倍数小于0.82或大于1.2。将筛得的差异代谢物在生物信息数据库（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes（KEGG）数据库、HumanMetabolomeDatabase（HMDB）数据库以及PubChem数据库）中进行物质注释获取相应的ID号及相关信息。为进一步探索注释到的差异代谢物的生理学意义及寻找受低剂量辐射影响较高的信号通路，我们进一步将这些物质在KEGGmapper上进行标注并利用MetaboAnalyst进行代谢通路分析。⑤质量控制：在每个待测样本中各取20μl混合成QC样本，再从QC样本中取200μl上机检测以用来测定系统的稳定性。所述靶向代谢组学方法定量验证的具体方法为：上样前样本处理：将置于–80℃的样本解冻后移取100μl样本至EP管中，加入300μl甲醇，涡旋混匀30s后，在–20℃下静置1h，然后在4℃下将静置液在13000rpm的转速下离心15min，取出200μl上清于自带内插管的进样瓶中，进行后续高效液相色谱质谱分析，再分别取稀释10倍和200倍的上清液做高效液相色谱质谱分析。②标准溶液配制：配制标准液时，分别准确称取相应量的标准品于10ml容量瓶中，配制成10mmol/L的标准品储备液，然后再取相应量的标准品储备液于10ml容量瓶中，配制成混合标准溶液，最后依次稀释该标准溶液得一系列校准溶液。③上机检测：1）色谱条件：采用Agilent1290InfinityIIseries（色谱柱为WatersACQUITYUPLCHSST3T:1,8μm,100×2.1mm）超高效液相色谱仪作为分析仪器。流动相的组成为0.1%甲酸水溶液（A）-甲醇（B），色谱梯度见表1。柱温箱温度为35℃，样品盘设为4℃，进样量为1μl。2）质谱条件：采用Agilent6460三重四极杆质谱仪（装备有AJS-ESI离子源），以多反应监测（MRM）模式进行质谱分析。离子源参数如下：毛细管电压为+4000/-3500V,喷雾电压为+500/-500V，辅助气（氮气）温度为300℃，辅助气（氮气）流速为5L/min,鞘气（氮气）温度为250℃，鞘气（氮气）流速为11L/min，雾化器压力为45psi.。表1液相色谱梯度TimeA(H2O)B(MeOH)Flow0.00min98.00%2.00%0.30mL/min1.00min98.00%2.00%0.30mL/min5.00min70.00%30.00%0.30mL/min7.00min20.00%80.00%0.30mL/min8.00min20.00%80.00%0.30mL/min8.20min98.00%2.00%0.30mL/min13.00min98.00%2.00%0.30mL/min进行高效液相色谱质谱分析之前，将目标化合物标准溶液引入质谱中。整个检测过程中，所有质谱数据的采集及目标化合物的定量分析，均通过AgilentMassHunterWorkStationSoftware（B.08.00,AgilentTechnologies）来完成。检测过程中，若检测的待测物浓度高出校准曲线范围，均重新稀释合适倍数后再重新测定，定量结果为最终稀释后所测得的数据。所述统计分析确定低剂量辐射损伤分子标志物的具体步骤为：在非靶向代谢组学结果中，筛选的代谢物需要满足p<0.05以及变化倍数小于0.82或大于1.2，且在靶向代谢组学结果中，暴露组和对照组两组人群该代谢物的均值有显著差异（p<0.05），即确认该代谢物是低剂量辐射损伤分子标志物。经非靶向代谢组学筛选和靶向代谢组学验证，牛磺酸可作为人体低剂量电离辐射损伤分子标志物。本发明采用对象纳入、样本采集、非靶向谢组学筛选和靶向代谢组学验证相结合的方法，筛选与验证了牛磺酸可作为人体低剂量辐射损伤的分子标志物，与其他辐射损伤分子标志物相比，牛磺酸更能系统反映职业人群低剂量辐射照射下的生物损伤效应；牛磺酸检测所使用的样本，如血液、尿液等，都较易获得，在应用中更具有实际意义，具有所需时间短、特异性强、可靠性高、环境风险小等多重优点。具体实施方式实施例1在某省某铀矿山通过查阅矿山记录，将有辐射暴露的32名一线工人作为暴露组，以未接受辐射照射的32名办公室人员作为对照组，两组人群在年龄和性别构成上相似。纳入标准：①该铀矿山的全部工作人员；②铀矿山工人健康信息表问卷资料填写完整者（见附表1）；③收集到血液样本者。排除标准：①有糖尿病者；②有严重血液系统疾病者；③有长期服药史者。利用装有肝素钠抗凝剂的离心管进行空腹采样，采集全血2ml，采集后的血液样本在室温下离心5min（3000rpm），取0.2ml的上清液装于离心管中，共装4管，–80℃冰箱冻存。采用非靶向代谢组学技术对低剂量辐射损伤分子标志物进行初筛，采用t检验法，利用两独立样本分析暴露组和对照组代谢物的差异表达情况，用变化倍数来表示暴露组的差异代谢物水平与对照组相比是呈上升（变化倍数大于1.2）还是下降（变化倍数小于0.82）的趋势，差异代谢物的筛选标准为：p<0.05以及变化倍数小于0.82或大于1.2。分析初筛的代谢物的相关生理学意义后，利用靶向代谢组学对两组人群血液中筛选出的代谢物的表达水平进行定量比较，代谢物均值在暴露组和对照组两组人群中有显著差异（p<0.05），即确认该代谢物是低剂量辐射损伤分子标志物。最后，本实施例确认牛磺酸可作为人体低剂量电离辐射损伤分子标志物，牛磺酸非靶向和靶向代谢组学统计分析结果见附表2。表2牛磺酸非靶向和靶向代谢组学统计分析结果注：*P<0.05，暴露组与对照组比较差异有统计学意义。当前第1页1 2 3