一种前列腺特异抗原的检测试剂盒、检测方法及应用与流程

本发明属于抗原检测技术领域，具体涉及一种前列腺特异抗原的检测试剂盒、检测方法及应用。

背景技术：

抗原检测在临床诊断中具有重要的参考价值。人和动物细胞的表面分子：包括细胞表面各种分化抗原(如cd抗原)、同种异型抗原(血型抗原或mhc抗原)、病毒相关抗原和肿瘤相关性情抗原等。检测这些抗原对各种细胞的分类、分化过程及功能研究、对各种与免疫有关的疾病的诊断及发病机制的研究，均有重要意义。

目前抗原检测的方法主要有传统的酶联免疫检测法(elisa)、放射免疫分析(ria)、荧光免疫分析(fia)、化学发光免疫分析技术(clia)、自动化免疫分析等。荧光免疫检测技术具有专一性强、灵敏度高、实用性好等优点，因此它被用于测量含量很低的生物活性物质，例如蛋白质(酶、抗体)、激素(甾族化合物、甲状腺激素)等。dna辅助的蛋白检测技术可以提高检测技术的性能，如聚合酶链反应、滚环放大等，但繁琐的步骤、以及聚合酶扩增可能的假阳性等因素限制了其应用。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种前列腺特异抗原的检测试剂盒、检测方法及应用，所述方法基于邻位连接、链替代、杂交链式反应和镁离子dna酶检测抗原，通过修饰了dna的抗体与目标抗原特异性结合，将抗原输入转换为dna信号输出，结合链替代、杂交链式反应和镁离子dna酶的信号放大技术，实现目标抗原的高灵敏、特异性检测。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种前列腺特异抗原的检测试剂盒，包括以下组分：psa抗体，琥珀酰亚胺-4-(n-马来酰亚胺)环已烷-1-1羟酸酯，三(2-羧乙基)膦，巯基修饰的dna1，巯基修饰的dna2，发夹dnah1，发夹dnah2，发夹dnah3，发夹dnah4，信标mb和mg²⁺；所述巯基修饰的dna1的核苷酸序列如seqidno.1所示；所述巯基修饰的dna2的核苷酸序列如seqidno.2所示；所述发夹dnah1的核苷酸序列如seqidno.3所示；所述发夹dnah2的核苷酸序列如seqidno.4所示；所述发夹dnah3的核苷6酸序列如seqidno.5所示；所述发夹dnah4的核苷酸序列如seqidno.6所示；所述信标mb包含一个识别离子酶的ra碱基且修饰有fam和bhq基团。

优选的，所述信标mb的核苷酸序列如seqidno.7所示。

本发明还提供了一种前列腺特异抗原的检测方法，包括以下步骤：(1)将psa抗体和琥珀酰亚胺-4-(n-马来酰亚胺)环已烷-1-1羟酸酯进行偶联反应2h后，过滤得处理后抗体；所述psa抗体和琥珀酰亚胺-4-(n-马来酰亚胺)环已烷-1-1羟酸酯的摩尔比为1:10～20；

(2)将巯基修饰的dna1和巯基修饰的dna2分别与三(2-羧乙基)膦进行羟基活化反应1h，得处理后dna1和处理后dna2；所述巯基修饰的dna1和巯基修饰的dna2与三(2-羧乙基)膦的摩尔比为1:10⁴；

(3)将所述处理后抗体分别与处理后dna1和处理后dna2在4℃孵育12h，得ab1-dna1和ab2-dna2；所述所述处理后抗体与处理后dna1和处理后dna2的体积比均为1:1；

(4)将所述ab1-dna1、ab2-dna2、psa、发夹dnah1和发夹dnah2混合后37℃反应2h，得链替代反应产物；所述ab1-dna1、ab2-dna2、psa、发夹dnah1和发夹dnah2的摩尔比为100:100:100:10^-3:10^-3；

(5)将所述链替代反应产物与发夹dnah3和发夹dnah4混合后37℃反应1h，得杂交链；所述发夹dnah3和发夹dnah4的摩尔比为300:10^-3:10^-3；

(6)将所述杂交链与分子信标mb、mg²⁺混匀后37℃反应1h，荧光检测；

步骤(1)和步骤(2)之间并没有时间先后顺序限制。

优选的，步骤(1)所述反应在pbs缓冲溶液中进行，所述反应的温度为18～25℃。

优选的，步骤(1)所述过滤用滤膜的截留分子量为10000mw。

优选的，步骤(2)所述反应的温度为37℃。

优选的，步骤(3)所述孵育后，还包括利用截留分子量为100000mw的滤膜过滤，保留膜上物质，并利用pbs缓冲液洗涤三次。

优选的，步骤(3)得所述ab1-dna1和ab2-dna2后，还包括紫外吸收检测。

优选的，步骤(6)所述荧光检测为在520nm可见光下检测信号峰。

本发明还提供了所述检测试剂盒或所述检测方法在靶标抗原信号放大中的应用。

本发明提供了一种前列腺特异抗原的检测试剂盒，包括以下组分：psa抗体，琥珀酰亚胺-4-(n-马来酰亚胺)环已烷-1-1羟酸酯，三(2-羧乙基)膦，巯基修饰的dna1，巯基修饰的dna2，发夹dnah1，发夹dnah2，发夹dnah3，发夹dnah4，信标mb和mg²⁺；所述巯基修饰的dna1的核苷酸序列如seqidno.1所示；所述巯基修饰的dna2的核苷酸序列如seqidno.2所示；所述发夹dnah1的核苷酸序列如seqidno.3所示；所述发夹dnah2的核苷酸序列如seqidno.4所示；所述发夹dnah3的核苷6酸序列如seqidno.5所示；所述发夹dnah4的核苷酸序列如seqidno.6所示；所述信标mb包含一个识别离子酶的ra碱基且修饰有fam和bhq基团。

进一步的，利用所述试剂盒进行前列腺特异抗原的检测时，利用两个鼠抗人前列腺特异抗原(psa)的抗体修饰的dna，通过抗原邻位连接形成y型的抗原-抗体-dna杂交链，游离的dna末端可以引发链替代反应，依次打开两个发夹dna，并且杂交上去的第二个发夹dna可以顶下抗原-抗体-dna杂交链，实现靶抗原的循环。链替代反应循环产生大量的互补杂交链再引发由另外两个发夹dna循环杂交组成的杂交链式反应，形成大量的长链dna，长链dna上每相邻的两端序列可以组装形成镁离子dna酶，最终在镁离子存在下该酶可以切割溶液当中的分子信标发出荧光，实现靶标抗原的多重信号放大。利用本发明所述试剂盒和检测方法，可大大提高了检测效率和灵敏度，检测限达到0.73pgml^-1，且对甲胎蛋白(afp)、牛血清白蛋白(bsa)以及癌胚抗原(cea)非靶标检测物无响应。

附图说明

图1为本发明检测方法原理图；

图2为本发明实施例中抗体修饰dna的紫外吸收图；

图3为本发明实施例中荧光检测图；

图4为本发明实施例中对多种蛋白的响应图。

具体实施方式

本发明提供了一种前列腺特异抗原的检测试剂盒，包括以下组分：psa抗体，琥珀酰亚胺-4-(n-马来酰亚胺)环已烷-1-1羟酸酯，三(2-羧乙基)膦，巯基修饰的dna1，巯基修饰的dna2，发夹dnah1，发夹dnah2，发夹dnah3，发夹dnah4，信标mb和mg²⁺；所述巯基修饰的dna1的核苷酸序列如seqidno.1所示；所述巯基修饰的dna2的核苷酸序列如seqidno.2所示；所述发夹dnah1的核苷酸序列如seqidno.3所示；所述发夹dnah2的核苷酸序列如seqidno.4所示；所述发夹dnah3的核苷6酸序列如seqidno.5所示；所述发夹dnah4的核苷酸序列如seqidno.6所示；所述信标mb包含一个识别离子酶的ra碱基且修饰有fam和bhq基团。

在本发明所述检测试剂盒中，所述psa抗体优选为鼠抗人前列腺特异抗原的抗体。本发明所述信标mb中包含ra基团，所述ra是一个镁离子酶核心序列识别并切割的核糖核酸碱基，非脱氧核糖核酸碱基，其核苷酸序列优选如seqidno.7所示。在本发明所述检测试剂盒中，各序列如表1所示：

表1试剂盒中的序列

本发明还提供了一种前列腺特异抗原的检测方法，包括以下步骤：(1)将psa抗体和琥珀酰亚胺-4-(n-马来酰亚胺)环已烷-1-1羟酸酯进行偶联反应2h后，过滤得处理后抗体；所述psa抗体和琥珀酰亚胺-4-(n-马来酰亚胺)环已烷-1-1羟酸酯的摩尔比为1:10～20；

(2)将巯基修饰的dna1和巯基修饰的dna2分别与三(2-羧乙基)膦进行羟基活化反应1h，得处理后dna1和处理后dna2；所述巯基修饰的dna1和巯基修饰的dna2与三(2-羧乙基)膦的摩尔比为1:10⁴；

(3)将所述处理后抗体分别与处理后dna1和处理后dna2在4℃孵育12h，得ab1-dna1和ab2-dna2；所述所述处理后抗体与处理后dna1和处理后dna2的体积比均为1:1；

(4)将所述ab1-dna1、ab2-dna2、psa、发夹dnah1和发夹dnah2混合后37℃反应2h，得链替代反应产物；所述ab1-dna1、ab2-dna2、psa、发夹dnah1和发夹dnah2的摩尔比为100:100:100:10^-3:10^-3；

(5)将所述链替代反应产物与发夹dnah3和发夹dnah4混合后37℃反应1h，得杂交链；所述发夹dnah3和发夹dnah4的摩尔比为300:10^-3:10^-3；

(6)将所述杂交链与分子信标mb、mg²⁺混匀后37℃反应1h，荧光检测；

步骤(1)和步骤(2)之间并没有时间先后顺序限制。

在本发明所述检测方法中，将psa抗体和琥珀酰亚胺-4-(n-马来酰亚胺)环已烷-1-1羟酸酯进行偶联反应2h后，过滤得处理后抗体；所述psa抗体和琥珀酰亚胺-4-(n-马来酰亚胺)环已烷-1-1羟酸酯的摩尔比为1:10～20。本发明所述反应优选在pbs缓冲溶液中进行，所述反应优选在室温下进行，更优选的为18～25℃。本发明在所述反应后过滤，优选为用滤膜(截留分子量10,000mw)纯化，pbs缓冲液洗涤三次。本发明所述偶联反应，琥珀酰亚胺-4-(n-马来酰亚胺)环已烷-1-1羟酸酯(smcc)作为偶联剂，分子一端的nhs酯基团与某一蛋白质分子的伯氨反应形成稳定的酰胺键，另一端(马来酰亚胺基团一端)可与另一蛋白质分子的巯基发生特异性交联，可促进后续多元复合物的形成。

本发明将巯基修饰的dna1和巯基修饰的dna2分别与三(2-羧乙基)膦进行羟基活化反应1h，得处理后dna1和处理后dna2；所述巯基修饰的dna1和巯基修饰的dna2与三(2-羧乙基)膦的摩尔比为1:10⁴。本发明所述反应的温度优选为37℃。在本发明实施例中，分别向200μl巯基修饰的dna1(10μm)和巯基修饰的dna2中加入2μltcep(100mm)，37℃反应1h。

得处理后抗体、处理后dna1和处理后dna2后，本发明将所述处理后抗体分别与处理后dna1和处理后dna2在4℃孵育12h，得ab1-dna1和ab2-dna2；所述所述处理后抗体与处理后dna1和处理后dna2的体积比均为1:1。本发明所述孵育后，优选还包括利用截留分子量为100000mw的滤膜过滤，保留膜上物质，并利用pbs缓冲液洗涤三次。本发明在得到所述ab1-dna1和ab2-dna2后，优选还包括紫外吸收检测，如能检测到dna和抗体蛋白的特征峰，则证明反应良好。

得ab1-dna1和ab2-dna2后，本发明将所述ab1-dna1、ab2-dna2、psa、发夹dnah1和发夹dnah2混合后37℃反应2h，得链替代反应产物；所述ab1-dna1、ab2-dna2、psa、发夹dnah1和发夹dnah2的摩尔比为100:100:100:10^-3:10^-3。在本发明实施例中，ab1-dna1、ab2-dna2、psa各100nm、发夹dna(h1、h2)各1μm，混匀后37℃反应2h。

得链替代反应产物后，本发明将所述链替代反应产物与发夹dnah3和发夹dnah4混合后37℃反应1h，得杂交链；所述发夹dnah3和发夹dnah4的摩尔比为300:10^-3:10^-3。在本发明实施例中，向上述链替代反应产物中加入发夹dna(h3、h4)各1μm，混匀后37℃反应1h。生成的发夹dna(h1、h2、h3、h4)组装的长的杂交链。

得杂交链后，本发明将所述杂交链与分子信标mb、mg²⁺混匀后37℃反应1h，荧光检测。在本发明实施例中，向上述得到的杂交链式反应产物中加入分子信标mb、mg²⁺各100nm，混匀后37℃反应1h。荧光检测可见520nm的信号峰。

在本发明的检测方法中，其检测原理如图1所示，利用修饰了dna的抗体，通过抗原邻位连接形成y型的抗原-抗体-dna杂交链，游离的dna末端可以引发链替代反应，依次打开两个发夹dna，并且杂交上去的第二个发夹dna可以顶下抗原-抗体-dna杂交链，实现靶抗原的循环。链替代反应循环产生大量的互补杂交链再引发由另外两个发夹dna循环杂交组成的杂交链式反应，形成大量的长链dna，长链dna上每相邻的两端序列可以组装形成镁离子dna酶，最终在镁离子存在下该酶可以切割溶液当中的分子信标发出荧光，实现靶标抗原的多重信号放大。

本发明还提供了所述检测试剂盒或所述检测方法在靶标抗原信号放大中的应用。在本发明中，所述靶标抗原信号放大的方法与上述检测方法相同，在此不再赘述。本发明所述应用中，信号放大包括了三级放大，利用两个鼠抗人前列腺特异抗原单克隆抗体修饰dna，与抗原邻位连接形成y型的抗原-抗体-dna杂交链，作为信号转换器将抗原输入转换为dna信号输出；将链替代反应和杂交链式反应联合，实现了信号的两级放大。其中的反应包括：(1)链替代反应：ab1-dna1、ab2-dna2形成的ag-ab-dna杂交链与第一个发夹dna杂交(h1)而打开h1的茎端，暴露出的h1的茎端与第二个发夹dna(h2)杂交，并且杂交上去的h2顶下ag-ab-dna杂交链，目标抗原回到从头循环，实现第一轮信号放大；(2)杂交链式反应：抗原-抗体-dna杂交链引发的链替代反应，产生大量的h1与h2的杂交链，引发由另外两个发夹dna(h3和h4)循环杂交所组成的杂交链式反应，产生大量的长链dna，实现第二轮的信号放大。杂交链式反应完成后形成的长链dna上每相邻的两端序列(h3和h4)组装形成镁离子dna酶，在镁离子存在下该酶切割溶液当中的分子信标，断开的分子信标释放下来并发出荧光，新的分子信标又与镁离子dna酶结合、被切割，循环放大荧光信号，实现第三轮的信号放大。

下面结合实施例对本发明提供的一种前列腺特异抗原的检测试剂盒、检测方法及应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

仪器装置：高速冷冻离心机(16r，珠海黑马医学仪器有限公司)、超纯水机(sybergyuv，默克密理博)、紫外可见分光光度计(cary60，美国安捷伦科技公司)、荧光分光光度计(f-4600，日本日立高新技术公司)、琼脂糖水平电泳槽(dycp-31dn，北京六一)。

所用试剂：psa抗体、smcc(琥珀酰亚胺-4-(n-马来酰亚胺)环已烷-1-1羟酸酯)、tcep(三(2-羧乙基)膦)、巯基修饰的dna1、巯基修饰的dna2、mb(dna由宝生物合成，mb包含一个可以被离子酶识别的ra碱基且修饰有fam、bhq基团)。

1、抗体修饰dna

抗体与smcc(适宜摩尔比1：10～20)在pbs缓冲液中室温反应2h后，用滤膜(截留分子量10,000mw)纯化，pbs缓冲液洗涤三次；分别向200μl巯基修饰的dna1(10μm)和巯基修饰的dna2(10μm)中加入2μltcep(100mm)，37℃反应1h；取上述处理后的抗体、dna各200μl混匀，4℃孵育12小时。未反应的dna通过滤膜(截留分子量100,000mw)除去，pbs缓冲液洗涤三次。得到ab1-dna1、ab2-dna2。紫外吸收检测，可见dna和抗体蛋白的特征峰(图2)。

2、顺序自组装镁离子dna酶和检测荧光信号

ab1-dna1、ab2-dna2、psa各100nm、发夹dna(h1、h2)各1μm，混匀后37℃反应2h。向上述链替代反应产物中加入发夹dna(h3、h4)各1μm，混匀后37℃反应1h。生成的发夹dna(h1、h2、h3、h4)组装的长的杂交链。杂交链式反应产物中加入分子信标mb、mg²⁺各100nm，混匀后37℃反应1h。荧光检测可见520nm的信号峰，检测限达到0.73pgml^-1(图3)。且对甲胎蛋白(afp)、牛血清白蛋白(bsa)以及癌胚抗原(cea)非靶标检测物无响应(图4)。

本发明提供了一种前列腺特异抗原的检测试剂盒、检测方法及应用，利用二抗修饰dna，与抗原邻位连接形成y型的抗原-抗体-dna杂交链，作为信号转换器将抗原输入转换为dna信号输出；同时将链替代反应和杂交链式反应联合，实现了信号的两级放大；长链dna上每相邻的两端序列(发夹dnah3和发夹dnah4)组装形成镁离子dna酶，在镁离子存在下该酶切割溶液当中的分子信标，断开的分子信标释放下来并发出荧光，新的分子信标又与镁离子dna酶结合、被切割，循环放大荧光信号，实现第三轮的信号放大，大大提高了检测效率和灵敏度，使检测限达到0.73pgml^-1。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>临沂大学

<120>一种前列腺特异抗原的检测试剂盒、检测方法及应用

<160>7

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>38

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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<212>dna

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

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