熊胆汁冻干品中牛磺熊去氧胆酸及其盐的检测方法与流程

本发明涉及中药成分检测领域，尤其涉及一种牛磺熊去氧胆酸的检测方法。

背景技术：

熊胆汁是一种珍贵的药材，其作用主要是清毒保肝，利胆溶石，抗动脉硬化，抗脂肪肝等。牛磺熊去氧胆酸(及其盐)是熊胆区别于其他胆的特征成分。对熊胆汁中该物质的含量进行准确测定，有利于药品质量的控制。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种熊胆汁冻干品中牛磺熊去氧胆酸(及其盐)的含量，技术方案包括：

一种熊胆汁冻干品液相色谱用供试品溶液的制备方法，它是将熊胆汁冻干粉溶于甲醇中，配制成5～10mg/ml的溶液，再去除不溶物，即得。

如前述的供试品溶液的制备方法，所述熊胆汁冻干粉的浓度是5mg/ml。

如前述的供试品溶液的制备方法，所述去除不溶物的方法是过滤。

如前述的供试品溶液的制备方法，所述去除不溶物的方法是用0.45μm的微孔滤膜过滤。

如前述的供试品溶液的制备方法，所述溶解方式是：超声处理10min。

一种熊胆汁冻干品中牛磺熊去氧胆酸及其盐的检测方法，它是使用前述供试品溶液，按照如下参数进行hplc检测：

色谱柱：c18色谱柱；

流动相a：磷酸二氢钠4.68重量份、庚烷磺酸钠2.0重量份溶于400体积份水中，再加入600体积份甲醇，摇匀，即得；当1重量份为1g时，1体积份为1ml；

流动相b：甲醇；

检测波长：210nm。

如前述的熊胆汁冻干品中牛磺熊去氧胆酸及其盐的检测方法，所使用的色谱柱是welchxb-c18(250mmx4.6mm，5μm)。

如前述的熊胆汁冻干品中牛磺熊去氧胆酸及其盐的检测方法，所述柱温是25或35℃，优选为25℃。

如前述的熊胆汁冻干品中牛磺熊去氧胆酸及其盐的检测方法，该方法的进样量是10微升。

如前述的熊胆汁冻干品中牛磺熊去氧胆酸及其盐的检测方法，流动相比例为：0-10min，3％-6％b；10-23min，6％-10％b；

和/或，流速为1ml/min。

本发明具有如下有益效果：

1)色谱分离度高。其检测牛磺熊去氧胆酸的理论塔板数可达6000，分离度约3.5。

2)牛磺熊去氧胆酸(5.24μg～33.46μg范围内)与峰面积积分值的线性相关性强，其线性回归方程的r²＝1.000。

3)精密度良好。同一供试品溶液连续6次进样检测牛磺熊去氧胆酸峰面积，其rsd(相对标准偏差)值低至1.07％。

4)重复性高。6份同一批的熊胆汁冻干粉的所对应牛磺熊去氧胆酸峰面积的rsd为2.78％。

5)稳定性好。同一供试品溶液在24h内检测牛磺熊去氧胆酸百分含量的rsd值为1.46％。

6)准确度高。经检测，6份已知牛磺熊去氧胆酸含量的冻干品的平均回收率为98.05％，rsd为2.39％。

7)牛磺熊去氧胆酸特征峰的专属性高。在与对照品色谱峰相应的位置上，熊胆汁(冻干粉)供试品溶液具有相同保留时间的色谱峰，证明熊胆汁(冻干粉)的专属性良好。

8)牛磺熊去氧胆酸特征峰纯度高。本发明对应特征峰内牛磺熊去氧胆酸纯度达到0.9990。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过具体实施方式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1熊胆汁(冻干粉)提取方法1对应的hplc图

图2熊胆汁(冻干粉)提取方法2对应的hplc图

图3熊胆汁(冻干粉)提取方法3对应的hplc图

图4熊胆汁(冻干粉)提取时间5min对应的hplc图

图5熊胆汁(冻干粉)提取时间10min对应的hplc图

图6熊胆汁(冻干粉)提取时间15min对应的hplc图

图7熊胆汁(冻干粉)提取时间20min对应的hplc图

图8熊胆汁(冻干粉)提取溶媒甲醇对应的hplc图

图9熊胆汁(冻干粉)提取溶媒乙醇对应的hplc图

图10熊胆汁(冻干粉)提取溶媒无水乙醇对应的hplc图

图11熊胆汁(冻干粉)提取溶媒用量5ml对应的hplc图

图12熊胆汁(冻干粉)提取溶媒用量10ml对应的hplc图

图13熊胆汁(冻干粉)提取溶媒用量25ml对应的hplc图

图14熊胆汁(冻干粉)提取溶媒用量50ml对应的hplc图

图15熊胆汁(冻干粉)hplc检测采用eclipsexdb-c18(5μm，4.6mm×150mm)色谱柱对应的hplc图

图16熊胆汁(冻干粉)hplc检测采用geminic18110acolumn(5μm，250×4.6mm)色谱柱对应的hplc图

图17熊胆汁(冻干粉)hplc检测采用welchxb-c18(250mm×4.6mm，5m)色谱柱对应的hplc图

图18熊胆汁(冻干粉)hplc法流动相考察-流动相1对应的hplc图

图19熊胆汁(冻干粉)hplc法流动相考察-流动相2对应的hplc图

图20熊胆汁(冻干粉)hplc法流动相考察-流动相3对应的hplc图

图21熊胆汁(冻干粉)hplc法柱温考察-25℃对应的hplc图

图22熊胆汁(冻干粉)hplc法柱温考察-30℃对应的hplc图

图23熊胆汁(冻干粉)hplc法柱温考察-35℃对应的hplc图

图24吸收波长-190nm对应的hplc图

图25吸收波长-205nm对应的hplc图

图26吸收波长-210nm对应的hplc图

图27吸收波长-230nm对应的hplc图

图28吸收波长-280nm对应的hplc图

图29吸收波长-300nm对应的hplc图

图30线性关系试验考察结果

图31牛磺熊去氧胆酸对照品hplc图谱

图32熊胆汁(冻干粉)hplc图谱

图33熊胆汁(冻干粉)峰纯度检验图

图34牛磺熊去氧胆酸对照品峰纯度检验图

具体实施方式

实施例1供试品溶液的制备方法

精密称定熊胆汁(冻干粉)的粉末(过四号筛)50mg，置10ml容量瓶中，精密加入甲醇7ml，超声10min使溶解，取出，放冷，加入甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

实施例2检测前述供试品溶液中牛磺熊去氧胆酸的条件

使用hplc进行检测，其参数如下：

进样量：10μl。

流动相a的制备：称取磷酸二氢钠4.68g和庚烷磺酸钠2.0g溶于400ml水中，再加入600ml甲醇，摇匀。

流动相b：甲醇。

流动相比例与流速：0-10min，3％-6％b；10-23min，6％-10％b。流速为1ml/min。

检测波长：210nm。

柱温：25或35℃。

以下用实验例的形式对本发明做进一步说明。

实验例1供试品溶液的制备方法

1.提取方法

方法1：取熊胆汁(冻干粉)粉末50mg，精密称定，置于10ml容量瓶中，加入甲醇7ml，超声10min使溶解，取出，放冷，加入甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

方法2：取熊胆汁(冻干粉)粉末50mg，精密称定，置于50ml锥形瓶中，精密加入10ml甲醇，静置1小时，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

方法3：取熊胆汁(冻干粉)粉末50mg，精密称定，置于50ml锥形瓶中，精密加入10ml甲醇，用恒温振荡器振摇30min，取出，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

分别精密吸取3种方法的供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，使用《云南食品药品监督管理局标准》2014年版熊胆粉(冻干)的含量测定方法，检测牛磺熊去氧胆酸的含量，结果见表1，图1-图3。

表1提取方法考察测定结果

从表1可见，用方法1提取的熊胆汁(冻干粉)的有效成分的含量高于方法2和3，认为方法1提取更好。

2.提取时间

采用方法1制备供试品，考察超声时间的影响。分别选取5min、10min、15min、20min提取时间，分别精密吸取4种超声时间的供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，计算牛磺熊去氧胆酸含量的含量，结果见表2，图4-图7。

表2提取时间考察测定结果

从表2可见，超声10min的供试品含量测定的结果高于5min、15min、20min的含量测定结果，可得出结论方法1规定的超声10min有利于有效成分的溶出。

3.提取溶媒

采用方法1制备供试品，分别选取甲醇、乙醇、无水乙醇为提取溶媒，分别精密吸取3种不同溶媒的供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，计算牛磺熊去氧胆酸含量的含量。结果见表3，图8-图10。

表3提取溶媒考察测定结果

从表3可见，用甲醇作为溶媒提取熊胆汁(冻干粉)，更有利于牛磺熊去氧胆酸的溶出。

4.提取溶媒用量

采用方法1制备供试品，考察提取溶媒用量考察的影响。分别选取5ml、10ml、25ml、50ml的甲醇用量。分别精密吸取4种不同溶媒用量的供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，计算牛磺熊去氧胆酸的含量。结果见表4，图11-图14。

表4提取溶媒用量的考察含量测定结果

从表4可见，用10ml的甲醇更有利于熊胆汁(冻干粉)的有效成分的溶出，制备的供试品溶液含量最高，认为提取溶媒的最佳用量为10ml。

5.供试品溶液的制备方法的确定

熊胆汁(冻干粉)的供试品溶液的制备方法：精密称定熊胆汁(冻干粉)的粉末(过四号筛)50mg，置10ml容量瓶中，精密加入甲醇7ml，超声10min使溶解，取出，放冷，加入甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

本实验例中，检验牛磺熊去氧胆酸的色谱条件参照《云南食品药品监督管理局标准》，具体如下：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以溶液(称取磷酸二氢钠4.68g和庚烷磺酸钠2.0g溶于400ml水中，再加入600ml甲醇，摇匀即可)为流动相a，甲醇为流动相b；检测波长为205nm。理论板数以牛磺熊去氧胆酸计算应不低于3500。流动相a和b的比例变化如下：

并使用25℃柱温和10微升进样量。

实验例2色谱条件对比

采用实施例1的方法制备得到供试品溶液，进行色谱条件的对比。

初始色谱条件同实验例1。以下将在前述初始色谱条件的基础上进行优化。

1.色谱柱选择

高效液相色谱法中色谱柱的选择对其影响较大，不同厂家、填充材料、尺寸规格、ph适用范围的色谱柱，对色谱峰的影响是不同。按照初始色谱条件。分别选用geminic18110acolumn(5μm，250×4.6mm)、eclipsexdb-c18(5μm，4.6mm×150mm)、welchxb-c18(250mm×4.6mm，5mm)3种不同的色谱柱。

由图15-图17可知，welchxb-c18(250mm×4.6mm，5mm)色谱柱的分离效果最好。后续实验使用welchxb-c18(250mm×4.6mm，5mm)色谱柱。

2.流动相

流动相1：以溶液(称取磷酸二氢钠4.68g和庚烷磺酸钠2.0g溶于400ml水中，再加入600ml甲醇，摇匀即可)为流动相a，甲醇为流动性b，检测波长为210nm。0-10min，3％-6％b，10-23min，6％-10％b。流速为1ml/min，柱温为25℃，进样量为10μl。

流动相2：甲醇-磷酸二氢钠溶液(0.03mol/l)(65∶30)为流动相，并用磷酸调节ph值为4.4，检测波长为210nm。

流动相3：流动相a(磷酸缓冲盐：用0.02mol/l磷酸二氢钠，再加磷酸调ph值为3.0)；流动相b(乙腈)。0-15min，20％-40％b，15-30min，40％-20％b。流速1ml/min，检测波长205nm，柱温30℃，进样量10μl。

分别用以上方法配制的流动相，其它条件不变，hplc检测供试品溶液，观察色谱图峰的分离效果，优化最佳流动相。

从图18-图20可见，流动相2的色谱图分离效果不是很好，流动相1和3分离效果较好，但对比流动相1和3的峰型，基线等，流动相1具有更好的峰形和更平稳的基线，为最佳流动相。后面的实验均使用流动相1来进行色谱检测。

3.柱温

分别在柱温为25℃、30℃、35℃下，按照上述最佳色谱条件要求，观察色谱图的分离情况，结果见图21-23。

从图21-23可见，在25℃和35℃柱温下，熊胆汁(冻干粉)供试品hplc色谱图分离度优于30℃柱温情况下的色谱图，在柱温25℃和35℃之间来讲，25℃应用于分析更广泛。后面的实验均使用25℃作为其hplc条件的柱温。

4.最大吸收波长

分别在吸收波长为190nm、205nm、210nm、230nm、280nm、300nm等6个波长下用pda检测器，记录整个光谱图，观察色谱图，优化最佳吸收波长。

结果见图24～29。牛磺熊去氧胆酸钠对照品和熊胆汁(冻干粉)供试品，在210nm吸收波长下杂峰较少，基线较平稳，峰纯度较高，分离度较高，所以最终将吸收波长确定为210nm。

5.理论塔板数和分离度

以上述色谱条件，对熊胆汁(冻干粉)供试品溶液进行试验，平行试验5次，结果见表5。

表5理论塔板数和分离度

从表5可见，平均理论塔板数为5926，《云南省食品药品监督管理局标准》(2014年版)规定的3500；平均分离度为3.50，符合含量测定的要求。

6.色谱条件与系统试用试验的确定

根据以上结果，最终将色谱条件与系统试用试验的确定为以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，使用welchxb-c18(250mm×4.6mm，5mm)色谱柱；以溶液(称取磷酸二氢钠4.68g和庚烷磺酸钠2.0g溶于400m1水中，再加入600ml甲醇，摇匀即可)为流动相a，甲醇为流动性b；检测波长为210nm。理论板数以牛磺熊去氧胆酸计算应不低于4000。

实验例3方法学考察

本实验例中所使用的供试品溶液制备方法同实施例1，所使用的色谱条件同实施例2。

1.线性关系考察

精密称取牛磺熊去氧胆酸对照品(纯度＝93.4％)适量，置10m1量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制成对照品溶液。精密吸取溶液5、10、15、20、25、30μl注入液相色谱仪，按拟定的色谱条件测定峰面积分别为655394，1230576，1810312，2385647，2970687及3561155。以峰面积积分值为纵坐标，以牛磺熊去氧胆酸进样量为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程：y＝110733.8206x+69847.8667，r²＝1.000，牛磺熊去氧胆酸在5.24μg～33.46μg范围内呈良好线性关系，结果见表6和图30。

表6线性范围考察结果

2.精密度试验

精密吸取对照品溶液10μl，按上述色谱条件，连续进样6次，分别测定峰面积，计算rsd(相对标准偏差)值。

如表7所示，rsd值只有1.07％，表明本发明方法的精密程度很高。

表7精密度试验结果

3.重复性试验

取同一批熊胆汁(冻干粉)6份，按供试品溶液制备方法制备，精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱峰面积，计算百分含量，计算rsd值。结果见表8。

表8重复性实验结果

由表8可见，同一批熊胆汁(冻干粉)平行操作6份，牛磺熊去氧胆酸的rsd值为2.78％，表明本方法重复性良好。

4.稳定性试验

取同一份熊胆汁(冻干粉)供试品溶液，按上述色谱条件，分别在不同时间(0、4、8、12、16、20、24h)精密吸取供试品溶10μ1，注入液相色谱仪，记录色谱峰面积。计算百分含量，计算rsd值，结果见表9。

表9稳定性试验结果

由表9可见，取同一份熊胆汁(冻干粉)供试品溶液不同时间进样分析，牛磺熊去氧胆酸百分含量的rsd值为1.46％，表明样品在24h内稳定。

5.加样回收率试验

取已知含量的供试品6份，每份取样约25mg，精密称定，分别加入已配制好的5.343mg/ml牛磺熊去氧胆酸对照品溶液1ml，按“供试品溶制备”项下的方法制成供试品溶液，精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，计算回收率。结果见表10。

表10加样回收率试验结果

由表10可见，6份样品加样回收率在95.54％～102.01％，平均回收率为98.05％，rsd为2.39％，说明准确度良好。

6.专属性考察

按上述色谱条件，分别精密吸取熊胆汁(冻干粉)供试品溶液、牛磺熊去氧胆酸对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪中，记录液相色谱图。由色谱图可知，在与对照品色谱峰相应的位置上，熊胆汁(冻干粉)供试品溶液具有相同保留时间的色谱峰，证明熊胆汁(冻干粉)的专属性良好。实验结果见图31～图32。

7.纯度检验

用dad全波长扫描，峰纯度检验，看主峰三点(最高点、半峰高点)的紫外吸收图重合情况，判断峰是否是一个化合物。

如图33和34所示，看主峰三点(最高点、半峰高点)，熊胆汁(冻干粉)、牛磺熊去氧胆酸对照品3点纯度指数检验图得出，样品及对照品对应峰的纯度均到达0.999。

实验例3熊胆汁(冻干粉)中试样品含量测定

按照实施例1的方法进行供试品制备，按照实施例2的方法进行色谱，进行3批熊胆汁(冻干粉)中试样品(四川利民中药饮片有限责任公司提供)含量测定。结果见表11。

表11熊胆汁(冻干粉)中试样品含量测定结果

从表11可知，3批熊胆汁(冻干粉)中试样品，本品含牛磺熊去氧胆酸为34.73％～37.63％，，平均值为35.93％。

综上，本发明可以有效检测熊胆汁中牛磺熊去氧胆酸的含量，体现在：该方法得到的峰面积积分值与牛磺熊去氧胆酸线性相关性强，检测的精密度高、重复性好、稳定性高、准确性好，色谱峰保留时间的专属性好。

本发明还适用于牛磺熊去氧胆酸盐(如牛磺熊去氧胆酸钠)的检测。