一种检测人脂蛋白磷脂酶A2底物及其试剂盒的制作方法

一种检测人脂蛋白磷脂酶a2底物及其试剂盒
技术领域
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本发明属于生物医药技术领域，具体地说涉及一种检测人脂蛋白磷脂酶a2底物及其试剂盒。


背景技术：

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脂蛋白相关磷脂酶a2 （lipoprorein-assoeiated phosphohpasea2，lp-pla2）又称血小板活化因子乙酞水解酶（paf-ah），是一种炎性细胞分泌的能促使氧化磷脂水解的磷脂酶，是磷脂酶a2（pla2）超家族中的一员，相对分子质量为45.4kd（441个氨基酸）。lp-pla2的基本功能是催化多种氧化磷脂sn-2位上酰键水解，产生游离脂肪酸和溶血磷脂。此外，lp-pla2还能水解血小板活化因子等致炎因子。lp-pla2是磷脂酶超家族中的亚型之一，也被称为是血小板活化因子乙酰水解酶，由血管内膜中的巨噬细胞、t细胞和肥大细胞分泌。动脉粥样硬化斑块中lp-pla2表达上调，并且在易损斑块纤维帽的巨噬细胞中强表达。lp-pla2可水解氧化低密度脂蛋白ox-ldl中的氧化磷脂，生成脂类促炎物质，如溶血卵磷脂和氧化游离脂肪酸，进而产生多种致动脉粥样硬化作用，包括内皮细胞死亡和内皮功能异常，刺激粘附因子和细胞因子的产生。这些物质可通过趋化炎症细胞进一步产生自我强化的循环，生成更多促炎物质。lp-pla2的检测有活性法和浓度法两种。活性法主要采用高效液相色谱法、放射活度测定法和酶水解底物法等。高效液相色谱法灵敏度低，易受到血液中各种成分的干扰。放射活度测定法存在试剂的放射性污染、准确度低、重复性差等问题；酶水解底物法常用的底物以1-癸酞基-2-(4-硝基苯戊二酰基)磷脂酰胆碱、1-豆蔻酰基-2-(4-对硝基苯酚丁二酸酐)磷脂酰胆碱、1-癸酰基-2-(4-硝基苯戊二酰基)磷脂酰胆碱，主要反应都是被脂蛋白相关磷脂酶a2蛋白水解sn-2 位产生4-硝基苯戊二酞，4-对硝基苯酚丁二酸酐，由于水解产物不稳定进一步分解，产生4-硝基苯酚或对硝基苯酚,导至溶液中4-硝基苯酚或对硝基苯酚对应波长吸光度发生变化，目前上述三种底物都存稳定性较差的问题，自然分解较快，底物必须独立的缓冲液体系统保存到用前进行现稀释现用，否则底物由于自然氧化分解导至本底较高，从而降低检测效率。


技术实现要素：

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本发明目的在于提供一种人脂蛋白相关磷脂酶a2蛋白的反应底物。
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本发明另一个目的提供一种检测人脂蛋白相关磷脂酶a2蛋白的生化试剂盒。
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为了实现上述目的本发明提供了一种用于人脂蛋白相关磷脂酶a2蛋白的反应底物，本发明制备了一种底物，将合成的底物1-十二酰基-2（4-硝基苯戊二酰基）磷脂酰胆碱，溶解于te缓冲液，并加入含硅油的甘油作为稳定剂。为了进一步提高底物稳定性，本发明经过测试采用三氟丙基甲基硅油。经过测试，本配方底物经过55℃加速破坏稳定性7天，后测试4-硝基苯酚浓度无上升。而加入人脂蛋白相关磷脂酶a2蛋白后测试4-硝基苯酚浓度反应曲线效能无下降，实现了人脂蛋白相关磷脂酶a2蛋白的反应底物稳定性提升。
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本发明为了更好实施上述方法，公开了一种检测人脂蛋白相关磷脂酶a2蛋白的生
化试剂盒，该试剂盒包括：稀释缓冲液r1和为人脂蛋白相关磷脂酶a2蛋白的反应底物r2。使用前述发明中底物作为底物，稀释缓冲液采用ph7.4 磷酸盐缓冲液并加入0.05%吐温-20。对于前述试剂盒进一步优化增加校准品与质控品，校准品与质控品的主要成份为人脂蛋白相关磷脂酶a2蛋白溶液或含人脂蛋白相关磷脂酶a2蛋白的血清。
附图说明
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附图1.合成产物测定。
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附图2.不同浓度样本od405变化曲线图 。
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附图3.40次空白试剂检测浓度。
具体实施方式
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下列实施例是为了更详细的解释本发明，但不应理解释为本发明局限于此。
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实施例1：合成1-十二酰基-2（4-硝基苯戊二酰基）-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱原料为月桂酰胺、甘油磷脂酰胆碱、3-(4-硝基苯基)戊二酸，方法如下：1.将月桂酰胺加入到甘油磷脂酰胆碱中sn-3位；2.三氯甲烷萃取产物1-十二酰基-2氢-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱；3.将3-(4-硝基苯基)戊二酸加入到前述中产物1-十二酰基-2氢-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱中sn-2；4.三氯甲烷萃取产物，硅胶柱纯化。
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结果分析，使用浓度为3mmol/l人脂蛋白相关磷脂酶a2蛋白血清样本，加入前述合成产物1-十二酰基-2（4-硝基苯戊二酰基）-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱反应使用分光光度计测定产物od405变化，经过测试，加入1-十二酰基-2（4-硝基苯戊二酰基）-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱后od405连续变化结果见附图1.合成产物测定，结果证明底物能很好的被人脂蛋白相关磷脂酶a2蛋白识别并催化水解。将3mmol/l血清样本使用ph7.0~ph8.0磷酸盐缓冲液进行稀释后到2mmol/l、1mmol/l、0.5mmol/l、0mmol/l，使用分光光度计测定其od变化速率，结果见附图2.不同浓度样本od405变化曲线图，反应速率同样本浓度正相关性，证明该底物反应速率能反映样本中酶的活性与数量，可作为底物用于测量样本中人脂蛋白相关磷脂酶a2蛋白浓度。
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实施例2：人脂蛋白相关磷脂酶a2蛋白的反应底物缓冲液配制。
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原料：1-十二酰基-2（4-硝基苯戊二酰基）-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱、ph7.5~8.5 te（tris-edta）缓冲液,甘油、三氟丙基甲基聚硅氧烷、聚二甲基硅氧烷、二甲基亚砜。
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配制方法：将1-十二酰基-2（4-硝基苯戊二酰基）-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱溶于ph7.5~8.5 te缓冲液中获得组分1；将甘油按体积5%比例溶于二甲基亚砜获得混合溶剂1；将甘油按体积10%比例溶于二甲基亚砜获得混合溶剂2；取三氟丙基甲基聚硅氧烷按质量比1%溶于前述混合溶剂1中，使用超声波乳化分散，获得组分2；取聚二甲基硅氧烷按质量比1%溶于前述混合溶剂1中，使用超声波乳化分散，获得组分
3；取三氟丙基甲基聚硅氧烷按质量比5%溶于前述混合溶剂2中，使用超声波乳化分散，获得组分4；取聚二甲基硅氧烷按质量比5%溶于前述混合溶剂2中，使用超声波乳化分散，获得组分5；分别取组分1与组分2，按体积比1:1混合获得反应底物1；分别取组分1与组分3，按体积比99:1混合获得反应底物2；分别取组分1与组分4，按体积比1:1混合获得反应底物3；分别取组分1与组分5，按体积比99:1混合获得反应底物4；测试：分别取前述反应底物1~4，分别分装两份，取一份放入55℃高温加速破坏性，另一份置于2~8℃冰箱中存放，一周后取出，使用分光光度计测试两种保存条件下的底物od405，结果见表1.反应底物测定，加速破坏性实验对比，即前述配方能稳定保存1年以上分解率不超过2%，使用浓度为3mmol/l人脂蛋白相关磷脂酶a2蛋白血清样本，加入前述反应底物1~4，反应后使用分光光度计测定产物od405变化，经过测试，加入od405连续变化结果见表1.反应底物测定。结果显示，经过4种反应底物都具有良好的反应性，经过加速破坏性实验依然能保证98%以上效价。
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表1.反应底物测定。
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实施例3：人脂蛋白相关磷脂酶a2蛋白检测试剂盒试剂盒含有组分r1、r2。r1为样本稀释液，常用的缓冲液均可达到稀释目的，为了更好的实施本实验发明，本发明具体的使用ph6.0~ph8.0的磷酸盐缓冲液，加入0.01%~0.1%吐温20。r2为反应底物，使用r1、r2在生化仪或是其它具有405nm波长的检测的能力的仪器，例如：分光光度计、含405波长特定蛋白分析仪、含405波长的酶标仪，均可完成以对反应底物od405吸光度的测定来获得底物分解速率，从而获得样本中人脂蛋白相关磷脂酶a2蛋白的活性与浓度。为了更好的实施发明，试剂盒中可选配质控品与校准品，为机器提供校准与质控。使用beckmancoulter au5400机型测试，使用本发明试剂采用od405吸光度变化速率法进行检测，结果显示本试剂盒，在机30天试剂空白变化< 2%,检测线性范围5~3000iu/l，检
出限，0.5iu/l。
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以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明。
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本说明书中所用的术语“样本稀释液”指在包括是本领域技术人员公知的，并且被包括在现有技术中。