β2受体激动剂在线固相萃取-高效液相色谱联用检测方法与流程

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种β2受体激动剂的在线固相萃取-高效液相色谱联用检测方法。

背景技术：

β2受体激动剂，也称瘦肉精，是一系列能够促进瘦肉生长、抑制肥肉生长的药物，有不法养殖户将其作为添加剂添加到动物饲料和动物饮水中，以提高动物的瘦肉率，而人在食用含有此类物质的肉类后，极有可能产生不同程度的中毒现象甚至危害人的生命，因此我国早已明文将其列入畜牧养殖的禁用药物。然而，近年来为了获取经济利益，畜牧饲料非法添加β2受体激动剂的事件不时发生，不仅给社会稳定和人民身体健康带来严重威胁，还对我国相关产业的信誉和发展造成了不利的影响。因此，开发一种简单、可靠且灵敏的β2受体激动剂检测方法迫在眉睫。

目前，β2受体激动剂常见的检测方法主要有胶体金免疫层析法、高效液相色谱法、色谱-质谱串联法。胶体金免疫层析法广泛应用于现场检测，但是该方法检测灵敏度低，受样品基质和背景干扰影响较大，易产生假阳性结果，同时在单次检测过程中难以实现多种β2受体激动剂的同时检测。由于动物肉样的成分复杂、存在许多干扰物质，因此对于高效液相色谱法和色谱-质谱串联法而言，检测前的样品前处理就显得非常必要。作为样品前处理方法的核心，开发相适应的萃取富集介质将很有必要。

本发明针对肉类样品的特点和分析对象β2受体激动剂的化学结构特点，采用共价有机聚合物作为基质材料，合成了一种磺酸根功能化共价有机聚合物用于实现复杂实际样品中微量β2受体激动剂的高效净化、萃取与富集。根据分析对象β2受体激动剂的性质，磺酸根功能化共价有机聚合物可通过共价有机聚合物基质所具备的疏水相互作用和磺酸根所引入的离子交换作用，实现分析对象的选择性高效萃取；同时，通过磺酸根的功能化很好地解决了样品基质中大量的蛋白质、脂类等杂质对分析检测的干扰，提高了固相萃取柱的使用寿命和检测方法的灵敏度。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种β2受体激动剂的在线固相萃取-高效液相色谱联用检测方法。本发明是以磺酸根功能化共价有机聚合物（coptpba-bpda@sa）作为固相萃取柱的萃取富集材料，构建在线固相萃取-高效液相色谱联用系统，发展一种β2受体激动剂的检测方法。得益于磺酸根功能化共价有机聚合物与β2受体激动剂之间的离子交换作用与疏水相互作用，实现分析对象β2受体激动剂的选择性萃取富集；并利用磺酸基团减少实际样品中大量杂质对分析检测的干扰；实现实际样品中微量β2受体激动剂的同步进样、净化、萃取、富集与检测。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种β2受体激动剂的在线固相萃取-高效液相色谱联用检测方法，其是以磺酸根功能化共价有机聚合物（coptpba-bpda@sa）作为固相萃取柱的填料，构建在线固相萃取-高效液相色谱联用系统。所述的检测方法，包括以下步骤：

（1）以磺酸根功能化共价有机聚合物（coptpba-bpda@sa）为填料的固相萃取柱的制备：

1）基质共价有机聚合物（coptpba-bpda）的制备：称取摩尔比为2:3的1,3,5-三(4-氨苯基)苯和4,4-联苯二甲醛置于烧瓶中，添加乙醇作为反应溶剂，超声使其均匀分散；然后加入乙酸作为催化剂，常温下搅拌反应几分钟后，得到均匀的黄色悬浊液；过滤，乙醇清洗两次，真空干燥，得到黄色的coptpba-bpda。

其中，所述的催化剂乙酸浓度为3mol/l，反应溶液总体积为22ml，其中所述溶液乙醇与催化剂乙酸的体积比为10:1。

2）磺酸根功能化共价有机聚合物（coptpba-bpda@sa）的制备：将在前一步合成的coptpba-bpda和对氨基苯磺酸置于烧瓶中，加入体积比为3:7的均三甲苯和二氧六环混合物作为反应溶剂，在常温下搅拌几分钟得到悬浊液；然后加入乙酸作为催化剂，油浴锅中加热反应数小时得到红棕色悬浊液；过滤，依次使用n,n-二甲基甲酰胺（dmf）、乙醇和超纯水进行清洗，真空干燥，得到砖红色的coptpba-bpda@sa固体。

其中，所述的催化剂乙酸浓度为3mol/l，反应溶液总体积为22ml，其中所述反应溶剂（均三甲苯和二氧六环混合物）与催化剂乙酸的体积比为10:1。

3）固相萃取柱的装填：先将长度为33毫米，内径为2.1毫米的不锈钢空柱管洗净烘干，在柱管出口端装上滤帽，装好两端柱头；将50mg的coptpba-bpda@sa制成匀浆液，借助泵的辅助将匀浆液通入空柱管中，以此将coptpba-bpda@sa填入柱内。之后采用乙腈作为流动相，在液相色谱泵上冲洗固相萃取柱，得到coptpba-bpda@sa固相萃取柱。

（2）在线固相萃取-高效液相色谱联用检测方法：

采用本课题组发明的“六通阀+十通阀”的在线联用模式（在线固相萃取-高效液相色谱联用系统，专利号：zl201820762345.4），将coptpba-bpda@sa固相萃取柱作为固相萃取介质，构建在线固相萃取-高效液相色谱联用系统，所述的联用系统由六通阀v1、十通阀v2、以磺酸根功能化共价有机聚合物为萃取富集介质的固相萃取柱、液相色谱输液泵a、液相色谱输液泵b、定量环a、定量环b、液相色谱分析柱以及检测器构成。联用系统的运行包括以下操作步骤：

1）平衡：六通阀v1和十通阀v2都处于load位置；载样液通过泵a平衡以磺酸根功能化共价有机聚合物为萃取富集介质的固相萃取柱，其流速为0.1ml/min；流动相通过泵b直接经分析柱以获得色谱分离需要的稳定基线，流速为0.8ml/min；同时，通过进样针将样品溶液注满定量环a；

2）在线萃取富集：当六通阀v1调至inject位置，在线固相萃取开始，定量环a中的样品溶液经由载样液带入以磺酸根功能化共价有机聚合物为萃取富集介质的固相萃取柱，经过5-7分钟，六通阀v1调回load位置；

3）在线洗脱：将泵a的输送液由载样液换成洗脱液，利用洗脱液将以磺酸根功能化共价有机聚合物为萃取富集介质的固相萃取柱上萃取富集的分析对象洗脱下来；洗脱流速设为0.1ml/min，在与十通阀v2连接的定量环b内收集洗脱液；

4）检测：洗脱液收集完成，十通阀v2调节至inject位置，将洗脱下来的分析对象输送至液相色谱分析柱进行分离，再利用二极管阵列检测器进行检测，此时用于输送流动相的泵b的流速设置为0.8ml/min。

其中，所述的载样液组成为：按体积分数比计，乙腈/0.2%甲酸溶液=20%/80%；所述的洗脱液组成为：按体积分数比计，乙腈/0.15%甲酸-三乙胺溶液(ph=9.8)=25%/75%；所述的流动相组成为：按体积分数比计，乙腈/0.1%甲酸-三乙胺溶液(ph=4.0)=25%/75%；所述的液相色谱分析柱为c18色谱柱；柱温箱温度为40℃；检测波长为213nm。

本发明的显著优点在于：

（1）以磺酸根功能化共价有机聚合物（coptpba-bpda@sa）作为固相萃取柱的填料，实现了离子交换作用与疏水相互作用的双重萃取模式，相较于传统的单一模式固相萃取材料，coptpba-bpda@sa提高了固相萃取柱的选择性和富集能力；

（2）利用coptpba-bpda@sa的磺酸基团减少实际样品中大量的蛋白质、脂类等杂质对分析检测的干扰，提高了固相萃取柱的使用寿命和检测方法的稳定性与重现性；

（3）实现了实际样品中微量β2受体激动剂的同步进样、净化、萃取、富集与检测，简化了操作流程，减少了溶剂消耗，环境友好。

附图说明

图1以coptpba-bpda@sa作为固相萃取介质，构建在线固相萃取-高效液相色谱联用分析系统对实际空白猪肉样品(a)和加标0.6mg/kg三种β2-受体激动剂（即克伦特罗、莱克多巴胺、班布特罗）的实际猪肉样品的检测色谱图(b)。

图2是以coptpba-bpda@sa作为固相萃取介质，构建在线固相萃取-高效液相色谱联用分析系统对加标0.6mg/kg三种β2-受体激动剂（即克伦特罗、莱克多巴胺、班布特罗）的实际猪肝样品的检测色谱图。

具体实施方式

为了使本发明所述内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

（1）以磺酸根功能化共价有机聚合物（coptpba-bpda@sa）为填料的固相萃取柱的制备：

1）基质共价有机聚合物（coptpba-bpda）的制备：称取0.1mmol的1,3,5-三(4-氨苯基)苯和0.15mmol的4,4-联苯二甲醛于烧瓶中，添加20ml乙醇作为反应溶剂，超声10分钟使其均匀分散；然后加入2ml3mol/l乙酸作为催化剂，常温下搅拌，反应15分钟，得到均匀的黄色悬浊液；过滤，乙醇清洗两次，在60℃下真空干燥，得到黄色的coptpba-bpda。

2）磺酸根功能化共价有机聚合物（coptpba-bpda@sa）的制备：将在前一步合成的coptpba-bpda和0.05mmol对氨基苯磺酸置于烧瓶中，加入6ml均三甲苯和14ml二氧六环作为反应溶剂，在常温下搅拌10分钟得到悬浊液；然后加入2ml3mol/l乙酸作为催化剂，在70℃油浴锅中反应4小时得到红棕色悬浊液；过滤，依次使用n,n-二甲基甲酰胺（dmf）、乙醇和超纯水进行清洗，在60℃下真空干燥，得到砖红色的coptpba-bpda@sa固体。

3）固相萃取柱的装填：先将长度为33毫米，内径为2.1毫米的不锈钢空柱管洗净烘干，在柱管出口端装上滤帽，装好两端柱头；将50mg的coptpba-bpda@sa制成匀浆液，借助泵的辅助将匀浆液通入空柱管中，以此将coptpba-bpda@sa填入柱内。之后采用乙腈作为流动相，在液相色谱泵上冲洗固相萃取柱，得到coptpba-bpda@sa固相萃取柱。

（2）在线固相萃取-高效液相色谱联用检测方法：

采用本课题组发明的“六通阀+十通阀”的在线联用模式（在线固相萃取-高效液相色谱联用系统，专利号：zl201820762345.4），将coptpba-bpda@sa固相萃取柱作为固相萃取介质，构建在线固相萃取-高效液相色谱联用系统，所述的联用系统由六通阀v1、十通阀v2、以磺酸根功能化共价有机聚合物为萃取富集介质的固相萃取柱、液相色谱输液泵a、液相色谱输液泵b、定量环a、定量环b、液相色谱分析柱以及检测器构成。联用系统的运行包括以下操作步骤：

1）平衡：六通阀v1和十通阀v2都处于load位置；载样液通过泵a平衡以磺酸根功能化共价有机聚合物为萃取富集介质的固相萃取柱，其流速为0.1ml/min；流动相通过泵b直接经分析柱以获得色谱分离需要的稳定基线，流速为0.8ml/min；同时，通过进样针将样品溶液注满定量环a；

2）在线萃取富集：当六通阀v1调至inject位置，在线固相萃取开始，定量环a中的样品溶液经由载样液带入以磺酸根功能化共价有机聚合物为萃取富集介质的固相萃取柱，经过6分钟时间，六通阀v1调回load位置；

3）在线洗脱：将泵a的输送液由载样液换成洗脱液，利用洗脱液将以磺酸根功能化共价有机聚合物为萃取富集介质的固相萃取柱上萃取富集的分析对象洗脱下来；洗脱流速设为0.1ml/min，在与十通阀v2连接的定量环b内收集洗脱液；

4）检测：洗脱液收集完成，十通阀v2调节至inject位置，将洗脱下来的分析对象输送至液相色谱分析柱进行分离，再利用二极管阵列检测器进行检测，此时用于输送流动相的泵b的流速设置为0.8ml/min。

其中，所述的载样液组成为：按体积分数比计，乙腈/0.2%甲酸溶液=20%/80%；所述的洗脱液组成为：按体积分数比计，乙腈/0.15%甲酸-三乙胺溶液(ph=9.8)=25%/75%；所述的流动相组成为：按体积分数比计，乙腈/0.1%甲酸-三乙胺溶液(ph=4.0)=25%/75%；所述的液相色谱分析柱为c18色谱柱；柱温箱温度为40℃；检测波长为213nm。

应用实施例1

按上述具体实施方式制备coptpba-bpda@sa固相萃取柱，以这种固相萃取柱作为固相萃取介质，构建在线固相萃取-高效液相色谱联用分析系统，对空白实际猪肉样品和加标0.6mg/kg三种β2-受体激动剂（即克伦特罗、莱克多巴胺、班布特罗）的实际猪肉样品进行分析（附图1）。联用系统具体运行条件为：载样液组成：乙腈/0.2%甲酸水溶液=20%/80%(v/v)；样品溶剂：乙腈/0.2%甲酸水溶液=20%/80%(v/v)；进样流速：0.1ml/min；进样体积：500μl；洗脱液组成：乙腈/0.15%甲酸-三乙胺水溶液(ph=9.8)=25%/75%(v/v)；洗脱流速：0.1ml/min；洗脱体积：200μl；采集时间区间：第0.5-2.5分钟；分离流动相：乙腈/0.1%甲酸-三乙胺水溶液(ph=4.0)=25%/75%(v/v)；分离流速：0.8ml/min；柱温：40℃；检测波长：213nm。

如附图1所示，使用coptpba-bpda@sa固相萃取柱时，色谱曲线较为平整（曲线1a），说明衍生了磺酸根的coptpba-bpda@sa固相萃取柱对实际样中干扰分析检测的杂质具有较好的除杂净化能力，减少了猪肉实际样中杂质的干扰；曲线1b中，检测峰1为莱克多巴胺，检测峰2为克伦特罗，检测峰3为班布特罗。由色谱曲线1b可见，在该联用系统条件下，coptpba-bpda@sa固相萃取柱不仅消除了实际猪肉样品基质中大量杂质对分离检测的干扰，并同时实现了实际猪肉样品中加标的微量β2-受体激动剂的高效富集萃取与高灵敏检测，表明了本发明提供的一种β2受体激动剂的在线固相萃取-高效液相色谱联用检测方法的实用性和可靠性。

应用实施例2

按上述具体实施方式制备coptpba-bpda@sa固相萃取柱，以这种固相萃取柱作为固相萃取介质，构建在线固相萃取-高效液相色谱联用分析系统，对加标0.6mg/kg三种β2-受体激动剂（即克伦特罗、莱克多巴胺、班布特罗）的实际猪肝样品进行分析（附图1）。联用系统具体运行条件为：载样液组成：乙腈/0.2%甲酸水溶液=20%/80%(v/v)；样品溶剂：乙腈/0.2%甲酸水溶液=20%/80%(v/v)；进样流速：0.1ml/min；进样体积：500μl；洗脱液组成：乙腈/0.15%甲酸-三乙胺水溶液(ph=9.8)=25%/75%(v/v)；洗脱流速：0.1ml/min；洗脱体积：200μl；采集时间区间：第0.5-2.5分钟；分离流动相：乙腈/0.1%甲酸-三乙胺水溶液(ph=4.0)=25%/75%(v/v)；分离流速：0.8ml/min；柱温：40℃；检测波长：213nm。

如附图2所示，检测峰1为莱克多巴胺，检测峰2为克伦特罗，检测峰3为班布特罗，在该联用系统条件下，coptpba-bpda@sa固相萃取柱不仅消除了实际猪肝样品基质中大量杂质对分离检测的干扰，并同时实现了实际猪肝样品中加标的微量β2-受体激动剂的高效富集萃取与高灵敏检测，表明了本发明提供的一种β2受体激动剂的在线固相萃取-高效液相色谱联用检测方法同样适合于猪的其他器官中微量β2受体激动剂的高灵敏检测，体现了此方法的广泛适用性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。