本发明属于活细胞染色剂技术领域，具体涉及一种基于脱落细胞染色的特殊染色液及其制备方法和应用。
背景技术：
特殊染色是一种为了显示与确定组织或细胞中的正常结构或病理过程中出现的异常物质、病变及病原体等，而选用相应的染色液以显示这些成分的染色方法。
临床研究表明，叶酸受体的数量会在癌细胞表面高度表达，而在正常细胞中则较少或不表达；同时由于癌细胞处于强烈的氧化应激环境中，因此癌细胞中还存在大量的活性氧，而正常细胞中则没有这种现象。在该临床研究的基础上出现了一种新的染色诊断方法，即叶酸受体介导的特殊染色方法，亚甲基蓝与叶酸形成的复合物对癌细胞具有高效靶向性，且在酸性条件下该复合物更易于癌细胞表面的叶酸受体结合，从而可进入癌细胞；而在肿瘤细胞的氧化应激环境下，还原态的无色亚甲基蓝会转化而蓝色或蓝黑色的氧化态，由此实现对癌细胞的诊断。
基于该特殊颜色方法的原理，目前市面上出现了很多相关的特殊染色液。如公开号为cn103483872a的中国发明专利申请中公开了一种用于肿瘤组织细胞的染色剂组合物，按重量百分比计，该染色剂组合物包括：显色剂0.01-5％，叶酸≤6.5％，隐色剂0.1-10％，ph调节剂≤10％，水3-95％；其中，显色剂为亚甲基蓝、二氯酚靛酚和二氯酚靛酚钠中的至少一种，隐色剂为抗坏血酸、锌粉、辛酸亚锡中的至少一种，ph调节剂为甲酸、乙酸、乳酸、柠檬酸、苹果酸、草酸、丁二酸、酒石酸或硼酸。
现有技术中常采用抗坏血酸作为隐色剂，然而抗坏血酸的稳定性较差，这就会导致染色液的诊断结果出现误差；为了尽可能地避免该误差，目前的这类特殊染色液在使用时，都是先采用载体(如棉签)先蘸取染色液，将染色液直接涂抹于人体组织，而后观察载体上染色液的颜色变化，根据该颜色变化对所测试的组织细胞区域是否产生病变进行判断。这种使用方法的不足之处在于，①染色液接触空气的时间较长，而还原性的亚甲基蓝易于被空气氧化而出现假阳性诊断结果；②染色液直接接触人体，容易对人体产生毒性，而造成二次伤害。
技术实现要素：
本申请的发明目的是提供一种基于脱落细胞染色的特殊染色液及其制备方法和应用。
为实现上述发明目的，本申请的技术方案如下：
一种基于脱落细胞染色的特殊染色液，按重量百分比计，包括：叶酸2-5％，还原剂1-12％，ph调节剂2-8％，亚甲基蓝2-5％，促渗剂3-25％，水5-85％。
本发明在特殊染色液中添加了促渗剂，促渗剂不仅能够减缓抗坏血酸等还原剂的水解，确保亚甲基蓝处于还原态，提高特殊染色液的稳定性；还能促使亚甲基蓝快速通过皮肤屏障和细胞膜进行染色，提高染色效率和染色准确率，避免假阳性结果的出现。
本发明中，所述的还原剂可以是抗坏血酸或锌粉，所述的ph调节剂可以是乙酸或乳酸。
在上述的基于脱落细胞染色的特殊染色液中，所述的促渗剂为丙二醇、丙三醇和丁二醇中的至少一种。抗坏血酸结构中的环组成是烯二醇基，碳碳双键中一个是σ键，另一个是π键；其中，π键容易引起共轭，其α碳电子在p轨道形成π(2，2)，同时与相连接的两个氧原子发生p-π共轭效应π(4,6)，电负性增强，容易对h原子吸引力下降，发生水解；同时，在抗坏血酸的水溶液中，水分子间存在次级键-氢键，而抗坏血酸分子结构中的氢原子和邻位羰基氧原子则会生成与水略微不同的次级键，容易使内酯环水解。丙二醇、丙三醇和丁二醇等极性较小的溶剂能破坏该次级键，达到减缓抗坏血酸水解的目的。
在上述的基于脱落细胞染色的特殊染色液中，按重量百分比计，包括：叶酸3-4％，还原剂6-9％，ph调节剂2-8％，亚甲基蓝3-4％，促渗剂14-20％，水5-75％。
除了采用上述的促渗剂，在本发明的基于脱落细胞染色的特殊染色液中，所述的促渗剂还可以包括：
①：丙二醇、丙三醇和丁二醇中的至少一种；
和②：竹醋液。
竹醋液不仅具有抗菌性能，而且因其含有较多的有机酸类物质、酮类物质和醇类物质，因此能够作为良好的溶剂、增溶剂或助溶剂，作为良好的渗透剂，使溶解于竹醋液中的叶酸和亚甲基蓝能够有效地渗透、扩散，穿过细胞膜实现快速染色。竹醋液与丙二醇等有机溶剂联用时，特殊染色液的染色效率和准确率能进一步提高。
在上述的基于脱落细胞染色的特殊染色液中，按重量百分比计，所述的促渗剂包括：
①丙二醇、丙三醇和丁二醇中的至少一种：80-95％；
②竹醋液：5-20％。
在上述的基于脱落细胞染色的特殊染色液中按重量百分比计，所述的促渗剂包括丙二醇87％和竹醋液13％。
在上述的基于脱落细胞染色的特殊染色液，按重量百分比计，包括：叶酸3-4％，还原剂3-5％，ph调节剂2-5％，亚甲基蓝3-4％，促渗剂7-12％，水5-80％。当促渗剂中含有竹醋液时，促渗剂和还原剂的用量均能够适当减少。
本发明所述的基于脱落细胞染色的特殊染色液的制备方法包括以下步骤：
(1)按预设的重量百分比，将叶酸用部分水溶解后加入到促渗剂中，搅拌均匀；
(2)按预设的重量百分比，将50-70％的还原剂加入到步骤(1)获得的溶液中，搅拌均匀；
(3)按预设的重量百分比，将亚甲基蓝加入到步骤(2)获得的溶液中，搅拌15-45min；
(4)按预设的重量百分比，将ph调节剂和剩余的还原剂加入到步骤(3)获得的溶液中，搅拌均匀后，用水定容，获得所述的基于脱落细胞染色的特殊染色液。
本发明所述的基于脱落细胞染色的特殊染色液在上皮组织癌变细胞检测中的应用包括：
(a)用棉签在待检位置表面擦拭3-5圈，以沾取脱落细胞；
(b)用沾取脱落细胞的棉签蘸取所述的基于脱落细胞染色的特殊染色液，观察棉签的颜色变化。
在采用本发明的特殊染色液染色时，可以先取组织再染色，打破了传统方法中需要将染色液直接涂抹于人体组织的固有模式，染色液与空气接触的时间更短，检测结果准确率更高；而且对患者友好，患者依从性更佳，避免造成二次伤害。
与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
(1)本发明在特殊染色液中添加了促渗剂，促渗剂不仅能够减缓抗坏血酸等还原剂的水解，确保亚甲基蓝处于还原态，提高特殊染色液的稳定性；还能促使亚甲基蓝快速通过皮肤屏障和细胞膜进行染色，提高染色效率和染色准确率，避免假阳性结果的出现。
(2)在采用本发明的特殊染色液染色时，可以先取组织再染色，打破了传统方法中需要将染色液直接涂抹于人体组织的固有模式，染色液与空气接触的时间更短，检测结果准确率更高；而且对患者友好，患者依从性更佳，避免造成二次伤害。
具体实施方式
下面列举具体实施方式对本发明的技术方案做进一步详细说明。
实施例1
本实施例一种基于脱落细胞染色的特殊染色液，按重量百分比计，包括：叶酸3％，抗坏血酸6％，乙酸4％，亚甲基蓝3％，丙二醇14％，水70％。
该基于脱落细胞染色的特殊染色液的制备方法包括以下步骤：
(1)按预设的重量百分比，将叶酸用部分水溶解后加入到丙二醇中，搅拌至完全溶解；
(2)按预设的重量百分比，将50％的抗坏血酸加入到步骤(1)获得的溶液中，搅拌均匀；
(3)按预设的重量百分比，将亚甲基蓝加入到步骤(2)获得的溶液中，搅拌30min至完全溶解；
(4)按预设的重量百分比，将乙酸和剩余的抗坏血酸加入到步骤(3)获得的溶液中，搅拌均匀后，用水定容，获得本实施例的基于脱落细胞染色的特殊染色液。
实施例2
本实施例一种基于脱落细胞染色的特殊染色液，按重量百分比计，包括：叶酸4％，抗坏血酸9％，乳酸6％，亚甲基蓝4％，丙三醇20％，水57％。
该基于脱落细胞染色的特殊染色液的制备方法包括以下步骤：
(1)按预设的重量百分比，将叶酸用部分水溶解后加入到丙二醇中，搅拌至完全溶解；
(2)按预设的重量百分比，将60％的抗坏血酸加入到步骤(1)获得的溶液中，搅拌均匀；
(3)按预设的重量百分比，将亚甲基蓝加入到步骤(2)获得的溶液中，搅拌45min至完全溶解；
(4)按预设的重量百分比，将乳酸和剩余的抗坏血酸加入到步骤(3)获得的溶液中，搅拌均匀后，用水定容，获得本实施例的基于脱落细胞染色的特殊染色液。
实施例3
本实施例一种基于脱落细胞染色的特殊染色液，按重量百分比计，包括：叶酸4％，抗坏血酸5％，乙酸2％，亚甲基蓝4％，促渗剂12％，水73％；
按重量百分比计，该促渗剂由丙二醇87％和竹醋液13％组成。
该基于脱落细胞染色的特殊染色液的制备方法包括以下步骤：
(1)按预设的重量百分比，将叶酸用部分水溶解后加入到丙二醇中，搅拌至完全溶解；
(2)按预设的重量百分比，将50％的抗坏血酸加入到步骤(1)获得的溶液中，搅拌均匀；
(3)按预设的重量百分比，将亚甲基蓝加入到步骤(2)获得的溶液中，搅拌20min至完全溶解；
(4)按预设的重量百分比，将乙酸和剩余的抗坏血酸加入到步骤(3)获得的溶液中，搅拌均匀后，用水定容，获得本实施例的基于脱落细胞染色的特殊染色液。
实施例4
本实施例一种基于脱落细胞染色的特殊染色液，按重量百分比计，包括：叶酸3％，抗坏血酸3％，乳酸5％，亚甲基蓝3％，促渗剂7％，水79％；
按重量百分比计，该促渗剂由丙三醇95％和竹醋液5％组成。
该基于脱落细胞染色的特殊染色液的制备方法与实施例3相同。
实施例5
本实施例一种基于脱落细胞染色的特殊染色液，按重量百分比计，包括：叶酸3％，抗坏血酸4％，乳酸4％，亚甲基蓝4％，促渗剂10％，水75％；
按重量百分比计，该促渗剂由丁二醇90％和竹醋液10％组成。
该基于脱落细胞染色的特殊染色液的制备方法与实施例3相同。
对比例1
本实施例一种基于脱落细胞染色的特殊染色液，按重量百分比计，包括：叶酸4％，抗坏血酸5％，乙酸2％，亚甲基蓝4％，竹醋液12％，水73％。
该基于脱落细胞染色的特殊染色液的制备方法与实施例3相同。
取实施例1-5、对比例1制得的特殊染色液，同时购买了现有的上皮组织细胞特殊染色液，对各特殊染色液的稳定性和使用方式进行了测试，测试结果见表1。
其中，稳定性的测试方法为：每种特殊染色液各取4份，用棉签蘸取染色液，静置在空气中，秒表记录染色液的变色时间，取平均值。
表1
由表1可见，实施例1-2制备的特殊染色液的平均变色时间在55-56s，对比例1制备的特殊染色液的平均变色时间在50s，而实施例3-5制备的特殊染色液的平均变色时间在64-68s，与现有技术中各特殊染色液相比，本发明的特殊染色液的稳定性均更强；同时，丙二醇、丙三醇和丁二醇与竹醋液的配伍使用能够进一步提高染液的稳定性。
并且，本发明的特殊染色液的使用方法为：先用棉签在待检位置表面擦拭3-5圈，以沾取脱落细胞；而后用沾取脱落细胞的棉签蘸取特殊染色液，观察棉签的颜色变化。这与现有技术中各特殊染色液需要先蘸染色液、将染色液涂抹与待检位置再取样的使用方法完全不同，本发明的使用方法中，染色液与空气接触的时间更短，检测结果的准确率更高，且染色液不会直接接触人体。
对表1中所列特殊染色液的检测灵敏度和特异性进行检测，检测方法为：
灵敏度＝真阳性人数/(真阳性人数+假阳性人数)×100％；
特异性＝真阴性人数/(真阴性人数+假阳性人数)×100％；
检测结果见表2。
表2
由表2可见，本发明制备的特殊染色液均具有较高的检测灵敏度和特异性，表明具有较高的检测准确率。