区分不同时期精母细胞的方法及在生精分期等方面的应用与流程

本发明涉及检测领域，尤其涉及一种区分不同时期精母细胞的方法及其在生精分期、雷公藤甲素致睾丸损伤中方面的应用。

背景技术：

研究发现，部分毒理、病理的改变在生精上皮呈现生精周期特异性，而生精周期的判定需要较高的形态识别分析能力和经验，因而急需可以有效降低分期难度，同时提高分期准确性的实验方法。目前生精小管分期一般依靠he或pas染色完成。传统的he染色条件下可对小鼠睾丸生精周期进行简单划分，并可对第ⅶ、ⅷ、ⅻ期生精小管进行较准确区分。首先第ⅶ、ⅷ期有残余体且数量由少到多，成熟精子数量增多，第ⅻ期有减数分裂核分裂相。第ⅸ-ⅺ期无圆形精子细胞，长形精子细胞由椭圆形拉伸成梭形，各期之间也缺乏明确界限，因此在显微镜下区分难度大。russell等采用pas染色法特异显示精子细胞头部的顶体、背侧角及腹侧角结构制定分期标准。第ⅶ、ⅷ期顶体帽延伸角度大于120°。第ⅸ期圆形精子细胞核由圆形变为一侧扁平，出现背、腹侧面。第ⅹ期变形精子细胞腹侧角形成。第ⅺ期变形精子细胞背侧角形成。第ⅻ期可见处于减数分裂的分裂相。pas分期方法需要观察顶体角度变化、背/腹侧面、背/腹侧角，对染色质量要求高，且在光学显微镜下对于背侧角、腹侧角进行区分诊断难度大，需要较高的诊断经验。传统的he染色方法和pas染色方法在某些阶段均存在主观性强、分期界限含糊、对染色质量及诊断经验要求高的现象。

技术实现要素：

为了解决现有技术中小鼠睾丸生精上皮精子发生周期的第ⅶ-ⅻ期判定难，质量差，要求高的问题，本发明提供一种区分不同时期精母细胞的方法，其特征在于，采用睾丸标本的石蜡切片进行γ-h2ax免疫组化染色，其中：

γ-h2ax着色在细胞核内呈多点状，为细线前期精母细胞；γ-h2ax着色覆盖整个细胞核，为细线期精母细胞；γ-h2ax着色面积减少，集中在核染色质上，为偶线期精母细胞；γ-h2ax着色在核边缘呈一点状，为粗线期精母细胞；γ-h2ax着色在细胞核内的非核边缘呈一点状，为双线期精母细胞。

进一步地，γ-h2ax免疫组化染色采用抗-γh2ax(phospho-ser139)兔单克隆抗体[anti-γh2ax(phospho-ser139)rabbitmonoclonalantibody(clonerm224)]，克隆号rm224和羊抗兔igg二抗。

进一步地，睾丸标本的石蜡切片来自小鼠。

进一步地，染色液为苏木素染色液。

一种生精分期判定方法，采用如上所述的方法来区分不同时期精母细胞；

根据不同时期精母细胞的存在与否来对第vii期到第xii期生精小管进行判定，具体为：存在细线前期精母细胞的为第ⅶ、ⅷ期生精小管；存在细线期精母细胞的为第ⅸ、ⅹ期生精小管；存在偶线期精母细胞和/或双线期精母细胞的为第ⅺ、ⅻ期生精小管；

第vii期到第xii期生精小管来自小鼠睾丸。

如上所述的区分不同时期精母细胞的方法在生精分期判定中的应用。

进一步地，根据不同时期精母细胞的存在与否来对第vii期到第xii期生精小管进行判定，具体为：存在细线前期精母细胞的为第ⅶ、ⅷ期生精小管；存在细线期精母细胞的为第ⅸ、ⅹ期生精小管；存在偶线期精母细胞和/或双线期精母细胞的为第ⅺ、ⅻ期生精小管。

如上所述的区分不同时期精母细胞的方法在化合物和/或组合物对睾丸的损伤中的应用。

进一步地，化合物为雷公藤甲素。

进一步地，用于在不同时期精母细胞中检测对雷公藤甲素睾丸损伤的敏感细胞。

进一步地，采用如上所述的区分不同时期精母细胞的方法对不同时期精母细胞进行识别；

然后，对雷公藤甲素致睾丸损伤的标本进行细线期、偶线期、粗线期、双线期精母细胞的分类计数；其中雷公藤甲素致睾丸损伤的标本为雄性c57bl/6小鼠经口灌胃给与雷公藤甲素11天后的标本；雷公藤甲素的给药剂量是0.125mg/kg到0.5mg/kg；

比较细线期、偶线期、粗线期、双线期精母细胞的下降比率，找出下降比率明显更高且具有统计学意义的那一组或几组即为敏感细胞；各期精母细胞下降比率由雷公藤甲素处理组与生理盐水处理组比值得到；t检验求得p值，数据以平均数+/-标准差形式表示，n＝4。

本发明人经过实验验证，发现采用γ-h2ax免疫组化染色，仅通过对阳性着色的精母细胞类型及染色强度进行区分，便可以对小鼠睾丸生精上皮精子发生周期的第ⅶ-ⅻ期进行更精确、简便的划分。可以确定雷公藤甲素致睾丸损伤的敏感细胞。

本发明的目1：区分不同时期精母细胞

目的2：精确区分小鼠睾丸内ⅶ-ⅻ期生精小管

γ-h2ax是组蛋白h2a家族中h2ax磷酸化后的产物，当细胞dna双链断裂形成时，在双链断裂的位点会出现γ-h2ax形成的“焦点”，辅助dna损伤的修复，且γ-h2ax在小鼠睾丸中的含量高于任何其它组织，并与减数分裂密切相关。shanthak.mahadevaiah，jamesm.a^[5]把生精小管内的生精细胞分离后进行多重抗体免疫荧光染色，区分不同时期精母细胞(图1)。细线前期的精母细胞细胞核有少量γ-h2ax着色，在核内呈点状分布(图1a)。进入细线期后，精母细胞核内γ-h2ax阳性区域的面积和强度逐步增加，直至覆盖整个核(图1b-c)。而在进入偶线期后，核内γ-h2ax阳性区域的面积、染色强度逐渐下降(图1d-e)，在偶线晚期，γ-h2ax着色从常染色体上消失，集中在x、y染色体上(图1f)。到粗线期中期，γ-h2ax着色集中于一点，在核边缘处(图1g)。最后到双线期时，γ-h2ax着色仍旧维持单点状，但其位置向核中心移动(图1h)。

本发明首先用小鼠睾丸标本的石蜡切片进行γ-h2ax免疫组化染色(图2)，结果发现在给予生理盐水的小鼠睾丸中靠近生精小管基底膜一侧的生精细胞核较小，其γ-h2ax着色呈斑点状，或阳性区域面积覆盖整个细胞核，为细线前期和细线期精母细胞(图2a,b,d,e)；与细线期精母细胞相近的生精细胞，其γ-h2ax着色面积减少，集中在核染色质上，为偶线期精母细胞(图2c,f)；在生精上皮中间层位置可见一类核较大的生精细胞，γ-h2ax着色在核边缘呈一点状，为粗线期精母细胞(图2b,g)；在靠近管腔侧，生精细胞核内部γ-h2ax着色呈单点状，为双线期精母细胞(图2c,h)。各期精母细胞着色特征与shanthak.mahadevaiah，jamesm.a的免疫荧光染色模式一致。免疫荧光染色需要将新鲜的睾丸组织酶解消化为单个的生精细胞，然后通过带有荧光标签的抗体进行多种生精细胞的标记，才能准确地进行生精细胞周期的判断。而本发明在γ-h2ax这一染色和分布特征的基础上，使用石蜡切片进行免疫组化染色，结合生精细胞核的苏木素着色特征和细胞形态，明确区分各期初级精母细胞，从而避免新鲜睾丸组织处理的巨大工作量和不稳定性，显著增强了γ-h2ax染色特征判断的准确性。

小鼠生精周期睾丸生精上皮变化规律(图3)表明细线前期精母细胞仅存在于第ⅶ、ⅷ期生精小管内，细线期精母细胞则存在于第ⅸ、ⅹ期生精小管内；另外偶线期、双线期精母细胞仅存在于第ⅺ、ⅻ期生精小管内。结合γ-h2ax免疫组化染色确定的不同分化阶段初级精母细胞，我们可以将第ⅶ-ⅻ期生精小管进行精确、简便的区分(图4)。首先，石蜡切片生精上皮内γ-h2ax免疫组化染色显示，细线前期及粗线期精母细胞同时存在的生精小管，应该处于第ⅶ或第ⅷ期分化阶段(图4a1-a5)。精母细胞在细线前期向细线期分化过程中，γ-h2ax着色由少量斑点状逐渐增多直至覆盖整个细胞核。结合这一特征分析γ-h2ax染色情况可以判断，γ-h2ax着色面积较小、强度偏弱的细线前期精母细胞数量较多的小管应属于第ⅶ期生精小管，而γ-h2ax着色面积更大、强度更高的细线前期精母细胞数量较多的小管为第ⅷ期生精小管。与常规he染色结果一致，γ-h2ax标记的第vii和viii期生精小管中成熟精子的排列形态存在明显差异。第ⅶ、ⅷ期生精小管管腔内均存在大量成熟精子，而仅第ⅷ期小管中可见大量旋涡状排列的成熟精子。其次，生精上皮内γ-h2ax染色显示有细线期及粗线期精母细胞同时存在的小管应该为第ⅸ或第ⅹ期生精小管(图4b1-b5)。精母细胞在细线期向偶线期分化过程中，γ-h2ax着色面积从覆盖整个细胞核开始，逐渐减少并向核染色质集中。结合这一特征分析γ-h2ax染色情况可以判断，γ-h2ax染色面积最大(覆盖整个核)，强度较高的细线期精母细胞数量较多的生精小管应处于第ⅸ期生精小管内，而γ-h2ax染色面积较小，强度较低的细线期精母细胞数量较多的生精小管应处于第ⅹ期生精小管内。与常规he染色结果一致，第ⅹ期生精小管内长形精子细胞较第ⅸ期更进一步伸长，符合分期进程中长形精子细胞形态变化规律。其三，γ-h2ax染色显示偶线期及双线期精母细胞的同时存在为第xi或ⅻ期生精小管(图4c1-c5)。第xi期生精小管内着色较强、面积较大的偶线期精母细胞数量较多，第ⅻ期生精小管内着色较弱、面积较小的偶线期精母细胞数量较多。我们在γ-h2ax染色标记的第ⅻ期生精小管内可以观察到减数分裂现象，与常规he染色结果一致。

以下将结合附图对本发明作进一步说明，以充分说明本发明的目的、技术特征和技术效果。

附图说明

图1是小鼠减数分裂时期γ-h2ax的表达模式图。

图2是小鼠睾丸各阶段初级精母细胞γ-h2ax着色典型特征图。

图3是小鼠生精周期不同上皮排列模式图。

图4是γ-h2ax染色有效的改善了小鼠睾丸ⅶ-ⅻ期生精小管区分的准确性。

图5是雷公藤甲素剂量依赖的减少了各阶段初级精母细胞数量。

图6是各阶段初级精母细胞雷公藤甲素敏感性比较柱状图。

具体实施方式

以下通过具体的实施例对本发明的技术方案做进一步的描述。以下的实施例是对本发明的进一步说明，而不是限制本发明的范围。

实施例中所使用的试剂、仪器来源：

thermo全自动脱水机(shandonexcelsiores)；

thermo石蜡包埋机(histostar)；

leica轮转式切片机(rm2245)；

光学显微镜(zeissaxioscope.a1)；

病理切片扫描仪(aperotechnologies)；

1抗：anti-γh2ax(phospho-ser139)rabbitmonoclonalantibody(clonerm224)，货号xy-c-20721，购自于上海熹垣生物科技有限公司；

2抗：羊抗兔igg二抗(goatanti-rabbitigg)，货号：qn2732-pwv2，购自于北京百奥莱博科技有限公司；

染色液为苏木素染色液。

除特别指定外，本发明中所使用的方法均为本领域中的常规方法。

图1：小鼠减数分裂时期γ-h2ax的表达模式图。

将生精细胞分离后进行免疫荧光染色，小鼠不同阶段精母细胞着色模式如下：图中红色为scp3(smallc-terminaldomainphosphatase3)或scp1(smallc-terminaldomainphosphatase1)显色模式；绿色为γ-h2ax显色模式；蓝色为brdu(bromodeoxyuridine)显色模式；箭头示y染色体；短箭头示x染色体。a:细线前期精母细胞，少量γ-h2ax呈点状着色。b-c：细线期精母细胞，γ-h2ax阳性区域的数量和强度增加遍布核的大部分区域。d-e：偶线期精母细胞，γ-h2ax阳性区域的数量、染色强度下降，集中在核染色质。f：偶线期晚期精母细胞，γ-h2ax从常染色体上消失，凝结在x、y染色体上。g：粗线期中期精母细胞，γ-h2ax只存在于性染色体中，并处于细胞核边缘位置。h：双线期精母细胞，γ-h2ax存在于性染色体中，并向细胞核中心移动。i：四分体期精母细胞，γ-h2ax着色消失。

图2：小鼠睾丸各阶段初级精母细胞γ-h2ax着色典型特征图。

在小鼠睾丸石蜡切片上不同阶段精母细胞有不同的γ-h2ax着色模式。a：长箭头示细线前期精母细胞；b：长箭头示细线期精母细胞，短箭头示粗线期精母细胞；c：长箭头示偶线期精母细胞，短箭头示双线期精母细胞；d：长箭头示细线前期精母细胞高倍图；e：长箭头示细线期精母细胞高倍图；f：长箭头示偶线期精母细胞高倍图；g：长箭头示粗线期精母细胞高倍图；h：长箭头示双线期精母细胞高倍图。

图3：小鼠生精周期不同上皮排列模式图。

russell等绘制的生精分期图显示小鼠生精周期共12期。在精子发生过程中生精上皮不断变化，随之引起ⅰ-ⅻ生精小管的形成。pl：细线前期精母细胞，l：细线期精母细胞，z：偶线期精母细胞，p：粗线期精母细胞，d：双线期精母细胞。

图4：γ-h2ax染色有效的改善了小鼠睾丸ⅶ-ⅻ期生精小管区分的准确性。

在a、b、c三行的第一张图片(a1-c1)中我们分别选取相邻的2根生精小管进行γ-h2ax染色分析，第二(a2-c2)、第三张(a3-c3)图片均来源于第一张图(a1-c1)，每行最右上角(a4-c4)、最右下角(a5-c5)图片分别来源于第二(a2-c2)、第三张图(a3-c3)中黑框标注部分。a2为第ⅶ期生精小管，a3为第ⅷ期生精小管，b2为第ⅸ期生精小管，b3为第ⅹ期生精小管。c2图片为第ⅺ期生精小管，c3图片为第ⅻ期生精小管。pl：细线前期精母细胞，l：细线期精母细胞，z：偶线期精母细胞，p：粗线期精母细胞，d：双线期精母细胞。

图5：雷公藤甲素剂量依赖的减少了各阶段初级精母细胞数量。

雄性c57bl/6小鼠经口灌胃给与雷公藤甲素11天。a,e:0mg/kg；b,f:0.125mg/kg；c,g:0.25mg/kg:d,h：0.5mg/kg；a-d:10倍镜，e-h:40倍镜；i：雷公藤甲素给药11天后各剂量组、各期生精细胞分类计数柱形图。

图6：各阶段初级精母细胞雷公藤甲素敏感性比较。

雄性c57bl/6小鼠经口灌胃给与雷公藤甲素11天后，对各阶段初级精母细胞雷公藤甲素敏感性进行比较。各期精母细胞下降比率由雷公藤甲素处理组与生理盐水处理组比值得到，t检验求得p值，数据以平均数+/-标准差形式表示，n＝4。

制备实施例

实施例1不同时期初级精母细胞阶段的判定

γ-h2ax在初级精母细胞分化各阶段有着不同的分布模式。在细线前期至细线期γ-h2ax着色由少量斑点状逐渐增多直至覆盖整个细胞核。从偶线期开始γ-h2ax着色面积减小，集中在核染色质上，并进入粗线期后在细胞核边缘聚集为单个点状。这一γ-h2ax阳性点在双线期时向核内部移动。

实施例2小鼠睾丸ⅶ-ⅻ期生精小管的准确区分。

γ-h2ax着色面积较小、强度偏弱的细线前期精母细胞数量较多的小管应属于第ⅶ期生精小管，而γ-h2ax着色面积更大、强度更高的细线前期精母细胞数量较多的小管为第ⅷ期生精小管。γ-h2ax染色面积最大(覆盖整个核)，强度较高的细线期精母细胞数量较多的生精小管应处于第ⅸ期生精小管内，而γ-h2ax染色面积较小，强度较低的细线期精母细胞数量较多的生精小管应处于第ⅹ期生精小管内。第xi期生精小管内着色较强、面积较大的偶线期精母细胞数量较多，第ⅻ期生精小管生精小管内着色较弱、面积较小的偶线期精母细胞数量较多。第ⅻ期生精小管内可以观察到减数分裂现象。

实验实施例tl

实施例1雷公藤甲素致睾丸损伤的敏感细胞的分析。

雷公藤及衍生物具有很强的生物活性和药理作用，可以有效的治疗多种疾病，但由于毒副作用限制了其在临床上的应用^[6]，尤其是对睾丸等生殖系统产生的特异性损伤^[7]。目前国内外对雷公藤甲素的生殖毒研究缺乏敏感靶细胞研究。前期研究发现，小鼠连续给予雷公藤甲素15天到6个月后，均能产生睾丸特异性损伤。给药组精母细胞相关标志物的mrna水平均显著下调。如果可以确定雷公藤甲素致睾丸损伤的敏感细胞。便可以为为雷公藤甲素衍生物的临床合理应用、不良反应的诊断和治疗提供重要科学依据，也为雷公藤甲素衍生物减毒增效的研发提供了研究的新技术、新方法。

本发明随后通过γ-h2ax免疫组化染色对不同时期精母细胞的识别，对雷公藤甲素致睾丸损伤的标本进行了细线期、偶线期、粗线期、双线期精母细胞的分类计数(图5和表1)。由图5发现随着剂量的增加各阶段精母细胞的数量均减少，粗线期精母细胞既是初级精母细胞中数量最多的细胞，也是在雷公藤甲素处理后绝对数量下降最多的一类细胞。假设粗线期精母细胞是雷公藤甲素致睾丸特异性损伤的敏感靶细胞，则其减少数量应高于细线期与偶线期精母细胞减少数量的总和。我们将各剂量组细线期与偶线期细胞数量减少之和与粗线期精母细胞减少数量进行比较(表1)。在中低剂量水平下细线期和偶线期精母细胞数量减少之和与粗线期精母细胞减少数量相近，特别是低剂量组两者几乎持平，并未出现后者远远高于前者的现象，可排除粗线期精母细胞为敏感靶细胞的可能性。同时在不考虑数量最少的双线期精母细胞的情况下，考察其余三个时期精母细胞下降比率(图6)，发现在中剂量水平下，与粗线期相比，细线期精母细胞下降比率明显更高，并具有统计学意义。所以在中剂量水平下，细线期精母细胞为雷公藤甲素致睾丸损伤的敏感靶细胞。

表1：雷公藤甲素给药后初级精母细胞分类计数

注：通过计算生理盐水处理组的细胞数量减去雷公藤甲素处理组的细胞数量得到细线期、偶线期、粗线期、双线期精母细胞的减少数量。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。