基于纳米孔的体外HIV蛋白酶检测仪器及方法与流程

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种基于纳米孔的体外hiv蛋白酶检测仪器及方法。

背景技术：

获得性免疫缺陷综合征(acquiredimmunodeficiencysyndrome,aids)又称艾滋病是由人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus,hiv)感染所致的一类高死亡率的传染性疾病。目前全球范围aids的医疗对策是尽早发现、早治疗以预防传播，新的联合抗病毒疗法可以让患者长时间处于潜伏期而不发病，但迄今在aids的诊断和治疗领域尚存在严重问题与不足。hiv蛋白酶是hiv成熟、复制过程中的关键酶，它通过切割病毒翻译的gag、gag-pol聚蛋白前体使其成为成熟的具有感染性的病毒颗粒，在hiv整个生命循环过程中具有极其重要的作用，近几年已成为抗hiv药物研发的主要靶位之一。因此，研究hiv蛋白酶的活性、结构及功能，对阐明aids的发生机制，改进aids诊治手段等具有重要意义。hiv蛋白酶研究的关键前提技术是要建立快速准确的活性检测系统，但至今国内外尚无令人满意的研究报道和相关设备。

近几年，随着纳米材料、光学、电学等领域科技的发展和相互融合，通过纳米孔技术进行生物样本中的单分子检测已逐步成为可能，基于生物纳米孔的hiv蛋白酶检测也有相应报导。但生物纳米孔由于其自身稳定性差，贮藏有效期短等问题，研究人员将研究方向转向了用固态纳米孔取代生物纳米孔的方法。但低于2.5nm固态纳米孔的加工技术和固态纳米孔信噪比差等技术难题一直没有解决。

基于上述技术难题，本申请人前期研发了一种检测工艺，初步可以满足现实检测需要，但用于测试hiv蛋白酶存在两个方面的问题：

(1)所使用的固态纳米孔加工包括fib加工技术和电击穿法加工技术，fib加工技术加工精度高，但所能加工的最小尺寸为5nm；电击穿法加工技术可以加工2.5nm以上的纳米孔，但加工时间长，容易形成多孔。均不适用于我们所要求的1-2nm的固态纳米孔加工。

(2)固态纳米孔由于本身薄膜材料的介电常数较大，进而其构建的固态纳米孔测试体系的电容较大，形成较大的噪声，不能满足hiv蛋白酶测试系统的信噪比要求。测试数据：10um*10um窗口的氮化硅(氮化硅的信噪比要优于石墨烯)纳米孔，孔径为1.5nm，孔长(膜厚)为10nm，在钳位电压为100mv的情况下，其测量噪声远大于50pa，掩盖了hiv蛋白酶剪切后蛋白片段所产生的信号(在该系统下，小片段的阻塞信号小于50pa)。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种基于纳米孔的体外hiv蛋白酶检测仪器及方法，通过本专利所描述的仪器及方法，能够通过采集微量血样/体液，检测出携带hiv病毒人员的hiv蛋白酶含量，尤其能够检测零窗口期的hiv蛋白酶含量，既能实现疑似hiv感染人群的hiv病毒感染情况检测，又能用于抗hiv药品的药效检测，适用于医院诊断，个人检测和药品研究等领域。

依据本发明的第一方面，提供一种基于纳米孔的体外hiv蛋白酶检测仪器，其包括血样/体液分离芯片1、集成了纳米孔及存储了检测试剂的微流控芯片2、纳米孔检测电路系统3和系统采集控制系统4；血样/体液分离芯片1的血样/体液注入口101接收移液枪或者自动进样机加入的血样/体液样本，流入混合通道103与裂解通道102流入的裂解液混合，实现细胞裂解，混合溶液经过过滤膜104后，大分子样品被过滤并通过流入废液池106；没有被过滤掉的hiv蛋白酶205等小分子穿过过滤膜流入到分离后样品流出接口105，并经接口211流入到纳米孔上层溶液通道213，与预先加入的靶蛋白202混合反应，将靶蛋白剪切为两个短片段206，207，该短片段在纳米孔检测电路3的电场作用下穿过纳米孔，产生过孔信号，最终通过系统采集控制装置4计算得出hiv蛋白酶的含量，并最终显示到电脑终端或者手机终端。

其中，固态纳米孔201为氮化硅纳米孔和石墨烯纳米孔，纳米孔孔径为1nm-2nm。

进一步地，纳米孔芯片安装在集成了纳米孔及存储了检测试剂的微流控芯片2中，并由微流道系统将纳米孔两侧分为两个腔室。检测电路3所检测到的电流信号为纳米孔的背景电流信号203和未被剪切的靶蛋白/蛋白长链所产生的过孔电流信号204。血样/体液前处理芯片留有用户加入待测样品(血样/体液)的加样口101和裂解液注入口102，用户通过该入口加样；加入的样品在入口后方的103s型管道中混合反应，实现样品的细胞裂解。

更进一步地，裂解后的溶液经过过滤膜104，滤掉大分子成分并直接通过废液池接口106流入废液池，而未被滤掉的包含由hiv蛋白酶的小分子溶液通过接口105流入到纳米孔检测芯片2。微流控芯片的流道接口211与前处理芯片流出接口105连接，接收hiv蛋白酶样品溶液。

优选地，芯片的最中间部分安装有加工有4个纳米孔的纳米孔芯片201，纳米孔的孔径尺寸为1-2nm，该芯片将缓冲溶液分为上下层溶液，上层溶液固定在210微针内，与纳米孔芯片微接触，接触面积小于5um²。每个微针内部嵌入一个电极，分别与下层溶液的公共电极构成4个纳米孔检测电路电极对，电极连接到芯片外沿的金手指电路，进而在芯片插入检测电路3时与系统电气连接。

依据本发明技术方案的第二方面，提供一种1-2nm固态纳米孔加工的方法，使得hiv蛋白酶检测的特异性底物所产生的信号量能被固态纳米孔检测出来。其具体为提供一种使用上述的基于纳米孔的体外hiv蛋白酶检测仪器的方法，包括以下步骤：

步骤1、固态纳米孔加工；

步骤2、提升固态纳米孔信噪比；

其中采用基于fib和电击穿法结合来加工1-2nm固态纳米孔，具体加工步骤如下：

(1)准备外观尺寸为5mm*5mm*300um的开窗为10um*10um的氮化硅纳米薄膜；

(2)采用fib(聚焦离子束)的ga束在血样/体液分离芯片上加工200nm的纳米孔；

(3)准备石墨烯薄膜，将石墨烯薄膜固定在基片上，并在石墨烯薄膜上涂一层pmma；

(4)去除石墨烯生产的cu基底；

(5)将pmma/石墨烯转移到集成了纳米孔及存储了检测试剂的微流控芯片中加工好的氮化硅芯片上，完全覆盖步骤(2)中加工的200nm纳米孔；

(6)烘干加热，加固石墨烯薄膜与氮化硅基片的结合力；

(7)使用丙酮去除pmma，最终形成石墨烯纳米孔薄膜；

(8)将制备好的石墨烯薄膜芯片放置于微流道芯片上，并注入缓冲液，在相应缓冲液中加入ag/agcl电极；

(9)连接电打孔设备，并开启打孔装置，将目标设置到1-2nm范围，点击开始打孔；

(10)待打孔完成后，采用电打孔设备等源表测试纳米孔的iv曲线，得到i-v曲线图，确定纳米孔加工完成。

与现有技术相比较，本发明的有益效果为：(1)构建了hiv蛋白酶的固态纳米孔检测方法及仪器；(2)提供了一种hiv感染情况的零窗口期检测方案；(3)为治疗艾滋病的药物药效治疗提供了一种监测工具。

本发明申请与现行技术比对有如下特征

1、利用纳米材料、光学、电学等领域科技的发展和相互融合，通过纳米孔技术进行生物样本中的单分子检测；纳米孔技术无需标记放大等处理，通过直接读取待测物质经过纳米孔时的光电信号进行分析，实现对待测物的直接、高灵敏度的实时在线检测分析。

2、构建了完整的可供使用的hiv蛋白酶检测仪和方法。其与现有的几种常用检测技术的相比较，不仅仅检测时间大大缩短、相关检测费用显著下降。

附图说明

图1是依据本发明的单芯片基于纳米孔技术的hiv蛋白酶检测仪器结构图。

图2是基于纳米孔的hiv蛋白酶检测原理图。

图3是血样/体液前处理芯片结构图。

图4是集成了纳米孔及存储了检测试剂的微流控芯片。

图5是纳米孔检测系统电路结构图。

图6是用于提高信噪比的玻璃微针电镜图。

图7是用于测试信号的石墨烯纳米孔在三种不同溶液浓度下的i-v曲线(1.8nm)。

图8是加入hiv蛋白酶样品前的信号图。

图9是加入hiv蛋白酶样品后的信号图。

图1中1：血样/体液分离芯片，2：集成了纳米孔及存储了检测试剂的微流控芯片，3：纳米孔检测电路系统，4：系统采集控制系统。

图2中：201:固态纳米孔，202:未被剪切的靶蛋白/蛋白长链，203：纳米孔的背景电流信号，204:未被剪切的靶蛋白/蛋白长链所产生的过孔电流信号，205:hiv蛋白酶，206：剪切后的短蛋白a,207剪切后的短蛋白b,208:短蛋白a所产生的电流过孔信号，209:短蛋白b所产生的电流过孔信号，210：用于控制接触面积达额微针。

图3中101：血样/体液注入口，102：裂解液注入口，103：混合流道，104：微米过滤膜，105：分离后样品流出接口，与接口211连接，废液池接口106。

图4中211：样品入口/检测试剂注入口/缓冲液注入口，与分离后样品流出接口105连接，212：缓冲液注入口，213：纳米孔上层溶液流道，214：纳米孔下层溶液流道，215：4通道电极(ag/agcl/pt与溶液连通，电路端采用金手指设计)，201：固态纳米孔。

图6用于提高信噪比的玻璃微针(210)，pipette-b1,b2拉制参数：p＝200,heat＝529,pull＝30,vel＝40,time＝250，pipette-s1,s2拉制参数：p＝200,heat＝530,pull＝80,vel＝70,del＝80。

图8在-200mv电压下(a)固态纳米孔的的背景信号片段；(b)5μm多肽底物ffsqnypivq(204)在纳米孔(201)中的特征信号片段。

图9在-200mv的外加电压下，在固态纳米孔加入300ng/mlhiv-1蛋白酶205后a)0-10min和b)30-40min内引起的电流变化的幅值和信号数目的柱状图以及其相应的特征信号片段c)和d)。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。另外地，不应当将本发明的保护范围仅仅限制至下述具体实验方法或具体参数。

本发明提供一种基于纳米孔的体外hiv蛋白酶检测仪器及方法，其实现了通过采集微量血样/体液即可测量出感染hiv病毒人员的hiv蛋白酶含量，本发明适合医院和个人使用。基于纳米孔的体外hiv蛋白酶检测仪器包括血样/体液分离芯片1、集成了纳米孔及存储了检测试剂的微流控芯片2、纳米孔检测电路系统3和系统采集控制系统4。

下面结合附图，对本发明进一步说明：

图1是本发明的单芯片基于纳米孔技术的hiv蛋白酶检测仪器结构图。其包括血样/体液分离芯片1、集成了纳米孔及存储了检测试剂的微流控芯片2、纳米孔检测电路系统3和系统采集控制系统4；血样/体液分离芯片1的血样/体液注入口101接收移液枪或者自动进样机加入的血样/体液样本，流入混合通道103与裂解通道102流入的裂解液混合，实现细胞裂解，混合溶液经过过滤膜104后，大分子样品被过滤并通过流入废液池106；没有被过滤掉的hiv蛋白酶205等小分子穿过过滤膜流入到分离后样品流出接口105，并经接口211流入到纳米孔上层溶液通道213，与预先加入的靶蛋白202混合反应，将靶蛋白剪切为两个短片段206，207，该短片段在纳米孔检测电路3的电场作用下穿过纳米孔，产生过孔信号，最终通过系统采集控制装置4计算得出hiv蛋白酶的含量，并最终显示到电脑终端或者手机终端。

图2是基于纳米孔技术的hiv蛋白酶检测原理图。该图中所用固态纳米孔201为氮化硅纳米孔和石墨烯纳米孔，纳米孔孔径为1nm-2nm；所述纳米孔芯片安装在集成了纳米孔及存储了检测试剂的微流控芯片2中，并由微流道系统将纳米孔两侧分为两个腔室。在系统加样之前在上层溶液中加入未被剪切的靶蛋白/蛋白长链202，该上层溶液与纳米孔的接触面积受到微针210的控制，实现噪声的最小化；这时检测电路3所检测到的电流信号为纳米孔的背景电流信号203和未被剪切的靶蛋白/蛋白长链所产生的过孔电流信号204；待血样/体液前处理芯片的含有hiv蛋白酶205的样品流入到上层溶液时，与靶蛋白202反应，产生剪切后的短蛋白a206和剪切后的短蛋白b207；对应检测电路3检测出短蛋白a所产生的电流过孔信号208和短蛋白b所产生的电流过孔信号209；通过系统采集装置4分析不同蛋白信号的频率，幅度和过孔时间，计算出样品中hiv蛋白酶的具体含量。

图3是血样/体液前处理芯片结构图。该芯片留有用户加入待测样品(血样/体液)的加样口101和裂解液注入口102，用户通过该入口加样；加入的样品在入口后方的103s型管道中混合反应，实现样品的细胞裂解，裂解后的溶液经过过滤膜104，滤掉大分子成分并直接通过废液池接口106流入废液池，而未被滤掉的包含由hiv蛋白酶的小分子溶液通过105接口流入到纳米孔检测芯片2。

图4是集成了纳米孔及存储了检测试剂的微流控芯片。该芯片的流道接口211与前处理芯片流出接口105连接，接收hiv蛋白酶样品溶液。芯片的最中间部分安装有加工有4个纳米孔的纳米孔芯片201，纳米孔的孔径尺寸为1-2nm，该芯片将缓冲溶液分为上下层溶液，上层溶液固定在210微针内，与纳米孔芯片微接触，接触面积小于5um²，将氮化硅芯片的信噪比提升了5倍(从原理的60pa提升到12pa,钳位电压为100mv)，每个微针内部嵌入一个电极，分别与下层溶液的公共电极构成4个纳米孔检测电路电极对，电极连接到芯片外沿的金手指电路，进而在芯片插入检测电路3时与系统电气连接。

图5是纳米孔检测系统电路结构图。该检测电路实现pa级的纳米孔电流信号检测，分为4路前置放大电路，4路锁相放大器，4路a/d转换器和高性能的arm内核mcu芯片几个模块。整个系统接收上位机装置的纳米孔信号测试参数，进而实现4个通道纳米孔的信号实时检测。该部分的灵活配置可以使得仪器的终端产品多样化：可以设计为单个模块，构成手持式的检测仪器，也可以设计为阵列模块，满足多通道(每个芯片为一个通道)的检测需求，每个检测通道分别处理，互不干扰，具体控制方式由仪器面板上的按钮控制或者上位机装置控制，其中上位机装置控制的优先级高于按钮控制。

图6是本发明中用于提高信噪比的玻璃微针的实物图和电镜图。分为尖端为1um(b1，b2)和尖端为0.3um(s1,s2)两种尺寸，其拉制参数如下：pipette-b1、b2拉制参数：p＝200,heat＝529,pull＝30,vel＝40,time＝250，pipette-s1、s2拉制参数：p＝200,heat＝530,pull＝80,vel＝70,del＝80；所采用的拉制仪器为sutter-97光纤拉制仪。两种类型pipette均适用于本发明的提高检测信噪比的需求。

图7是用于测试信号的石墨烯纳米孔在三种不同溶液浓度下的i-v曲线(1.8nm)。该图是使用fib结合电打孔的方法加工出来的石墨烯纳米孔，采用axon200b膜片钳进行iv扫描，得到了氯化钾(kcl)和离子液体(bmimci)缓冲液正交的三种iv曲线，即表明了该石墨烯纳米孔的孔径为1.8nm(溶液电导率11.53，膜厚0.35nm，电导9gs),又表明了离子溶液在石墨烯纳米孔中的减速效果。

图8是未加入hiv蛋白酶的纳米孔检测信号，其检测钳位电压为-200mv,包括(a)为固态纳米孔的背景信号片段；(b)为5μm多肽底物ffsqnypivq(204)在纳米孔(201)中的特征信号片段。

图9是加入了300ng/mlhiv蛋白酶205的纳米孔检测信号，其检测钳位电压为-200mv，包括a)0-10min和b)30-40min内引起的电流变化的幅值和信号数目的柱状图以及其相应的特征信号片段c)和d)。

在本专利中，基于纳米孔的体外hiv蛋白酶检测仪器及方法具体采用如下技术方案：

(1)固态纳米孔加工技术方案，其分别采用了两种方案加工1-2nm的固态纳米孔。一是采用fib(聚焦离子束)设备在薄膜上加工200nm左右的纳米孔，再将纳米薄膜(如石墨烯薄膜)转移到该200nm窗口上，进一步采用电击穿法打孔(如keithley2450源表)，进而制备出1-2nm的纳米孔；二是采用基于玻璃微管的精确定位纳米孔制备技术(该方法为项目组自行研究的设备及方案)，需要纳米操控平台和电打孔设备(如keithley2450)，可直接制备出1-2nm的纳米孔。

(2)提升固态纳米孔信噪比。在固态纳米孔一侧采用玻璃微管或者微流道接口控制缓冲溶液与纳米孔微接触(图2中210)，控制其溶液接触面积小于3.14um2,从而使得整个测量体系的电容指数下降，将在100mv电压下1.5nm固态纳米孔的噪声控制在10pa以内，进而满足了hiv蛋白酶测试的需求。

基于纳米孔的体外hiv蛋白酶检测仪器包括血样/体液分离芯片1、集成了纳米孔及存储了检测试剂的微流控芯片2、纳米孔检测电路系统3和系统采集控制系统4；所述血样/体液分离芯片1包括101：血样/体液注入口，102：裂解液注入口，103：混合流道，104：微米过滤膜，105：分离后样品流出接口，与211接口连接，106：废液池接口。其连接关系为101血样/体液注入口接收移液枪或者自动进样机加入的血样/体液样本，流入103混合通道与102裂解通道流入的裂解液混合，实现细胞裂解，混合溶液经过过滤膜104后，大分子样品被过滤并通过106流入废液池；没有被过滤掉的hiv蛋白酶205等小分子穿过过滤膜流入到105接口,与集成了纳米孔机存储了检测试剂的微流控芯片2的接口211连接；集成了纳米孔及存储了检测试剂的微流控芯片2包括211：样品入口/检测试剂注入口/缓冲液注入口，与105接口连接，212：缓冲液注入口，213：纳米孔上层溶液流道，214：纳米孔下层溶液流道，215：4通道电极(ag/agcl/pt与溶液连通，电路端采用金手指设计)，201：固态纳米孔，其连接关系为芯片2的流道接口211与前处理芯片流出接口105连接，接收hiv蛋白酶样品溶液，芯片的最中间部分安装有加工有4个纳米孔的纳米孔芯片201，纳米孔的孔径尺寸为1-2nm，该芯片将缓冲溶液分为上下层溶液，上层溶液固定在210微针内，与纳米孔芯片微接触，接触面积小于5um2，将氮化硅芯片的信噪比提升了5倍(从原来的60pa提升到12pa,钳位电压为100mv)，每个微针内部嵌入一个电极，分别与下层溶液的公共电极构成4个纳米孔检测电路电极对，电极连接到芯片外沿的金手指电路215，该金手指电路与纳米孔检测电路3电气连接；纳米孔检测电路系统3包括4路前置放大电路，4路锁相放大器，4路a/d转换器和高性能的arm内核mcu芯片几个模块，其连接关系为arm内核的mcu通过usb接口与上位机连接，接收上位机装置的纳米孔信号测试参数，进而通过4对电极215实现4个通道纳米孔的信号实时检测；系统采集控制系统4安装在手机等便携式终端和电脑终端。手机等便携式终端主要用于控制单通道(单个微流控芯片)的采集和结果处理，通过无线的方式与纳米孔检测电路系统连接；电脑终端可控制任意组合的纳米孔检测电路系统，并可以将检测结果进行深入分析，并于医院大系统连接，形成最终具有医学诊断价值的检测报表。

加工上述各个组成部分所需要的设备为固态纳米孔加工设备。

(1)基于fib和电击穿结合的纳米孔制备方法所需要设备：可提供ga束和he束的聚焦离子束设备(fib)，纳米薄膜转移设备(匀胶机等)，电打孔设备(如keithley2450)；

(2)基于玻璃微管的固态纳米孔加工方法所需要设备：具有10nm操作精度的纳米操控台，具有测试输出一体的电打孔设备(如keithley2450)以及玻璃微管拉制设备(如sutter2000)等。

申请人采用以上两种方法均能独立的加工满足需求的1-2nm的固态纳米孔。

使用上述基于纳米孔的体外hiv蛋白酶检测仪器的方法，其中基于fib和电击穿法结合的1-2nm固态纳米孔加工步骤具体如下：

(1)准备外观尺寸为5mm*5mm*300um的开窗为10um*10um的氮化硅纳米薄膜；

(2)采用fib(聚焦离子束)的ga束在(1)上加工200nm的纳米孔；

(3)准备石墨烯薄膜，将石墨烯薄膜固定在基片上，并在石墨烯薄膜上涂一层pmma；

(4)去除石墨烯生产的cu基底；

(5)将pmma/石墨烯转移到(2)中加工好的氮化硅芯片上，完全覆盖(2)加工的200nm纳米孔；

(6)烘干加热，加固石墨烯薄膜与氮化硅基片的结合力；

(7)使用丙酮去除pmma，最终形成石墨烯纳米孔薄膜；

(8)将制备好的石墨烯薄膜芯片放置于微流道芯片上，并注入缓冲液，在相应缓冲液中加入ag/agcl电极；

(9)连接电打孔设备(keithley2450)，并开启打孔装置，将目标设置到1-2nm范围，点击开始打孔；

(10)待打孔完成后，采用keithley2450等源表测试纳米孔的iv曲线，得到图7所示的i-v曲线图，确定纳米孔加工完成。

在上述技术方案，采用基于玻璃微管的精确定位纳米孔制备技术具体为：

(1)在玻璃微管(微针)内注入1m/l的licl缓冲溶液，并安装在具有10nm操作精度的纳米操作台上，并将打孔设备正电极置入玻璃微管中；

(2)将20nm的氮化硅薄膜芯片安装在流通池内，并在氮化硅开窗面注入1m/l的licl缓冲溶液，去除多余气泡，保证溶液与氮化硅薄膜的良好接触；

(3)将该流通池安装在玻璃微管正下方，将打孔设备负电极置入流通池licl中；

(4)通过显微镜观察，调节操作台，将玻璃微管调至氮化硅薄膜正上方3um以内；

(5)设置打孔参数，包括恒定电流大小(5na),膜厚(20nm)，电导率(6.54s/m),限制电压(25v)；

(6)点击打孔设备装置，开始打孔，同时控制操作台，缓慢逼近氮化硅薄膜，当玻璃微管与氮化硅薄膜接触(打孔设备电压会小于5v)时，停止打孔；

(7)测试iv曲线，得到孔径为1.2nm的氮化硅纳米孔。

本发明采用的具体细节如下：

(1)所述基于纳米孔的hiv蛋白酶检测方法是基于单分子的纳米孔检测技术在hiv蛋白酶检测上的应用，通过hiv蛋白酶对检测试剂中的蛋白长链的剪切作用，产生与剪切前的频率，幅度和过孔时间的不同信号，通过信号分析，进而计算出hiv蛋白酶的含量。

所述信号分析的依据为检测试剂中的蛋白长链，剪切后两段蛋白短链以及纳米孔孔径三个参数，并在各自的体系中通过分析剪切后所测信号的频率，幅度和过孔时间的三个维度信息，对应出加入样品hiv蛋白酶含量。

(2)制作样品前处理芯片，该芯片留有用户加入待测样品(血样/体液)的加样口，留有与集成了纳米孔及存储有检测试剂的微流控芯片连接的接口；

所述样品前处理芯片是采用微流控技术制作的集裂解，分离为一体的微流控芯片，分别将加入的样品进行裂解，在通过过滤膜分离，将待测溶液经与集成了纳米孔及存储有检测试剂的微流控芯片的连接接口输送到纳米孔检测芯片的一侧待测；将多余的溶液储存到该芯片上留有的废液池中。

(3)制作集成了纳米孔及储存有检测试剂的微流控芯片。该芯片的流道接口与样品前处理芯片出口连接，每个流道内嵌入了电极(agcl/ag或者pt或者au电极)，每个电极通过内嵌电路连接到芯片电气接口，电气接口采用金手指方式制作，与纳米孔检测电路系统电气接口连接；

所述纳米孔可以是固态纳米孔，所述纳米孔孔径尺寸为1-2nm范围。所述纳米孔的数量为4个，并分为四组电极分别连接。所述检测试剂为能够与hiv蛋白酶反应的蛋白试剂，其按一定比例配置，并有一定的储存条件和使用期限；所述微流道分为上下层微流道，实现纳米孔两侧溶液的连通，其中上层溶液的接触面积受微流道接口微针的控制，小于5um²,将系统检测信噪比指数倍提高。所述电气接口为类usb等5针的活拔插电气接口，实现4个纳米孔，5个电极的电气连接。

(4)制作纳米孔检测电路系统，检测4个纳米孔的电流信号，并将采集处理的信号传输给上位机处理；

所述纳米孔检测电路系统为pa级电路检测系统，该系统有4路前置放大电路，4路锁相放大器，4路a/d转换器，高性能基于arm内核的mcu芯片，大容量存储器和其他外围电路构成。该系统与集成了纳米孔及存储有检测试剂的微流控芯片的电气接口连接，分别采集4组电极的纳米孔检测信号，将4路信号进行数据处理，存储和分析，并最终通过无线的方式传输给手机等便携式终端或者以有线方式传输给电脑等终端处理器。该部分电路可以制作为单个模块，构成手持式的检测仪器，也可以制作为阵列模块，满足多通道(每个芯片为一个通道)的检测需求，每个检测通道分别处理，互不干扰，具体控制方式由仪器面板上的按钮控制或者上位机装置控制，其中上位机装置控制的优先级高于按钮控制。

(5)制作系统采集控制系统。该控制系统根据用户需求，通过传输协议，传递参数控制纳米孔检测电路系统的具体工作，并将后者反馈的结果根据最终测试需求进一步的处理分析，并根据需求提供检测结果和报表。

所述系统采集控制系统可以安装在手机等便携式终端版本和电脑终端版本。手机等便携式终端版本主要用于控制单通道(单个微流控芯片)的采集和结果处理，通过无线的方式与纳米孔检测电路系统连接；电脑终端版本可控制任意组合的纳米孔检测电路系统，并可以将检测结果进行深入分析，并于医院大系统连接，形成最终具有医学诊断价值的检测报表。

本发明分别以个人用户检测hiv病毒情况和医院集中检测样品hiv蛋白酶含量为例：

1,个人用户检测hiv病毒情况

(1)准备工作。1台图1中所示的单芯片基于纳米孔技术的hiv蛋白酶检测仪；1个安装有hiv蛋白酶检测仪配套的应用装置的智能手机或者平板电脑；1套芯片(包括前处理芯片和集成有纳米孔的微流控芯片)；1次性指尖采血针头，2根采血用毛细管和1个毛细管配套的橡皮头；

(2)打开hiv蛋白酶检测仪和应用装置，并连接成功；

(3)用针头刺破指头，用毛细管1采集指尖血，或者直接用毛细管1采集唾液；

(4)在毛细管1一端加上橡皮头，挤出溶液到接口101；

(5)在毛细管2上加上橡皮头，并插入213流道的出口端，将流道内溶液吸至出口端，即实现前处理芯片中的样品流入到纳米孔芯片上层溶液；

(6)将芯片1，2插入单芯片纳米孔检测系统3，点击应用装置中的开始按钮或者单芯片仪器上的检测按钮开始检测，并观察应用装置中的检测进度条；

(7)待进度条完成后，将检测结构以阴性阳性的直观结果告诉用户。

2，医院集中检测样品hiv蛋白酶含量

(1)准备工作。1台多芯片基于纳米孔技术的hiv蛋白酶检测仪；满足样品数量的多套芯片(包括前处理芯片和集成有纳米孔的微流控芯片)；已采集好的编码样品；

(2)打开hiv蛋白酶检测仪和应用装置，并与互联网连接成功；

(3)扫描1份样品的编码和1套芯片的编码，并按上例中的4-5步骤将样品加入到芯片1，2中；

(4)将芯片1，2插入多芯片纳米孔检测系统3的其中一个通道，点击应用装置中的开始按钮或者多芯片仪器上相应插槽对应的开始检测按钮，并观察应用装置中的检测进度条和相应通道的进度指示灯；

(5)重复3-4步骤，放入下一个检测样品和检测芯片；

(6)待相应通道的指示灯或者进度条显示检测完成后，将相应的结果打印和传输到医院系统，供病员打印观看或者医生查阅。

本发明具有如下的特点：

该hiv蛋白检测仪器包括血样/体液分离芯片，集成了纳米孔及存储了检测试剂的微流控芯片，纳米孔检测电路系统和系统采集控制系统几个部分。该检测仪器采用基于纳米孔的检测方法，检测hiv蛋白酶具体含量，大大的提高了hiv病毒的检测灵敏度；hiv蛋白酶的检测不受窗口期的影响，可以实现零窗口期的检测，大大的提高了hiv病毒的检测准确率；检测目标为hiv蛋白酶含量，与大部分hiv治疗药物的靶标物相同，可以用于药物治疗效果的评估；该仪器采用单通道或者多通道检测制作，相互独立，减小了样品污染的概率，可以实现即时检测，缩短了病毒的检测时间；该仪器可制作为便携式版本和多通道版本，适用于不同场合。与现有技术相比较，本发明具有的优点明显，具体如下：

采用基于纳米孔的检测方法，检测hiv蛋白酶具体含量，大大的提高了hiv病毒的检测灵敏度；

hiv蛋白酶的检测不受窗口期的影响，可以实现零窗口期的检测，大大的提高了hiv病毒的检测准确率；

检测目标为hiv蛋白酶含量，与大部分hiv治疗药物的靶标物相同，可以用于药物治疗效果的评估；

采用单通道或者多通道检测制作，相互独立，减小了样品污染的概率，可以实现即时检测，缩短了病毒的检测时间。

更进一步地，构建了完整的可供使用的hiv蛋白酶检测仪和方法。其与现有的几种常用检测技术的相比较，不仅仅检测时间大大缩短、相关检测费用显著下降。目前几种常用hiv检测技术与本专利技术的比较表见下表1。

本发明未详细阐述部分属于本领域技术人员的公知技术。以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

表1：目前几种常用hiv检测技术与本专利技术的比较表