一种抗坏血酸检测用显色剂以及检测抗坏血酸含量的方法与流程

本发明属于纳米材料和分析化学领域，具体涉及一种抗坏血酸检测用显色剂以及检测抗坏血酸含量的方法。
背景技术：
：抗坏血酸(ascorbicacid，aa)是一种水溶性的抗氧化剂，在氧化还原代谢反应中具有非常重要的调节作用。人体内缺乏aa会使胶原蛋白合成受阻，诱发坏血病，同时还会阻碍外伤患者伤口的愈合。鉴于其独特的临床价值，准确测定抗坏血酸的含量，对于人体抗老化、疾病的预防具有十分重要意义。目前，抗坏血酸常见的分析方法有容量滴定法、高效液相色谱法、荧光法、表面增强共振拉曼散射法等。然而这些方法存在所需仪器昂贵、前处理复杂、检测成本高、灵敏度较差、重现性不好、不适合大量样品的快速筛查等问题。基于纳米材料的比色分析检测技术因具有分析成本低、步骤简单、肉眼可辨等优点而被广泛使用。如申请公布号为cn106940314a的中国专利申请文件公开了一种抗坏血酸检测用的显色剂及其制备方法，该显色剂由羟基氧化钴纳米片悬浮液与3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(tmb)混合制得，其中羟基氧化钴纳米片与tmb的摩尔比为2:1。显色剂与抗坏血酸混合，反应体系由蓝色变为无色，根据上述颜色特性利用紫外-可见分光光度计来测定aa的含量。由于检测aa时颜色变化是由蓝色变为无色，而变为无色之后则无法进行吸光度测试，因此需采用较高含量的tmb来确保检测过程中反应体系不会变为无色。但是高纯度的tmb价格较高，使得显色剂的生产成本较高，不利于大量抗坏血酸样品的检测。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种成本较低的抗坏血酸检测用显色剂。本发明的目的还在于提供一种检测抗坏血酸含量的方法，该方法操作简单并且成本低。为实现上述目的，本发明的抗坏血酸检测用显色剂采用的技术方案为：一种抗坏血酸检测用显色剂，包括羟基氧化钴、硫氰酸盐以及吐温80。本发明的显色剂中羟基氧化钴作为氧化剂，直接与抗坏血酸发生氧化还原反应生成二价钴离子，二价钴离子与硫氰酸盐中的硫氰酸根配位生成具有颜色的硫氰酸钴(ⅱ)络合物。吐温80能够稳定硫氰酸钴(ⅱ)配合物，使显色剂颜色稳定。其中硫氰酸盐与吐温80均为常规市售化学试剂，价格便宜。本发明所用羟基氧化钴可根据现有技术的合成方法制备，也可以由包括以下步骤的方法制得：将naoh溶液加入到cocl2溶液中，混合液超声处理1～2min。然后，将次氯酸钠溶液加入到混合液中，继续超声处理8～12min。产物离心，用蒸馏水洗涤，重复离心洗涤，即得。本发明的显色剂由羟基氧化钴试剂、硫氰酸盐试剂以及吐温试剂三者混合得到。为使用方便，优选的，显色剂由羟基氧化钴试剂、硫氰酸盐试剂以及吐温80试剂中任意两种的混合试剂与另一试剂混合得到。进一步优选的，显色剂为羟基氧化钴试剂、硫氰酸盐试剂与吐温80试剂三者的混合试剂。其中羟基氧化钴试剂为固体羟基氧化钴或者羟基氧化钴的悬浮液。硫氰酸盐试剂为固体硫氰酸盐或硫氰酸盐溶液。吐温80试剂为纯的吐温80或吐温80的溶液。为保证颜色变化明显，羟基氧化钴、硫氰酸盐以及吐温80的质量比为(9～18μg)：(2～10mg)：(1～10mg)。为保证没有其他颜色的干扰，所述硫氰酸盐为硫氰酸铵、硫酸氰钠、硫酸氰钾中的至少一种。本发明的检测抗坏血酸含量的方法采用的技术方案为：一种检测抗坏血酸含量的方法，包括以下步骤：将待测样品与羟基氧化钴、硫氰酸盐、吐温80混合，然后测定吸光度，之后根据测得的吸光度以及标准工作曲线计算待测样品中抗坏血酸的含量；所述羟基氧化钴、硫氰酸盐以及吐温80的质量比为(9～18μg)：(2～10mg)：(1～10mg)。本发明的检测方法先将待测样品与羟基氧化钴、硫氰酸盐以及吐温80混合，在混合过程中发生了反应并出现颜色变化，之后根据混合后得到的混合物的吸光度的变化确定待测样品中抗坏血酸的含量。本发明的检测方法操作简单，耗时较短且成本较低，适用于大量抗坏血酸样品的检测。所述硫氰酸盐为硫氰酸铵、硫酸氰钠、硫酸氰钾中的至少一种。由于不同浓度的硫氰酸钴(ⅱ)具有不同的颜色，而反应时间影响二价钴离子的生成量，优选的混合的时间为1～10min。进一步优选的，混合的时间为3～7min。附图说明图1为本发明所用羟基氧化钴的tem图；图2为本发明的抗坏血酸比色检测时的紫外-可见吸收光谱，其中曲线ⅰ为羟基氧化钴纳米片悬浮液的紫外-可见吸收光谱，曲线ⅱ为羟基氧化钴与抗坏血酸反应后的紫外-可见吸收光谱，曲线ⅲ为羟基氧化钴纳米片悬浮液中加入硫氰酸盐和吐温80后的紫外-可见吸收光谱，曲线ⅳ为羟基氧化钴悬浮液中加入抗坏血酸、硫氰酸盐和吐温-80后的紫外-可见吸收光谱；图3为本发明的检测方法检测抗坏血酸时的标准工作曲线图。具体实施方式以下实施例中所用羟基氧化钴由包括以下步骤的方法制得：将125μl的naoh(1mol/l)溶液加入到500μl的cocl2(10mmol/l)溶液中，混合液超声处理1min。然后，将25μl的次氯酸钠(0.9mol/l)溶液加入到混合液中，继续超声处理10min。产物离心，用蒸馏水洗涤，重复离心洗涤三次，即得。将制得的羟基氧化钴进行tem(仪器为hitachih-8100em(日本日立)，加速电压为200kv)，测试结果如图1所示。由图1可知，采用上述方法制得的羟基氧化钴为纳米级的片状结构。下面结合具体实施例及附图对本发明作进一步说明。一、显色剂的实施例实施例1本实施例的显色剂，为羟基氧化钴、硫氰酸铵和吐温80的混合水溶液，羟基氧化钴、硫氰酸铵与吐温80的质量比为9.2μg：6.8mg：8mg。实施例2本实施例的显色剂，包括羟基氧化钴悬浮液，硫氰酸钠和吐温80，三者的质量比为15μg：1mg：10mg。本实施例的显色剂在使用时将羟基氧化钴悬浮液、硫氰酸铵以及吐温80混合即可。实施例3本实施例的显色剂，包括硫氰酸铵和吐温80的混合液，羟基氧化钴，二者的质量比为18μg：9.5mg：1mg。本实施例的显色剂在使用时将硫氰酸铵和吐温80的混合液与羟基氧化钴混合即可。二、检测抗坏血酸含量的方法的实施例本发明采用的标准工作曲线由包括以下的方法确定：将0.46mg羟基氧化钴分散在1ml水溶液中，得羟基氧化钴悬浮液；取20μl羟基氧化钴悬浮液，分别加入不同浓度的抗坏血酸标准溶液180μl，混合反应5min后，依次加入80μl的吐温80水溶液(10wt％)和30μl的硫氰酸铵(3mol/l)，补加蒸馏水至500μl后混匀，然后测定波长为625nm处的吸光度(所用分光光度计为cary100uv-vis分光光度计(varian，usa))，然后绘制标准工作曲线，如图3所示，标准工作曲线的线性回归方程为a＝6.38×10-2c+4.2×10-2(a为625nm处的可见光吸光度，c为aa浓度(mmol/l))，其相关系数r2为0.993。以下实施例所用维生素c片溶出液由以下方法制备：称量5片会通维生素c片，结果为：平均每片质量为0.122g，每片维生素含量为0.1g。取一片研磨成细粉，溶入10ml水中，然后滤去不溶物，即得。维生素c片中抗坏血酸的理论浓度为56.78mmol/l。实施例4本实施例的抗坏血酸的检测方法，包括以下步骤：将0.46mg羟基氧化钴分散在1ml水溶液中，得羟基氧化钴悬浮液；然后向20μl的羟基氧化钴悬浮液中加入10μl维生素c片溶出液，混合后反应7min，然后，依次加入80μl的吐温80水溶液(10wt％)和30μl的硫氰酸铵(3mol/l)，补加蒸馏水至500μl后混匀，然后测定波长为625nm处的吸光度，然后结合标准工作曲线确定待测样品中抗坏血酸的浓度。实施例5本实施例的抗坏血酸的检测方法，包括以下步骤：将0.46mg羟基氧化钴分散在1ml水溶液中，得羟基氧化钴悬浮液；然后将20μl的羟基氧化钴悬浮液、80μl的吐温80水溶液(10wt％)和30μl的硫氰酸铵(3mol/l)混合后加入10μl维生素c片溶出液，搅拌10min补加蒸馏水至500μl后混匀，然后测定波长为625nm处的吸光度，然后结合标准工作曲线确定待测样品中抗坏血酸的浓度。测试结果为：两次测量得到的抗坏血酸浓度均约为50.7mmol/l，相对偏差为10.7％。考虑到不溶物的影响，测量偏差在容许范围内。测试结果表明，本发明的测试分析方法具有较高的准确度以及较好的重复性。试验例1对羟基氧化钴悬浮液(羟基氧化钴的浓度为18μg/ml)进行紫光-可见分析测试，其紫外-可见吸收光谱如图2中的曲线ⅰ所示。向羟基氧化钴悬浮液(羟基氧化钴的浓度为18μg/ml)中加入抗坏血酸溶液(浓度为1mmol/l)反应5min后进行紫外-可见分析测试，其紫外-可见吸收光谱如图2中的曲线ⅱ所示。向羟基氧化钴悬浮液(羟基氧化钴的浓度为18μg/ml)中加入硫氰酸盐和吐温80后进行紫光-可见分析测试，其紫外-可见吸收光谱如图2中的曲线ⅲ所示。向羟基氧化钴悬浮液(羟基氧化钴的浓度为18μg/ml)中加入抗坏血酸溶液(浓度为1mmol/l)反应5min后，依次加入硫氰酸盐和吐温80后进行紫光-可见分析测试，其紫外-可见吸收光谱如图2中的曲线ⅳ所示。由图2可知，羟基氧化钴悬浮液本身无明显吸收峰(曲线ⅰ)；羟基氧化钴与抗坏血酸反应后无明显吸收峰(曲线ⅱ)，表明反应生成的二价钴离子没有颜色；羟基氧化钴与吐温80、硫氰酸铵混合后同样没有明显的吸收峰(曲线ⅲ)，表明羟基氧化钴本身与吐温80以及硫氰酸铵之间不发生反应；而只有羟基氧化钴与抗坏血酸反应后，再与吐温80、硫氰酸铵混合后具有明显的吸收峰，证明二价钴离子与硫氰酸铵结合生成的硫氰酸钴(ⅳ)显色产生比色信号，并且吸收峰在625nm处的吸光度达到最大。试验例2本试验例研究了羟基氧化钴与抗坏血酸反应时间对检测结果的影响，具有过程如下：将0.46mg羟基氧化钴分散在1ml水溶液中，得羟基氧化钴悬浮液；然后向20μl羟基氧化钴悬浮液中加入50μl抗坏血酸标准溶液(浓度为10mmol/l)，混合后反应，然后，依次加入80μl的吐温80水溶液(10wt％)和30μl的硫氰酸铵(3mol/l)，补加蒸馏水至500μl后混匀，然后测定625nm处的吸光度。具体混合后反应后的时间以及检测结果如表1所示。表1不同反应时间条件下吸光度反应时间/min吸光度10.31330.40450.41870.422由表1可知，在反应3min后溶液的吸光度基本保持不变，表明羟基氧化钴与抗坏血酸的反应速率较快。优选的，反应时间为3～7min。试验例3本试验例研究了采用不同量的吐温80对检测结果的影响，具体过程如下：将0.46mg羟基氧化钴分散在1ml水溶液中，得羟基氧化钴悬浮液；然后向20μl羟基氧化钴悬浮液中加入50μl抗坏血酸标准溶液(浓度为10mmol/l)，混合后反应5min，然后，依次加入吐温80水溶液(10wt％)和30μl的硫氰酸铵(3mol/l)，补加蒸馏水至500μl后混匀，然后测定625nm处的吸光度。加入的吐温80的量以及检测结果如表2所示。表2添加不同体积的吐温80条件下的吸光度吐温80/μl吸光度100.126500.275800.3721000.377由表2可知，在吐温80加入的量较少时，反应生成的硫酸氰钴配合物不稳定，存在分解使得吸光度较低；随着吐温80加入的量的增多，使得硫酸氰钴配合物结构变得稳定，保持吸光度稳定。优选的，吐温80溶液的添加体积为至少为80μl即吐温80的质量为8mg。优选的，吐温80的添加质量为8～10mg。试验例4本试验例研究了采用不同量的硫氰酸铵对检测结果的影响，具体过程如下：将0.46mg羟基氧化钴分散在1ml水溶液中，得羟基氧化钴悬浮液；然后向20μl羟基氧化钴悬浮液中加入50μl抗坏血酸标准溶液(浓度为10mmol/l)，混合后反应5min，然后，依次加入80μl的吐温80水溶液(10wt％)和硫氰酸铵(3mol/l)，补加蒸馏水至500μl后混匀，然后测定625nm处的吸光度。加入的硫氰酸铵的量以及检测结果如表3所示。表3添加不同体积的硫氰酸铵条件下的吸光度硫氰酸铵/μl吸光度100.126200.203300.318400.323由表3可知，为保证二价钴离子全部与硫氰酸根配位，加入的硫氰酸铵的量至少为30μl即6.84mg。因此优选的，硫氰酸铵的添加量为6.8～9.5mg。当前第1页12