一种测定海藻类制品中无机砷含量的方法与流程

本发明涉及食品检测技术领域，具体的说，是涉及一种测定海藻类制品中无机砷含量的方法。

背景技术：

在水产生物(包括动物和植物)体内，砷以复杂多样的形态而存在，主要包括有机砷和无机砷两种，其中有机砷大多无毒或毒性较小，而无机砷[包括as(iii)和as(v)]具有很高的毒性和致癌作用，因此测定无机砷的含量基本能够作为评价水产制品有毒砷的标准。水产生物对砷具有很强的富集能力，尤其是毒性很高的无机砷，所以精确、快速检测水产制品中无机砷的含量日益受到人们的广泛关注，而且这对保障人们的健康和安全尤为重要。

现有技术中，国内关于检测食品中无机砷的方法还不是很完善，特别是针对海藻类制品中无机砷含量的检测。gb5009.11-2014《食品安全国家标准食品中总砷及无机砷的测定》于2016年3月21日开始实施，代替了旧标准gb/t5009.11-2003《食品中总砷及无机砷的测定》,但是新标准中所规定的无机砷含量测定方法仅适用于稻米、水产动物、婴幼儿谷类辅助食品、婴幼儿罐装辅助食品中无机砷含量的测定，并不适用于水产植物尤其是海藻类产品中无机砷含量的测定。目前海藻类产品中无机砷含量的测定均需用到c18免疫亲和柱进行净化，但是在实际的净化过程中，仍出现了过滤效率低且无法消除色素的干扰，这对大型定量仪器具有很大的伤害。另外，研究发现海藻类制品中砷甜菜碱的色谱峰常常会掩盖三价砷的色谱峰，从而造成无法准确定量海藻类制品中三价砷的含量。

技术实现要素：

为了克服现有的技术的不足,本发明提供一种测定海藻类制品中无机砷含量的方法。

本发明技术方案如下所述：

1、一种测定海藻类制品中无机砷含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a、消解步骤：

称取粉碎干燥后的待测海藻类制品，放于第一离心管中，加入硝酸，摇匀，得到混合溶液；

b、提取步骤：

将所述混合溶液置于恒温水浴震荡槽中浸提，间隔将所述第一离心管取出振摇；

将水浴后的所述第一离心管拿出冷却至室温后，于离心机离心，取离心后所述第一离心管的上层清液于第二离心管中，加入正己烷，涡旋振摇，于所述离心机中离心，此步骤重复1～2次；

c、净化步骤：

合并上述步骤中离心后所述第二离心管的下层清液于的第三离心管中，加入活性炭和c18混合粉，涡旋振荡，于所述离心机中离心，取离心后所述第三离心管的上层清液于有机滤膜中过滤，获得待测样液；

d、测试步骤：

利用液相色谱原子荧光联用仪对所述，获得所述待测样液进行定量测试，并采用外标法计算待测海藻类制品中无机砷的含量。

优选的，其特征在于，所述测试步骤中，所述液相色谱仪的第一流动相为1mmol/l磷酸二氢铵溶液，所述磷酸二氢铵溶液的ph＝10.0，第二流动相为20mmol/l磷酸二氢铵溶液，所述磷酸二氢铵溶液的ph＝8.5。

优选的，其特征在于，通过添加氨水调节所述第一流动相和所述第二流动相的ph值，采用梯度洗脱的方式对所述待测样液中目标物进行洗脱分离。

优选的，其特征在于，所述第一流动相和所述第二流动相的流速为1.0ml/min，进样量为150μl。

优选的，其特征在于，所述测试步骤中，所述液相色谱仪采用的色谱柱为as19阴离子柱。

优选的，其特征在于，所述as19阴离子柱的长度为250mm，内径为4mm，填料颗粒直径为1.7μm。

优选的，其特征在于，所述净化步骤中，所述活性炭和所述c18混合粉的质量比为3：1。

优选的，其特征在于，所述净化步骤中，所述有机滤膜为0.45μm有机滤膜。

优选的，其特征在于，所述消解步骤，所述待测海藻类制品为1.0g，采用的所述第一离心管为50ml，加入的所述硝酸为10ml浓度为0.15mol/l的硝酸。

优选的，其特征在于，所述原子荧光分光光度计的工作条件：负高压为270v，as灯电流为60ma，载气流量为400ml/min，屏蔽气流量为800ml/min，载流为体积分数为5％的盐酸溶液，还原剂为15g/l的硼氢化钾和含量为0.5％的氢氧化钾溶液。

本发明的实质性效果：本发明对海藻类制品中无机砷的提取及净化方法进行了改进，净化后的清液直接上机并利用优化的液相色谱-原子荧光光谱联用法进行检测，显著提高了前处理效率，消除了海藻类制品中色素的干扰，避免了砷甜菜碱色谱峰掩盖三价砷色谱峰造成无法准确定量无机砷含量的影响，检测的准确度高，操作方法方便快捷，检测效率高。

附图说明

图1为本发明一实施例为在不同浓度的硝酸中待测海藻类制品的三价砷和五价砷回收率示意图；

图2为本发明一实施例在不同净化剂中待测海藻类制品的三价砷和五价砷回收率图；

图3为本发明一实施例使用阴离子分析柱(4.6mm×50mm，1.7μm)测试下待测海藻类制品中四种砷形态的出峰效果图；

图4为本发明一实施例使用as19阴离子柱(4mm×250mm，1.7μm)测试下待测海藻类制品中四种砷形态的出峰效果图。

图5为本发明一实施例第一流动相和第二流动相ph值为9.0和8.0测试下待测海藻类制品中四种砷形态的出峰效果图。

图6为本发明一实施例第一流动相和第二流动相ph值为10.0和8.5测试下待测海藻类制品中四种砷形态的出峰效果图。

图7为本发明一实施例待测海藻类制品中添加混合标准溶液测试下四种砷形态的出峰效果图。

具体实施方式

下面结合附图以及实施方式对本发明进行进一步的描述：

如图1-7所示，一种测定海藻类制品中无机砷含量的方法，包括以下步骤：

a、消解步骤：

称取1.0±0.05g粉碎干燥后的待测海藻类制品，放于50ml～100ml第一离心管中，加入10ml～15ml浓度为0.15mol/l的硝酸，摇匀，得到混合溶液。

b、提取步骤：

(1)将混合溶液置于恒温水浴震荡槽中浸提2h～2.5h，温度控制在90℃～95℃，期间每隔25min～30min，将第一离心管取出振摇0.5min～1min；

(2)将水浴后的第一离心管拿出冷却至室温后，于离心机中8000r/min～10000r/min离心10min～15min，取10ml离心后第一离心管的上层清液于50ml第二离心管中，加入10ml～15ml正己烷，涡旋振摇0.5min～1min，于离心机中8000r/min～10000r/min离心10min～15min，此步骤重复1～2次。

c、净化步骤：合并上述步骤中离心后第二离心管的下层清液于50ml～100ml的第三离心管中，加入活性炭和c18混合粉，涡旋振荡1min～2min，与离心机中8000r/min～10000r/min离心5min～10min，取1ml离心后第三离心管的上层清液于有机滤膜中过滤，获得待测样液。

d、测试步骤：

利用液相色谱原子荧光联用仪对待测样液进行定量测试，并采用外标法计算待测海藻类制品中无机砷的含量。

优选的，测试步骤中，液相色谱仪的第一流动相为1mmol/l磷酸二氢铵溶液，磷酸二氢铵溶液的ph＝10.0，第二流动相为20mmol/l磷酸二氢铵溶液，磷酸二氢铵溶液的ph＝8.5。

优选的，通过添加氨水调节第一流动相和第二流动相的ph值，采用梯度洗脱的方式对待测样液中目标物进行洗脱分离，流动相梯度如下表1所示：

表1

优选的，第一流动相和第二流动相的流速为1.0ml/min，进样量为150μl。

优选的，测试步骤中，液相色谱仪采用的色谱柱为as19阴离子柱。

优选的，as19阴离子柱的长度为250mm，内径为4mm，填料颗粒直径为1.7μm。

优选的，净化步骤中，活性炭和c18混合粉的质量比为3：1。

优选的，净化步骤中，有机滤膜为0.45μm有机滤膜。

优选的，消解步骤，待测海藻类制品为1.0g，采用的第一离心管为50ml，加入的硝酸为10ml。

优选的，原子荧光分光光度计的工作条件：负高压为270v，as灯电流为60ma，载气流量为400ml/min，屏蔽气流量为800ml/min，载流为体积分数为5％的盐酸溶液，还原剂为15g/l的硼氢化钾和含量为0.5％的氢氧化钾溶液。

本发明实施例一中，选取不同浓度的消解液进行测试效果比较，包括以下步骤：

a、消解步骤：

称取1.0g粉碎干燥后的待测海藻类制品，放于50ml第一离心管中，加入10ml不同浓度的硝酸，摇匀，得到混合溶液；

此实施例中，分别选取了浓度为0.05mol/l、0.10mol/l、0.15mol/l、0.20mol/l、0.25mol/l硝酸作为消解液。

b、提取步骤：

(1)将混合溶液置于恒温水浴震荡槽中浸提2.5h，温度控制在90℃，期间每隔30min，将第一离心管取出振摇1min；

(2)将水浴后的第一离心管拿出冷却至室温后，于离心机中8000r/min离心10min，取10ml离心后第一离心管的上层清液于50ml第二离心管中，加入10ml正己烷，涡旋振摇0.5min，于离心机中8000r/min离心10min，此步骤重复2次；

c、净化步骤：合并上述步骤中离心后第二离心管的下层清液于50ml的第三离心管中，加入质量比为3：1的活性炭和c18混合粉，涡旋振荡1min，与离心机中8000r/min离心5min，取1ml离心后第三离心管的上层清液于0.45μm有机滤膜中过滤，获得待测样液；

d、测试步骤：

利用液相色谱原子荧光联用仪对待测样液进行定量测试，并采用外标法计算待测海藻类制品中无机砷的含量。

测试中，液相色谱仪的第一流动相为1mmol/l磷酸二氢铵溶液，磷酸二氢铵溶液的ph＝10.0，第二流动相为20mmol/l磷酸二氢铵溶液，磷酸二氢铵溶液的ph＝8.5。通过添加氨水调节第一流动相和第二流动相的ph值，采用梯度洗脱的方式对待测样液中目标物进行洗脱分离，流动相梯度如下表1所示。第一流动相和第二流动相的流速为1.0ml/min，进样量为150μl。液相色谱仪采用的色谱柱为as19阴离子柱。

原子荧光分光光度计的工作条件：负高压为270v，as灯电流为60ma，载气流量为400ml/min，屏蔽气流量为800ml/min，载流为体积分数为5％的盐酸溶液，还原剂为15g/l的硼氢化钾和含量为0.5％的氢氧化钾溶液。

测试中，生产的四种砷形态的标准溶液用0.15mol/l硝酸稀释成2μg/l、5μg/l、8μg/l、10μg/l、15μg/l的标准系列工作溶液，以标准系列工作液中四种砷形态的浓度与对应的峰面积绘制标准曲线。

回收率r的计算：r＝(xi/xs)×100％，其中xi是加标样品中目标化合物的峰面积，xs是目标化合物标准品的峰面积。

本实施例中选用不同浓度(0.05mol/l、0.10mol/l、0.15mol/l、0.20mol/l、0.25mol/l)的硝酸作为消解液，采用外标法对待测海藻制品中无机砷进行检测，结果如图1所示，综合各种因素发现0.15mol/l的硝酸消解效果是最佳的。

本发明实施例二中，选取不同净化剂进行测试效果比较，具体的如上述实施例一的方法，以0.15mol/l的硝酸作为消解试剂，分别选取活性炭、c18粉、中性氧化铝、psa、质量比为3：1的活性炭-c18混合粉作为净化试剂，比较不同净化剂对三价砷和五价砷的测定效果。结果如图2所示，发现选用质量比为3：1的活性炭-c18混合粉作为净化试剂时效果最好。

本发明实施例三中，选取不同色谱柱进行测试效果比较，具体的如上述实施例一的方法，以0.15mol/l的硝酸作为消解试剂，选用质量比为3：1活性炭-c18混合粉作为净化试剂，分别采用常见的色谱柱和as19阴离子柱(4mm×250mm，1.7μm)，比较不同色谱柱对四种砷形态的出峰效果，结果如图3和图4所示。发现当使用as19阴离子柱时，能够使得三价无机砷和二甲基砷酸出峰顺序互换，避免了因砷甜菜碱的色谱峰掩盖三价无机砷的色谱峰造成无法准确定量无机砷含量影响。

本发明实施例四中，测试不同ph值流动相对四种砷形态出峰的影响，具体的如上述实施例一的方法，以0.15mol/l的硝酸作为消解试剂，选用质量比为3：1的活性炭-c18混合粉作为净化试剂，采用as19阴离子柱，第一流动相为1mmol/l磷酸二氢铵溶液，第二流动相为20mmol/l磷酸二氢铵溶液，通过添加氨水调节第一流动相和第二流动相的ph值使其为9.0和8.0、10.0和8.5，测定不同ph值流动相对三价砷和五价砷峰形的影响，结果如图5和图6所示。结果表明当第一流动相的ph值为10.0，第二流动相的ph值为8.5时，峰形最好。

本发明实施例五中，为检测待测海藻制品中无机砷包括三价砷和五价砷的液相色谱-原子荧光联用(lc-afs)检测方法，具体的如上述实施例一至四的优选的实验条件及仪器参数，测定三价砷和五价砷在待测海藻制品中的含量，以其平均回收率和精密度作为检测效果的判断指标。

在测试步骤中，分别精密吸取4种砷形态标准溶液各10μl，用一级水定容至10ml，配成混标储备溶液。吸取一定量的上述溶液，使用0.15mol/l硝酸稀释成2μg/l、5μg/l、8μg/l、10μg/l、15μg/l系列混合标准溶液，按上述设置仪器参数，以四种砷形态响应值对应的浓度绘制标准曲线(见图7)，得到标准曲线方程，结果表明，该方法线性关系良好，检出限低，结果如下表2所示：

表2四种砷形态的线性方程及线性相关系数

按上述实验条件进行样品加标回收测定该方法的精密度和回收率，结果如下表3和表4所示。测定其回收率均在80.2％-100.7％之间，说明此前处理方法回收率良好；精密度在4.0％-7.7％之间，说明此前处理方法精密度良好。结合二者数据可以看出此方法能很好的应用于海带样品中无机砷的检测。

表3三价砷的回收率和精密度

表4五价砷的回收率和精密度

本发明的实质性效果：本发明对海藻类制品中无机砷的提取及净化方法进行了改进，净化后的清液直接上机并利用优化的液相色谱-原子荧光光谱联用法进行检测，显著提高了前处理效率，消除了海藻类制品中色素的干扰，避免了砷甜菜碱色谱峰掩盖三价砷色谱峰造成无法准确定量无机砷含量的影响，检测的准确度高，操作方法方便快捷，检测效率高。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

上面结合附图对本发明专利进行了示例性的描述，显然本发明专利的实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明专利的方法构思和技术方案进行的各种改进，或未经改进将本发明专利的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围内。