基于液相色谱-质谱的中药养护贴有效成分检测分析方法与流程

本发明属于中草药成分检测
技术领域：
，特别是涉及一种基于液相色谱-质谱的中药养护贴有效成分检测分析方法。
背景技术：
：中药养护贴是一种含有多种中药提取物和粉碎物的护理贴垫，具有抗炎、抗菌和促进组织修复功能，对生殖系统具有养护功效。针对中药养护贴中代表性九种关键有效成分，建立一种中药养护贴的检测分析方法，通过对中药养护贴中关键有效成分分析，鉴定其功能效果，选取的九种成分分别为：绿原酸、紫丁香苷、芦丁、毛蕊异黄酮、槲皮素、木犀草素、山奈酚、高车前素、蛇床子素；九种代表性关键有效成分功能如下：绿原酸：提取自忍冬科植物忍冬的干燥花蕾或带初开的花，具有抗菌、抗病毒、增高白血球、保肝利胆、抗肿瘤、降血压、降血脂、清除自由基和兴奋中枢神经系统等作用。紫丁香苷：是一种强的抗肝毒药物，具有止血、恢复微粒体酶系统的酶活性及抑制脂质过氧化作用，可以促进肝毒物代谢，并改善肝功能，使之正常化。芦丁：有维生素p样作用、抗炎作用、抗自由基作用、抗脂质过氧化作用、拮抗血小板活化因子作用和抗急性胰腺炎作用等。毛蕊异黄酮：提高免疫功能，增强抗氧化、抗辐射和抗癌作用，保护心脑血管、肝脏、肾脏和肺脏作用，保护脑细胞、提高记忆力，抗菌及抑制病毒作用，降血脂、降血糖、减少糖尿病并发症等。槲皮素：具有较好的祛痰、止咳作用，并有一定的平喘作用。还有降低血压、增强毛细血管抵抗力、减少毛细血管脆性、降血脂、扩张冠状动脉，增加冠脉血流量等作用。木犀草素：临床主要用于止咳、祛痰、消炎、降尿酸、治疗心血管疾病、治疗“肌萎缩性脊髓侧索硬化症”、sars、肝炎等。用于治疗copd、支气管哮喘、慢性咽炎、变应性鼻炎等引起的慢性咳嗽。山奈酚：具有良好的抗菌活性，能抑制与儿童髓母细胞瘤生长和转移有关的肝细胞生长因子(hgf)及其受体酪氨酸蛋白激酶。高车前素：是从菊科植物毛莲蒿中提取出来的抗炎类成分，具有抗炎、抗氧化、保肝、抑制血管生成等多种药理活性，在防治糖尿病、预防和治疗脑中风、治疗脂肪蓄积病症方面发挥了重要的作用。蛇床子素：具有解痉、降血压、抗心律失常、增强免疫功能及广谱抗菌作用，用于阳痿、宫冷、不孕、寒湿带下、湿鼻腰痛；外治外阴湿疹，妇人阴痒，滴虫性阴道炎。现提供一种基于液相色谱-质谱的中药养护贴有效成分检测分析方法，针对上述的中药养护贴中的九种关键有效成分进行快速检测分析。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种基于液相色谱-质谱的中药养护贴有效成分检测分析方法，通过使用液相色谱-串联三重四极杆质谱联用仪，建立中药养护贴中绿原酸、紫丁香苷、芦丁、毛蕊异黄酮、槲皮素、木犀草素、山奈酚、高车前素、蛇床子素九种关键有效的定量方法，利用九种关键有效成分标准品进行仪器分析方法优化，包括液相色谱条件优化、质谱检测条件及质谱参数优化，使九种化合物峰形对称并能达到基线分离，同时使得质谱能够准确定性，而且定量灵敏度达到最优。为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：本发明为一种基于液相色谱-质谱的中药养护贴有效成分检测分析方法，包括以下步骤：ss01：选取液相色谱柱并设定质谱条件、参数；s011：色谱柱选用：agilentzorbaxeclipseplusc18，2.1mm×150mm×5μm，设定色谱柱温度为30℃，设定流动相及流动相梯度，其中，水相a：0.01％甲酸水、有机相b：甲醇；s012：设定质谱条件：离子源为esi离子源(电喷雾离子源)，离子源温度为350℃，雾化器工作压力为35psi，干燥气流速为9l/min；s013：设定质谱定性定量检测模式：正离子模式、多反应监测模式(mrm)，设定多反应监测模式参数；ss02：标准储备溶液制备s021：分别准确称取0.1g的中药养护贴中九种关键有效成分的标准品，称量精确至0.0001g；s022：用甲醇溶解后分别转移至50ml容量瓶中，定容，分别配制出2000μg/ml的九种关键有效成分的标准储备液；ss03：系列标准溶液制备s031：分别准确量取九种关键有效成分的标准储备液，用含50％甲醇的水溶液配制成浓度分别为0.01μg/ml、0.05μg/ml、0.1μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml的九种关键有效成分的系列混合标准溶液；ss04：通过九种关键有效成分标准溶液进行仪器分析方法优化，获得优化后的lc-ms/ms绝对定量分析方法，其中，所述仪器为液相色谱-串联三重四极杆质谱联用仪；ss05：样品前处理s051：取中药养护贴填充精华素0.2g于10ml离心管中，加入4ml提取溶剂，超声提取30min，离心20min，取上清；其中，离心转速为3000rpm；s052：向步骤s051的沉淀中再加入4ml提取溶剂，超声提取30min，离心20min，取上清；ss06：合并步骤s051、s052中的上清提取液，取1ml过0.22μm滤膜，对滤液进行上机测试；ss07：绘制标准曲线，根据建立的lc-ms/ms绝对定量分析方法对中药养护贴中九种关键有效成分进行分析评价，获取九种关键有效成分在中药养护贴中含量结果，并根据结果对中药养护贴测试结果分析。进一步地，所述提取溶剂为含50％甲醇的水溶液。进一步地，所述步骤ss04中仪器分析方法优化包括液相色谱条件优化、质谱检测条件及质谱参数优化，使九种化合物峰形对称并能达到基线分离，同时使得质谱能够准确定性，而且定量灵敏度达到最优。进一步地，所述步骤ss07中根据建立的lc-ms/ms绝对定量分析方法对中药养护贴中九种关键有效成分进行分析评价，具体包括对定量线性范围、线性相关系数、最低检出限(lod，按照3倍信噪比计算)和检测重复性(以标准品峰面积的rsd％表示)等达到样品的分析要求。进一步地，所述中药养护贴中九种关键有效成分为绿原酸、紫丁香苷、芦丁、毛蕊异黄酮、槲皮素、木犀草素、山奈酚、高车前素和蛇床子素。本发明具有以下有益效果：1、本发明通过利用九种关键有效成分标准品进行仪器分析方法优化，包括液相色谱条件优化、质谱检测条件及质谱参数优化，使九种化合物峰形对称并能达到基线分离，同时使得质谱能够准确定性，而且定量灵敏度达到最优；2、本发明采用试液相色谱-质谱联用的方法，使用液相色谱-串联三重四极杆质谱联用仪，建立中药养护贴中绿原酸、紫丁香苷、芦丁、毛蕊异黄酮、槲皮素、木犀草素、山奈酚、高车前素、蛇床子素九种特征物质的定量方法，该方法具有简单快速、样品量少、精确、重复性好且灵敏度高的优势；3、本发明基于液相色谱-质谱的中药养护贴有效成分检测分析方法，九种关键有效成分在各自的线性范围内呈线性关系，线性相关系数均大于等于99％，重复性rsd(n＝5)均小于等于1％。当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本发明中九种关键有效成分标准品lc-ms/ms总离子流色谱图；图2为本发明中绿原酸标准品的mrm谱图；图3为本发明中紫丁香苷标准品的mrm谱图；图4为本发明中芦丁标准品的mrm谱图；图5为本发明中槲皮素标准品的mrm谱图；图6为本发明中毛蕊异黄酮标准品的mrm谱图；图7为本发明中木犀草素标准品的mrm谱图；图8为本发明中山奈酚标准品的mrm谱图；图9为本发明中高车前素标准品的mrm谱图；图10为本发明中蛇床子素标准品的mrm谱图。具体实施方式下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。具体实施例：本发明为一种基于液相色谱-质谱的中药养护贴有效成分检测分析方法，经过一系列实验优化，首先取出中药养护贴填充精华素，用优化过得试剂，超声提取、离心、复提，然后结合液相色谱-质谱联用技术对中药养护贴中九种关键有效成分快速、准确的分析检测。使用液相色谱-串联三重四级杆质谱联用仪，建立中药养护贴中九种关键有效成分绿原酸、紫丁香苷、芦丁、毛蕊异黄酮、槲皮素、木犀草素、山奈酚、高车前素、蛇床子素九种特征物质的定量方法，经过一系列实验优化，首先取出中药养护贴填充精华素，用优化过得提取试剂，超声提取、离心、复提，然后结合液相色谱-质谱联用技术对中药养护贴中九种关键有效成分快速、准确的分析检测。液相色谱-串联三重四级杆质谱联用仪采用aglient1290-6430，(美国安捷伦科技有限公司)、甲醇(色谱纯，德国默克)、甲酸(优级纯，上海麦克林生化科技有限公司)、绿原酸标准品(坛墨质检标准物质中心)、紫丁香苷标准品(坛墨质检标准物质中心)、芦丁标准品(坛墨质检标准物质中心)、毛蕊异黄酮标准品(坛墨质检标准物质中心)、槲皮素标准品(坛墨质检标准物质中心)0、木犀草素标准品(坛墨质检标准物质中心)、山奈酚标准品(坛墨质检标准物质中心)、高车前素标准品(坛墨质检标准物质中心)、蛇床子素标准品(坛墨质检标准物质中心)、超声波振荡器(宁波新芝生物科技股份有限公司)具体的包括以下步骤：ss01：选取液相色谱柱并设定质谱条件、参数；s011：色谱柱选用：agilentzorbaxeclipseplusc18，2.1mm×150mm×5μm，设定色谱柱温度为30℃，设定流动相及流动相梯度，其中，水相a：0.01％甲酸水、有机相b：甲醇，其中，流动相梯度的设定如表1所示：time(min)flow(ml/min)a％b％00.2901010.29010150.26040500.20100550.20100560.29010650.29010表1流动相梯度参数s012：设定质谱条件：离子源为esi离子源(电喷雾离子源)；离子源温度为350℃；雾化器工作压力为35psi；干燥气流速为9l/min；s013：设定质谱定性定量检测模式：正离子模式、多反应监测模式(mrm)，设定多反应监测模式参数，其中，mrm质谱检测参数设置如表2所示；表2mrm质谱检测参数ss02：标准储备溶液制备s021：分别准确称取0.1g的中药养护贴中九种关键有效成分的标准品，称量精确至0.0001g；s022：用甲醇溶解后分别转移至50ml容量瓶中，定容，分别配制出2000μg/ml的九种关键有效成分的标准储备液；ss03：系列标准溶液制备s031：分别准确量取九种关键有效成分的标准储备液，用含50％甲醇的水溶液配制成浓度分别为0.01μg/ml、0.05μg/ml、0.1μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml的九种关键有效成分的系列混合标准溶液；ss04：通过九种关键有效成分标准溶液进行仪器分析方法优化，获得优化后的lc-ms/ms绝对定量分析方法，仪器分析方法优化包括液相色谱条件优化、质谱检测条件及质谱参数优化，使九种化合物峰形对称并能达到基线分离，同时使得质谱能够准确定性，而且定量灵敏度达到最优；其中，仪器为液相色谱-串联三重四极杆质谱联用仪；如图1是九种关键有效成分标准溶液的lc-ms/ms总离子流色谱图，图2-10就是仪器根据化合物特征分出来的mrm单个谱图；本方法采用外标定量法，对建立的中药养护贴中绿原酸、紫丁香苷、芦丁、毛蕊异黄酮、槲皮素、木犀草素、山奈酚、高车前素和蛇床子素九种关键有效成分的lc-ms/ms绝对定量分析方法进行方法评价，包括定量线性范围、线性相关系数、最低检出限(lod，按照3倍信噪比计算)和检测重复性(以标准品峰面积的rsd％表示)：其中，评价结果如表3所示：表3九种关键有效成分的lc-ms/ms绝对定量分析方法评价ss05：样品前处理，按照优化后的lc-ms/ms绝对定量方法对中药养护贴进行检测，每类样品分别选取3片同一生产批号的养护贴进行平行样品测试；s051：取中药养护贴填充精华素0.2g于10ml离心管中，加入4ml提取溶剂，超声提取30min，离心20min，取上清；其中，离心转速为3000rpm，提取溶剂为含50％甲醇的水溶液；s052：向步骤s051的沉淀中再加入4ml提取溶剂，超声提取30min，离心20min，取上清，提取溶剂为含50％甲醇的水溶液；ss06：合并步骤s051、s052中的上清提取液，取1ml过0.22μm滤膜，对滤液进行上机测试；ss07：绘制标准曲线，根据建立的lc-ms/ms绝对定量分析方法对中药养护贴中九种关键有效成分进行分析评价，具体包括对定量线性范围、线性相关系数、最低检出限(lod，按照3倍信噪比计算)和检测重复性(以标准品峰面积的rsd％表示)等达到样品的分析要求，获取九种关键有效成分在中药养护贴中含量结果，并根据结果对中药养护贴测试结果分析，九种特征物质的检测结果如表4中所示：表4九种关键有效成分在中药养护贴中含量结果一种基于液相色谱-质谱的中药养护贴有效成分检测分析方法，通过利用九种关键有效成分标准品进行仪器分析方法优化，包括液相色谱条件优化、质谱检测条件及质谱参数优化，使九种化合物峰形对称并能达到基线分离，同时使得质谱能够准确定性，而且定量灵敏度达到最优；采用试液相色谱-质谱联用的方法，使用液相色谱-串联三重四极杆质谱联用仪，建立中药养护贴中绿原酸、紫丁香苷、芦丁、毛蕊异黄酮、槲皮素、木犀草素、山奈酚、高车前素、蛇床子素九种关键有效成分的定量方法，该方法具有简单快速、样品量少、精确、重复性好且灵敏度高的优势；九种关键有效成分在各自的线性范围内呈线性关系，线性相关系数均大于等于99％，重复性rsd(n＝5)均小于等于1％。在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属
技术领域：
技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。当前第1页12