检测血液中雌二醇含量的方法与流程

本发明涉及激素类内源性物质检测技术领域，特别涉及一种检测血液中雌二醇含量的方法。

背景技术：

雌二醇(estradiol，e2)，分子式为c18h24o2，具体化学结构如图1所示。由于不同年龄段、不同性别、不同生理期的个体，血清中雌二醇含量存在明显的差异。使得血清中雌二醇含量成为雌性生殖功能评估的一个组成部分。比如采用血清中雌二醇含量辅助评估不孕症，寡发性闭经和绝经状态，又比如通过血清中雌二醇含量辅助检测排卵。另外，血清中雌二醇含量升高可辅助指征妊娠(尤其双胎或多胎)、雌激素分泌瘤、促排卵药物、男性女性化、卵巢肿瘤、无排卵性子宫功能出血和肝硬化等。反之，其浓度降低，则可用来辅助指征卵巢肿瘤、葡萄胎、宫内死胎、妊娠高血压综合征、下丘脑肿瘤、腺垂体功能减低、卵巢功能不全、卵巢切除、青春期延迟、原发性和继发性闭经、绝经、口服避孕药等。由于雌二醇浓度指标可能与人体内多种疾病相关，故对血清中雌二醇进行检测具有重要的临床意义。

目前，雌二醇的检测方法主要包括液相色谱-质谱联用法、免疫分析方法等。其中，免疫分析方法具有通量高，简便快捷等优点，但干扰因素多、灵敏度较低。现有的液相色谱-质谱联用法主要采用衍生的方式检测，即将雌二醇衍生成目标衍生物，通过检测目标衍生物实现检测雌二醇的目的。而衍生会导致操作复杂，检测时间较长等问题。

技术实现要素：

本发明实施例提供了一种检测血液中雌二醇含量的方法，实现了直接检测雌二醇含量。

一种检测血液中雌二醇含量的方法，包括：

向固定量的具有已知浓度内标物的内标工作液中，添加待检测样品离心后的第一上清液混合，并添加萃取剂混合，高速离心，取第二上清液，其中，第一上清液的添加量为200～500μl，萃取剂为甲基叔丁基醚；

通过氮吹方式，吹干所述第二上清液，通过稀释液溶解吹干后的剩余物，混合，高速离心，取第三上清液，所述稀释液为含有20％～80％水的甲醇溶液；

利用高效液相串联质谱仪，检测第三上清液；

基于第三上清液的检测结果和高效液相串联质谱仪检测出的雌二醇标准曲线，得到待检测样品中雌二醇的浓度。

优选地，

高效液相串联质谱仪中，

高效液相色谱的色谱条件包括：

长度为50mm、内径为2.1mm以及填料粒径为1.7μm的c18色谱柱；

在线过滤器为ssicolpre-filterwater1/160.5m；

流动相为乙腈以及含0.1mmnh4f的水；

分析时长为5.0min；

柱温为30～45℃；

进样量为10-50μl；

流速为0.20-0.6ml/min。

优选地，

高效液相色谱采用梯度洗脱；

所述梯度洗脱条件：

洗脱总时长为5min；

开始采用洗脱流动相为40％乙腈以及60％含0.1mmnh4f的水进行洗脱；

洗脱时间长到达1.70min，洗脱流动相转换为84％乙腈以及16％含0.1mmnh4f的水；

洗脱时间长到达1.71min，洗脱流动相转换为98％乙腈以及2％含0.1mmnh4f的水；

洗脱时间长到达3.51min，洗脱流动相转换为40％乙腈以及60％含0.1mmnh4f的水；

所述洗脱流动相流速为0.45ml/min。

优选地，

高效液相串联质谱仪中，

串联质谱条件包括：

esi(-)检测模式，采集模式为mrm，气帘气压力为20psi，碰撞气为9psi，喷雾电压值为-4500v，离子化温度为600℃，雾化气压力为30psi；辅助气压力为50psi。

优选地，

所述固定量的具有已知浓度内标物的内标工作液为10μl的浓度为2ng/ml的雌二醇-d3。

优选地，

甲基叔丁基醚的用量为0.8-1.2ml。

优选地，

稀释液用量100μl。

优选地，

稀释液中的水：甲醇＝3：7。

优选地，

雌二醇标准曲线中的两个变量分别为：

雌二醇的色谱峰面积与对应内标物的色谱峰面积的比值以及雌二醇浓度与对应内标物浓度的比值。

优选地，

上述检测血液中雌二醇含量的方法进一步包括：

制备标准工作液：利用所述稀释液对浓度为1mg/ml的雌二醇标准储备液进行稀释，在至少三个不同浓度的标准工作液，所述标准工作液含雌二醇浓度为60pg/ml～30000pg/ml，并在-80℃条件下保存；

制备内标工作液：向10μl，浓度为1mg/ml的雌二醇-d3标准储备液加入990ul所述稀释液进行稀释，并1500r/min涡旋混合1min，得内标中间液；取10μl内标中间液于50ml容量瓶中，加入所述稀释液定容至50ml，振荡，得到浓度为2ng/ml的内标工作液，-80℃条件下保存；

制备标准溶液：为每一种浓度的标准工作液取10μl内标工作液，并加入10μl对应浓度的标准工作液，另加入80μl稀释液混合制成至少三种标准溶液；

所述雌二醇的标准曲线是由高效液相串联质谱仪检测至少三种标准溶液的检测结果拟合出的。

优选地，至少三种标准工作液，包括：雌二醇浓度分别为60pg/ml、180pg/ml、540pg/ml、1620pg/ml、4860pg/ml、14580pg/ml以及30000pg/ml的标准工作液。

优选地，

混合为在1000-2500rpm转速下涡旋混合，其中，添加所述萃取剂后的混合时长控制在4～8min，所述萃取剂和吹干后的剩余物的混合时长控制在1～3min。

优选地，高速离心的转速不低于10000rpm，高速离心的时长为4-6min。

本发明实施例提供了一种检测血液中雌二醇含量的方法，该检测血液中雌二醇含量的方法包括：向固定量的具有已知浓度内标物的内标工作液中，添加待检测样品离心后的第一上清液混合，并添加萃取剂混合，高速离心，取第二上清液，其中，所述第一上清液的添加量为200～500μl，所述萃取剂为甲基叔丁基醚；通过氮吹方式，吹干所述第二上清液，通过稀释液溶解吹干后的剩余物，混合，高速离心，取第三上清液，所述稀释液为含有20％～80％水的甲醇溶液；利用高效液相串联质谱仪，检测所述第三上清液；基于所述第三上清液的检测结果和高效液相串联质谱仪检测出的雌二醇标准曲线，得到所述待检测样品中雌二醇的浓度，通过萃取剂萃取出待检测样品中的雌二醇，并通过研究找到利用高效液相串联质谱仪直接检测雌二醇的方式，实现了直接检测待检测样品中的雌二醇。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明一个实施例提供的雌二醇的结构；

图2是本发明一个实施例提供的检测血液中雌二醇含量的流程图；

图3是本发明一个实施例提供的标准溶液中雌二醇色谱图；

图4是本发明一个实施例提供的标准溶液中雌二醇同位素内标色谱图；

图5是本发明一个实施例提供的标准溶液中雌二醇和雌二醇同位素内标的质谱图；

图6是本发明一个实施例提供的血清样本中雌二醇色谱图；

图7是本发明一个实施例提供的血清样本添加的雌二醇同位素内标色谱图；

图8是本发明一个实施例提供的血清样本中雌二醇和添加的雌二醇同位素内标的质谱图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明可检测含量的雌二醇结构如图1所示。

本发明实施例所提及的血液可以为血液本身，也可以为血液的相关样品如全血、血清、血浆等。

如图2所示，本发明一个实施例提供的检测血液中雌二醇含量的方法，该方法可包括如下步骤：

步骤201：向固定量的具有已知浓度内标物的内标工作液中，添加待检测样品离心后的第一上清液混合，并添加萃取剂混合，高速离心，取第二上清液，其中，第一上清液的添加量为200～500μl，萃取剂为甲基叔丁基醚；

步骤202：通过氮吹方式，吹干所述第二上清液，通过稀释液溶解吹干后的剩余物，混合，高速离心，取第三上清液，稀释液为含有20％～80％水的甲醇溶液；

步骤203：利用高效液相串联质谱仪，检测第三上清液；

步骤204：基于第三上清液的检测结果和高效液相串联质谱仪检测出的雌二醇标准曲线，得到待检测样品中雌二醇的浓度。

本发明实施例提供的检测方法中使用的高效液相串联质谱仪检测出的雌二醇标准曲线可为，基于标准曲线对应的标准溶液中雌二醇的出峰面积与雌二醇浓度之间的关系构建出，雌二醇的出峰面积与雌二醇浓度之间的标准曲线方程，将待检测样品中雌二醇的峰面积代入标准曲线方程中即可计算得到待检测样品中雌二醇的浓度。

但是，由于待检测样品处理过程以及检测误差，使得上述基于标准溶液中雌二醇的出峰面积与雌二醇浓度构建出的标准曲线方程存在一定的偏差，那么，基于该标准曲线方程计算出的待检测样品中雌二醇的浓度也会存在偏差。较优选地，检测方法中使用的高效液相串联质谱仪检测过程还可为，通过添加雌二醇对应的内标物，以内标物的峰面积/峰高和内标物的量与雌二醇的峰面积/峰高和雌二醇的量计算校正因子，利用校正因子、待测样品内的内标物的峰面积/峰高和内标物的量以及待测样品内的雌二醇的峰面积/峰高，计算待测样品内的雌二醇的量。

但是利用校正因子计算相对比较复杂，更优选地，检测方法中使用的高效液相串联质谱仪检测过程还可为，通过添加雌二醇对应的内标物，检测至少三种标准溶液中雌二醇的浓度以及内标物的固定浓度对应的峰高/峰面积，以标准溶液中雌二醇的浓度与内标物的固定浓度的比值为一个自变量，标准溶液中雌二醇的浓度对应的峰面积/峰高与内标物对应的峰面积/峰高的比值为另一自变量，通过至少三组(一个自变量，另一自变量)进行线性回归拟合标准曲线方程，待测样品内的内标物的峰面积/峰高与待测样品内的雌二醇的峰面积/峰高的比值代入上述标准曲线方程，得到待测样品内的内标物的已知浓度与待测样品内的雌二醇的浓度的比值，根据待测样品内的内标物的已知浓度与待测样品内的雌二醇的浓度的比值和待测样品内的内标物的已知浓度，即可得到待测样品内的雌二醇的浓度。

即：优选地，雌二醇的标准曲线方程中的两个变量分别为：标准溶液中雌二醇的色谱峰面积与对应内标物的色谱峰面积的比值以及标准溶液中雌二醇浓度与对应内标物浓度的比值。

针对本发明实施例来说，上述标准溶液中雌二醇为雌二醇标准品配制得到的，上述待检测样品中雌二醇是指待监测血液中的雌二醇。

上面已经提及待检测样品的处理方式也会影响最终的检测结果，本发明实施例通过向固定量的具有已知浓度内标物的内标工作溶液中，添加待检测样品离心后的第一上清液混合，并添加萃取剂混合，高速离心，取第二上清液，其中，第一上清液的添加量为200～500μl，萃取剂为甲基叔丁基醚，能够最大程度的保留雌二醇，同时去除干扰物。

可以理解地，内标物为雌二醇同位素，较为优选地，雌二醇的内标物为雌二醇-d3，其中，d3表征有3个h原子被氘原子取代。

可以理解地，上述检测结果是指待检测样品中雌二醇的色谱图中雌二醇的峰面积/峰高以及雌二醇内标物的色谱图中雌二醇内标物的峰面积/峰高。

针对检测血液中雌二醇含量所使用的高效液相串联质谱仪来说，高效液相色谱的色谱条件包括：长度为50mm、内径为2.1mm以及填料粒径为1.7μm的c18色谱柱；在线过滤器为ssicolpre-filterwater1/160.5m；洗脱流动相为乙腈以及含0.1mmnh4f的水；分析时长为5.0min；柱温为30～45℃；进样量为10-50μl；流速为0.20-0.60ml/min。

针对柱温来说，30～45℃是指在30℃到45℃的任一温度，比如，30℃，32.5℃，34℃，37℃，39℃，40℃，41℃，43℃以及45℃等。在该范围内任一温度下，检测出来的结果大体一致。

针对流速来说，0.20-0.60ml/min是指流速在0.20ml/min到0.60ml/min的任一流速，比如，0.20ml/min，0.25ml/min，0.30ml/min，0.35ml/min，0.40ml/min，0.45ml/min，0.50ml/min，0.55ml/min以及0.60ml/min等。

针对进样量来说，10-50μl是指进样量在10μl到50μl范围内的任一数值，比如，10μl，12μl，15μl，20μl，25μl，30μl，35μl，40μl，45μl以及50μl。

值得说明的是，上述c18色谱柱可为watersbehc18色谱柱(2.1*50mm,1.7μm)。

另外，针对检测血液中雌二醇含量所使用的高效液相串联质谱仪来说，串联质谱条件包括：esi(-)检测模式，采集模式为mrm，气帘气压力为20psi，碰撞气为9psi，喷雾电压值为-4500v，离子化温度为600℃，雾化气压力为30psi；辅助气压力为50psi。

本发明选用的检测仪器为sciex6500plus。

另外，针对检测血液中雌二醇含量所使用的高效液相串联质谱仪来说，采用梯度洗脱方式洗脱，梯度洗脱条件如下表1所示。

表1

即：洗脱总时长为5min；开始采用洗脱流动相为40％乙腈以及60％含0.1mmnh4f的水进行洗脱；洗脱时间长到达1.70min，洗脱流动相转换为84％乙腈以及16％含0.1mmnh4f的水；洗脱时间长到达1.71min，洗脱流动相转换为98％乙腈以及2％含0.1mmnh4f的水；洗脱时间长到达3.51min，洗脱流动相转换为40％乙腈以及60％含0.1mmnh4f的水；洗脱流动相流速为0.45ml/min。

进一步地，串联质谱条件中的质谱检测器离子对参数可进一步如下表2所示：

表2

上述表中，e2表征雌二醇；is/e2表征内标物雌二醇-d3；上述参数分别为雌二醇定性用离子对参数、雌二醇定量用离子对参数、雌二醇-d3定性用离子对参数以及雌二醇-d3定量用离子对参数；dp为正离子模式优化去簇电压；ep为聚焦电压；ce为碰撞电压；cxp为碰撞室射出电压。

另外，上述固定量的具有已知浓度内标物的内标工作液为10μl的浓度为2ng/ml的雌二醇-d3。

另外，上述甲基叔丁基醚的用量为0.8-1.2ml。

另外，上述稀释液用量100μl。优选地，稀释液中的水：甲醇＝3：7。

一般来说，雌二醇标准溶液的配制方式将直接影响检测的准确性，本发明实施例所选用的雌二醇标准溶液的配制方式能够保证检测结果的准确性。该混合标准溶液的配制方式包括：制备标准工作液、制备内标工作液以及制备标准溶液，其中，

制备标准工作液：精确称取雌二醇标准品5mg置于5ml容量瓶，用甲醇进行溶解，并定容至5ml，得到标准储备液a，其雌二醇浓度为1mg/ml，利用稀释液对浓度为1mg/ml的雌二醇标准储备液a进行稀释，在至少三个不同浓度的标准工作液，标准工作液含雌二醇浓度为60pg/ml～30000pg/ml，并在-80℃条件下保存；

制备内标工作液：精确称取雌二醇-d3标准品5mg置于5ml容量瓶，用甲醇进行溶解，并定容至5ml，得到标准储备液b，其雌二醇-d3浓度为1mg/ml，吸取10μl标准储备液b于1.5ml离心管中，加入990ul稀释液，1500r/min涡旋混匀1min，得内标中间液c；吸取10μl内标中间液c于50ml容量瓶中，加入稀释液定容至50ml，振荡混匀，得到浓度为2ng/ml的内标工作液，-80℃条件下保存；

制备标准溶液：为每一种浓度的标准工作液取10μl内标工作液，并加入10μl对应浓度的标准工作液，另加入80μl稀释液混合制成至少三种标准溶液；即用移液器取10μl内标工作液分别置于数个1.5ml离心管，分别加入至少三种不同浓度的标准工作液10μl，另加入80μl稀释液(含水20％-80％的甲醇)混合制成至少三种标准溶液，上述标准溶液分别在转速为1000-2000rpm下涡旋混匀30s-1min。

上述利用高效液相串联质谱仪，分别检测至少三种浓度标准溶液的具体实施方式可包括：将至少三种浓度混合标准溶液分别在转速为1000-2500rpm下涡旋混匀30s-1min后，获取每一种浓度标准溶液对应的上清液，利用高效液相串联质谱仪检测每一种浓度标准溶液对应的上清液。

为了能够保证线性回归拟合出的标准曲线方程比较准确，上述至少三种浓度混合标准溶液可具体包括：雌二醇浓度分别为60pg/ml、180pg/ml、540pg/ml、1620pg/ml、4860pg/ml、14580pg/ml以及30000pg/ml的标准工作液。

上述各个混合是指在1000-2500rpm转速下涡旋混合，其中，添加萃取剂后的混合时长控制在4～8min，萃取剂和吹干后的剩余物的混合时长控制在1～3min。

上述高速离心的转速不低于10000rpm，高速离心的时长为4-6min。

下面以几个实施例对检测血液中雌二醇含量的方法进行详细说明。

实施例1：制备系列浓度的混合标准溶液

制备雌二醇标准储备液：精确称取雌二醇标准品5mg置于5ml容量瓶，用甲醇进行溶解，并定容至5ml，得到雌二醇标准储备液，其雌二醇浓度为1mg/ml，在-80℃条件下保存，有效期为6个月；

制备雌二醇-d3内标物储备液：精确称取雌二醇-d3标准品5mg置于5ml容量瓶，用甲醇进行溶解，并定容至5ml，得到雌二醇-d3标准储备液，其雌二醇-d3浓度为1mg/ml，并在-80℃条件下保存，有效期为1年；

制备标曲中间液：将雌二醇标准储备液用稀释液进行稀释，在含雌二醇浓度为60pg/ml-30000pg/ml的范围内配制出各标准工作液(七种不同浓度的标准工作液，七种不同浓度的标准工作液分别为含有60pg/ml、180pg/ml、540pg/ml、1620pg/ml、4860pg/ml、14580pg/ml、30000pg/ml浓度的雌二醇溶液；)，-80℃条件下保存；

制备内标工作液：吸取10μl雌二醇-d3标准储备液于1.5ml离心管中，加入990ul稀释液，1500r/min涡旋混匀1min，得内标中间液；吸取10μl内标中间液于50ml容量瓶中，加入稀释液定容至50ml，振荡混匀，得到浓度为2ng/ml的内标工作液；

制备系列标准溶液：用移液器取10μl内标工作液分别置于数个1.5ml离心管，分别加入上述七种不同浓度的标曲中间液10μl，另加入80μl稀释液(含水20％-80％的甲醇)混合制成七种标准溶液。

实施例2：拟合标准曲线方程

将上述实施例1得到的七种浓度标准溶液分别在转速为1000-2500rpm下涡旋混匀30s-1min后，移取每一种浓度标准溶液对应的上清液，利用高效液相串联质谱仪检测每一种浓度标准溶液对应的上清液；得到七种不同浓度标准溶液的雌二醇和雌二醇-d3内标物的色谱图；

从上述每种浓度的标准溶液的色谱图中分别得到雌二醇和雌二醇-d3内标物的色谱峰面积，分别以上述七种不同浓度的标准溶液中的雌二醇色谱峰面积与对应的雌二醇-d3内标物色谱峰面积的比值分别作为标准曲线方程的纵坐标y，以上述七种不同浓度的标准溶液中的雌二醇与内标工作液中的雌二醇-d3内标物浓度的比值为作为标准曲线方程的横坐标x，将以上检测所得的七种不同浓度的数据进行线性回归，拟合得到雌二醇对应的标准曲线方程为y＝a*x+b，并且得系数a、b；该标准曲线方程以及系数a、b需要每次检测之前重新测定。即该实施例2为一段时间内检测血液中雌二醇必须执行的步骤。该一段时间内一般是指高效液相串联质谱仪的一次开机到关机的时间段内。

上述高效液相串联质谱仪中，

高效液相色谱的色谱条件包括：长度为50mm、内径为2.1mm以及填料粒径为1.7μm的c18色谱柱；在线过滤器为ssicolpre-filterwater1/160.5m；流动相为乙腈以及含0.1mmnh4f的水；分析时长为5.0min；柱温为30～45℃；进样量为10-50μl；流速为0.20-0.60ml/min。采用梯度洗脱；梯度洗脱条件如上述表1所示。

串联质谱条件包括：esi(-)检测模式，采集模式为mrm，气帘气压力为20psi，碰撞气为9psi，喷雾电压值为-4500v，离子化温度为600℃，雾化气压力为30psi；辅助气压力为50psi。详细的参数如上述表2所示。

该实施例2中一种浓度的标准溶液中雌二醇的色谱图如图3所示，雌二醇-d3的色谱图如图4所示；一种浓度的标准溶液中雌二醇和雌二醇-d3的质谱图如图5所示。值得说明的是，附图中标识1对应的峰为雌二醇；附图中标识2对应的峰为雌二醇-d3。

实施例3：基于实施例2给出的标准曲线方程，检测血清中雌二醇的含量

取待检测血液至少2ml，在离心速度为3500rpm下离心10min，取上清液得血清，上述血清置于4℃冷藏下保存至分析前备用；

用移液枪移取实施例1制得的内标工作液10μl于2ml离心管中，然后加入血清300μl，在2000rpm的转速下涡旋震荡混合1min；然后在上述离心管中加入甲基叔丁基醚1ml，在2000rpm的转速下涡旋震荡混合5min后，再在12000rpm的转速下高速离心10min，移取上清液至1.5ml离心管，n2吹干，100μl稀释液复溶，2000rpm的转速下涡旋震荡混合1min后，再在12000rpm的转速下高速离心5min，移取高速离心得到的上清液90μl，利用高效液相串联质谱仪，检测该上清液；基于该上清液的检测结果和雌二醇标准曲线方程，得到血清中雌二醇的浓度。

在该实施例中，高效液相串联质谱仪的高效液相色谱的色谱条件和串联质谱条件与上述实施例2给出的一致，在此不再赘述。

实施例3检测得到的雌二醇的色谱图、雌二醇-d3内标物色谱图和质谱图分别如图6、图7及图8所示。由图3、图4、图6以及图7对比可见，待检测血清样品中雌二醇的保留时间与标准溶液中雌二醇的保留时间一致，以雌二醇-d3同位素标记物为内标物，使得雌二醇的识别更为准确，分析时间短、干扰小，内标定量适宜特异性强、准确度和灵敏度高。

实施例4：基于实施例2给出的标准曲线方程，检测血浆中雌二醇的含量

该实施例中将实施例3中的待检测血清样品替换为待检测血浆样品，其他条件与实施例3一致。

实施例5：检测血液中雌二醇的方法的线性关系和定量限

将上述配制的各个浓度的雌二醇标准工作液10μl，加入10μl内标工作液，并加入稀释剂80μl混匀进样，按本实施例测定条件浓度由低到高进行测定，以定量色谱峰面积-浓度作图，得到标准曲线，结果表明其标准溶液检测限、定量限和线性范围如下：

(1)检测限(lod)：2.1pg/ml。

(2)定量限(loq)：6.0pg/ml。

(3)线性范围：

雌二醇标准溶液在6pg/ml到3000pg/ml范围内，线性良好，相关系数r2﹥0.999。

二、该方法的回收率和精密度

取雌二醇标准工作液配制成高、中、低3种浓度进行加样回收率实验和精密度实验，按实施例2方法进行检测，重复分析测定3批次，其回收率和精密度如下表3所示。雌二醇在低、中、高的3个添加水平范围内的平均回收率为96％～98％，相对标准偏差为0.81％～6.75％。

表3

综合上述验证试验，本实施例的检测限，回收率和精密度等各项技术指标均符合要求，方法检测血液中雌二醇浓度，重现性良好，加样回收率高，提高了检测结果的准确度。

根据标准溶液中雌二醇和雌二醇-d3内标物、血清样本中雌二醇和雌二醇-d3内标物的色谱图可知，雌二醇及内标的保留时间为1.25min，由色谱图可知本实施例方法目标化合物识别准确，分析时间短、干扰小，特异性强。

上述各个实施例，至少能够达到如下有益效果：

1.在本发明实施例中，向固定量的具有已知浓度内标物的内标工作液中，添加待检测样品离心后的第一上清液混合，并添加萃取剂混合，高速离心，取第二上清液，其中，所述第一上清液的添加量为200～500μl，所述萃取剂为甲基叔丁基醚；通过氮吹方式，吹干所述第二上清液，通过稀释液溶解吹干后的剩余物，混合，高速离心，取第三上清液，所述稀释液为含有20％～80％水的甲醇溶液；利用高效液相串联质谱仪，检测所述第三上清液；基于所述第三上清液的检测结果和高效液相串联质谱仪检测出的雌二醇标准曲线，得到所述待检测样品中雌二醇的浓度，通过萃取剂萃取出待检测样品中的雌二醇，并通过研究找到利用高效液相串联质谱仪直接检测雌二醇的方式，实现了直接检测待检测样品中的雌二醇，能够保证雌二醇检测的准确性，同时降低了雌二醇检测的时长。

2.在本发明实施例中，对待检测血液样品的处理方法以及内标物的选择，使得雌二醇的识别更为准确，分析时间短、干扰小，内标定量适宜特异性强、准确度和灵敏度高，同时，回收率，检测限和精密度等各项技术指标均符合要求，同时，该检测血液中雌二醇的方法，重现性良好，且加样回收率良好，从而提高检测结果的准确度，消除系统误差。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个······”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同因素。

还需要说明的是，以上所述仅为本发明的较佳实施例，仅用于说明本发明的技术方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。