一种检测血液中7-酮基胆固醇含量的方法与流程

本发明涉及临床化学
技术领域：
，特别涉及一种检测血液中7-酮基胆固醇含量的方法。
背景技术：
：7-酮基胆固醇是一种胆甾烷类化合物，由7位带有氧代取代基的胆固醇组成。尼曼-皮克病是一种先天性糖脂代谢异常性疾病，是一种罕见神经退行性疾病，分为a型，b型和c型。该疾病会造成内脏和中枢神经系统中胆固醇和其他脂质的积聚。a型和b型是由鞘磷脂酶缺乏引起的，该酶导致在肝脏、脾脏、肺部和大脑中广泛储存鞘磷脂和胆固醇，a型和b型综合患病率估计为25万分之一，但发病后生存率极低。c型是由细胞胆固醇转运缺陷引起的，该缺陷导致晚期患者体内溶酶体中未酯化胆固醇的累积。在a型和b型疾病的患者血浆中，发现7-酮基胆固醇、胆甾醇-3β、5α、6β三醇胆固醇、羟甾醇溶血磷脂(lsm)、溶血磷脂509(lsm509)显著升高，而c型疾病的患者的血浆中7-酮基胆固醇等胆固醇氧化产物在血浆中显著升高。同时，7-酮基胆固醇和胆甾醇-3β、5α、6β三醇被认为是诊断鼻咽癌疾病的生物标志物。而目前尼曼-皮克病的诊断标准缺乏灵敏性和特异性，甚至会造成该疾病的诊断延迟，所以疾病早期的干预对于尼曼-皮克病及鼻咽癌的诊断及预防有着非常重要的意义。如此，定量分析人体血液中7-酮基胆固醇的含量对于诊断预防尼曼-皮克病具有重要的临床意义，但目前尚未有血液中7-酮基胆固醇含量的检测方法。技术实现要素：本发明提供了一种检测血液中7-酮基胆固醇含量的方法，能够检测血液中7-酮基胆固醇的含量。为了达到上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：本发明提供了一种检测血液中7-酮基胆固醇含量的方法，包括：利用高效液相串联质谱仪，在一定检测条件下，分别检测至少三个标准溶液，得到各个标准溶液的色谱图，其中，任一标准溶液中均含有浓度已知的7-酮基胆固醇和浓度已知的内标物，不同标准溶液中7-酮基胆固醇的浓度不同；根据得到的各个标准溶液的色谱图，拟合得到标准曲线方程；处理待检测血液得到血液样品；将一定量的含有浓度已知的内标物的内标工作液，添加到所述血液样品中，并进行样品前处理以得到待测样品；利用高效液相串联质谱仪，在相同检测条件下，检测所述待测样品，得到所述待测样品的色谱图；根据所述待测样品的色谱图和所述标准曲线方程，得到所述待检测血液中7-酮基胆固醇的含量。优选地，所述检测条件中的液相条件包括：色谱柱的长度为50mm、内径为2.1mm、填料粒径为2.6μm，流动相为含体积比为0.1％-0.5％甲酸的水和含体积比为0.1％-0.5％甲酸的甲醇，分析时间为4.5min，柱温为20℃-40℃，进样量为0.1μl-30μl，流速为0.40ml/min-0.60ml/min。优选地，所述液相条件还包括：phenomenex公司的kinetexc18色谱柱。优选地，所述液相条件还包括：洗脱过程为：含体积比为0.3％甲酸的水和含体积比为0.3％甲酸的甲醇的百分用量比，在2.41min-3.50min的洗脱时间范围内为0：100，在其他洗脱时间范围内为15:85。优选地，所述检测条件中的串联质谱条件包括：采用大气压化学电离源esi，正离子扫描模式，选择反应监测模式，鞘气流速为10l/min，鞘气温度为300℃，加热气流速为12l/min，加热气温度为250℃，雾化电压为40psi，毛细管电压4500psi。优选地，所述将一定量的含有浓度已知的内标物的内标工作液，添加到所述血液样品中，并进行样品前处理以得到待测样品，包括：用移液枪移取一定量的含有浓度已知的内标物的内标工作液，置于离心管中，再加入50μl-300μl所述血液样品，再加入一定量的沉淀蛋白试剂，在1500rpm-2500rpm的转速下涡旋混合2min-5min；涡旋混合后在离心管中加入一定量的萃取试剂，在1500rpm-2500rpm的转速下涡旋混合5min-15min，再在10000rpm-15000rpm的转速下高速离心8min-15min；移取一定量离心后的上清液至离心管中，并转移至氮气吹干装置上以将上清液吹干；移取一定量的复溶液至上清液吹干的离心管中，在1500rpm-2500rpm的转速下涡旋混合1min-3min，再在10000rpm-15000rpm的转速下高速离心4min-6min，得到待测样品。优选地，所述内标工作液的移取量为10μl。优选地，所述沉淀蛋白试剂为甲醇，甲醇的用量为100μl-300μl。优选地，所述萃取试剂为正己烷，正己烷的用量为800μl-1200μl。优选地，所述复溶液为含体积比为70％-100％甲醇和体积比为0.1％-0.5％甲酸的水，所述复溶液的用量为50μl-200μl。优选地，所述处理待检测血液得到血液样品，包括：取不少于2ml的待检测血液，在3500rpm的转速下离心10min，取上清液以作为血液样品；所述血液样品的保存条件为，置于-20℃下保存直至分析前备用。优选地，在所述分别检测至少三个标准溶液之前，进一步包括：利用移液器移取10μl标准工作液、10μl所述内标工作液和80μl稀释液至离心管中，其中，所述稀释液中甲醇和水的比例为85:15，所述标准工作液中含有浓度已知的7-酮基胆固醇；将该离心管在1500rpm-2500rpm的转速下涡旋混匀1min-2min后，移取上清液以得到标准溶液。优选地，在所述得到标准溶液之前，进一步包括：精确称取10mg的7-酮基胆固醇的标准品，并置于10ml容量瓶中，用甲醇进行溶解并定容，以得到标准储备液，并在-80℃下保存，有效期为6个月；取一定量的所述标准储备液置于一定体积的容量瓶中，用70％-100％的甲醇水溶液进行稀释并定容，以得到所述标准工作液，且所述标准工作液中7-酮基胆固醇的浓度介于20ng/ml-1000ng/ml之间，并在-80℃下保存，有效期为3个月；取1mg的内标物的标准品，该内标物为7-酮基胆固醇的同位素内标物，并置于10ml容量瓶，用甲醇进行溶解并定容，以得到内标储备液，并在-80℃下保存，有效期为1年；取一定量的所述内标储备液置于一定体积的容量瓶中，用85％的甲醇水溶液进行稀释并定容，以得到所述内标工作液，并在-80℃下保存，有效期为1年。优选地，内标物为7-酮基胆固醇的同位素内标物。优选地，所述至少三个标准溶液中7-酮基胆固醇的浓度包括：20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml中的至少三个。本发明提供了一种检测血液中7-酮基胆固醇含量的方法，该方法包括：利用高效液相串联质谱仪分别检测至少三个标准溶液，得到各个标准溶液的色谱图，该标准溶液含浓度已知的7-酮基胆固醇和内标物；根据得到的标准溶液的色谱图，拟合得到标准曲线方程；处理待检测血液得到血液样品，并加入浓度已知的内标物，经样品前处理以得到待测样品；在相同检测条件下检测待测样品得到色谱图；根据待测样品的色谱图和标准曲线方程，得到待检测血液中7-酮基胆固醇的含量。因此，本发明能够检测血液中7-酮基胆固醇的含量。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是本发明一实施例提供的一种检测血液中7-酮基胆固醇含量的方法的流程图；图2是本发明一实施例提供的7-酮基胆固醇的化学结构式；图3是本发明一实施例提供的7-酮基胆固醇-d7的化学结构式；图4是本发明一实施例提供的一标准溶液中7-酮基胆固醇的色谱图；图5是本发明一实施例提供的一标准溶液中内标物的色谱图；图6是本发明一实施例提供的一待测样品中7-酮基胆固醇的色谱图；图7是本发明一实施例提供的一待测样品中内标物的色谱图。具体实施方式为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例一如图1所示，本发明实施例提供了一种检测血液中7-酮基胆固醇含量的方法，可以包括以下步骤：步骤101：利用高效液相串联质谱仪，在一定检测条件下，分别检测至少三个标准溶液，得到各个标准溶液的色谱图，其中，任一标准溶液中均含有浓度已知的7-酮基胆固醇和浓度已知的内标物，不同标准溶液中7-酮基胆固醇的浓度不同。步骤102：根据得到的各个标准溶液的色谱图，拟合得到标准曲线方程。步骤103：处理待检测血液得到血液样品。步骤104：将一定量的含有浓度已知的内标物的内标工作液，添加到所述血液样品中，并进行样品前处理以得到待测样品。步骤105：利用高效液相串联质谱仪，在相同检测条件下，检测所述待测样品，得到所述待测样品的色谱图。步骤106：根据所述待测样品的色谱图和所述标准曲线方程，得到所述待检测血液中7-酮基胆固醇的含量。优选地，内标物为7-酮基胆固醇的同位素内标物。比如可以为7-酮基胆固醇-d7。同位素内标物能避免质谱的基质效应。请参考图2和图3，图2示出了7-酮基胆固醇的化学结构式，图3示出了7-酮基胆固醇-d7这一同位素内标物的化学结构式。详细地，步骤101限定了标准溶液的检测，步骤102限定了标准曲线方程的获得，步骤103限定了待检测血液的处理，步骤104限定了待测样品的获得，步骤105限定了待测样品的检测，步骤106限定了待检测血液中7-酮基胆固醇含量的计算，从而完成对血液中7-酮基胆固醇含量的检测。详细地，步骤102中拟合得到的标准曲线方程通常可以为y＝k×x+b。其中，x、y这两个变量，分别可以为标准溶液的色谱图中7-酮基胆固醇与其内标物的峰面积比值、标准溶液中7-酮基胆固醇与其内标物的浓度比值。如此，步骤106中，可获得待测样品的色谱图中7-酮基胆固醇与其内标物的峰面积比值，以及待测样品中内标物的浓度，代入标准曲线方程即可计算出待测样品中7-酮基胆固醇的浓度。由于样品的前处理过程会涉及到样品混匀，故待检测血液中7-酮基胆固醇的含量，与血液样品及待测样品中7-酮基胆固醇的含量通常是一致的。如此，即获得了待检测血液中7-酮基胆固醇的含量。本发明实施例提供的这一检测血液中7-酮基胆固醇含量的方法，是将内标法与高效液相色谱质谱联用法相结合，使干扰因素大大减少，且特异性强、灵敏度高、检测结果更为准确，同时分析时间缩短。详细地，对应于上述步骤101，在检测标准溶液之前，首先需要配置各个标准溶液。进一步地，在配置各个标准溶液之前，还需配置标准储备液和各个标准工作液、内标储备液和内标工作液。详细地，对于标准溶液的配置，至少可以存在下述实施例二。实施例二本发明实施例与实施例一基本相同，相同之处不再赘述，不同之处在于：在所述步骤101之前，进一步包括：步骤a1：利用移液器移取10μl标准工作液、10μl所述内标工作液和80μl稀释液至离心管中，其中，所述稀释液中甲醇和水的比例为85:15，所述标准工作液中含有浓度已知的7-酮基胆固醇。步骤a2：将该离心管在1500rpm-2500rpm的转速下涡旋混匀1min-2min后，移取上清液以得到标准溶液。举例来说，转速的取值可以为1500、1700、1900、2100、2300或2500；涡旋时间的取值可以为1、1.2、1.4、1.6、1.8或2。详细地，对于储备液和工作液的配置，至少可以存在下述实施例三。实施例三本发明实施例与实施例二基本相同，相同之处不再赘述，不同之处在于：在所述步骤a1之前，进一步包括：步骤b1：精确称取10mg的7-酮基胆固醇的标准品，并置于10ml容量瓶中，用甲醇进行溶解并定容，以得到标准储备液，并在-80℃下保存，有效期为6个月。步骤b2：取一定量的所述标准储备液置于一定体积的容量瓶中，用70％-100％的甲醇水溶液进行稀释并定容，以得到所述标准工作液，且所述标准工作液中7-酮基胆固醇的浓度介于20ng/ml-1000ng/ml之间，并在-80℃下保存，有效期为3个月。步骤b3：取1mg的内标物的标准品，该内标物为7-酮基胆固醇的同位素内标物，并置于10ml容量瓶，用甲醇进行溶解并定容，以得到内标储备液，并在-80℃下保存，有效期为1年。步骤b4：取一定量的所述内标储备液置于一定体积的容量瓶中，用85％的甲醇水溶液进行稀释并定容，以得到所述内标工作液，并在-80℃下保存，有效期为1年。由于拟合一标准曲线方程时，至少需要三个坐标点才可保证最基本的拟合准确度，故应得到一系列不同7-酮基胆固醇浓度的标准工作液，进而可得到一系列不同7-酮基胆固醇浓度的标准溶液。基于此，至少可以存在下述实施例四。实施例四本发明实施例与实施例一基本相同，相同之处不再赘述，不同之处在于：所述至少三个标准溶液中7-酮基胆固醇的浓度包括：20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml中的至少三个。详细地，现有对人体内源性小分子的检测，可采用高效液相色谱分离后与多波长吸收或联合吸收或荧光吸收相结合的检测方法，但这一方法易存在特异性差、样品处理复杂导致样本处理期间人体内源性小分子含量的变化、分析时间长，方法特异性差，整个检测过程时间长的问题。而本发明实施例提供的7-酮基胆固醇检测方法，是采用高效液相串联质谱法进行检测，可解决上述问题。如此，需要控制一定的检测条件，以达到良好的检测效果。基于此，对于液相条件，可存在下述实施例五，对于质谱条件，可存在下述实施例八。实施例五本发明实施例与实施例一基本相同，相同之处不再赘述，不同之处在于：所述检测条件中的液相条件包括：色谱柱的长度为50mm、内径为2.1mm、填料粒径为2.6μm，流动相为含体积比为0.1％-0.5％甲酸的水和含体积比为0.1％-0.5％甲酸的甲醇，分析时间为4.5min，柱温为20℃-40℃，进样量为0.1μl-30μl，流速为0.40ml/min-0.60ml/min。举例来说，对于0.1％-0.5％这一取值范围，具体取值可以为0.1、0.2、0.3、0.4或0.5。此外，柱温的取值可以为20、25、30、35或40；进样量的取值可以为0.1、0.5、1、3、5、10、15、20、25或30；流速的取值可以为0.40、0.45、0.50、0.55或0.60。在上述实施例五的实现基础之上，至少可以存在下述实施例六和实施例七，或两个实施例的结合。实施例六本发明实施例与实施例五基本相同，相同之处不再赘述，不同之处在于：所述液相条件还包括：phenomenex公司的kinetexc18色谱柱。实施例七本发明实施例与实施例五基本相同，相同之处不再赘述，不同之处在于：所述液相条件还包括：洗脱过程为：含体积比为0.3％甲酸的水和含体积比为0.3％甲酸的甲醇的百分用量比，在2.41min-3.50min的洗脱时间范围内为0：100，在其他洗脱时间范围内为15:85。可见，这一洗脱方式为梯度洗脱，且洗脱过程可参照下述表1。表1时间/min水(含0.3％甲酸)/％甲醇(含0.3％甲酸)/％0.0015852.4015852.4101003.5001003.5115854.501585实施例八本发明实施例与实施例一基本相同，相同之处不再赘述，不同之处在于：所述检测条件中的串联质谱条件包括：采用大气压化学电离源esi(electrosprayionization，电喷雾电离源)，正离子扫描模式，选择反应监测模式，鞘气流速为10l/min，鞘气温度为300℃，加热气流速为12l/min，加热气温度为250℃，雾化电压为40psi，毛细管电压4500psi。其中，鞘气流速即sheathgasflow，鞘气温度即sheathgastemp，加热气流速即gasflow，加热气温度即gastemp，雾化电压即nebulizer，毛细管电压即capillary。详细地，对应于上述步骤103，对于如何处理待检测血液，至少可以存在下述实施例九。实施例九本发明实施例与实施例一基本相同，相同之处不再赘述，不同之处在于：所述步骤103，包括：取不少于2ml(比如可以为2ml、3ml、4ml、5ml等)的待检测血液，在3500rpm的转速下离心10min，取上清液以作为血液样品；所述血液样品的保存条件为，置于-20℃下保存直至分析前备用。通常情况下，这一上清液可以为血清或血浆。详细地，对应于上述步骤104，对于如何获得待测样品，至少可以存在下述实施例十。实施例十本发明实施例与实施例一基本相同，相同之处不再赘述，不同之处在于：所述步骤104，包括：用移液枪移取一定量的含有浓度已知的内标物的内标工作液，置于离心管中，再加入50μl-300μl(比如50μl、100μl、150μl、200μl、250μl或300μl)所述血液样品，再加入一定量的沉淀蛋白试剂，在1500rpm-2500rpm的转速下涡旋混合2min-5min(比如2min、3min、4min或5min)；涡旋混合后在离心管中加入一定量的萃取试剂，在1500rpm-2500rpm的转速下涡旋混合5min-15min(比如5min、7min、10min、12min或15min)，再在10000rpm-15000rpm的转速下高速离心8min-15min(比如8min、10min、12min或15min)；移取一定量离心后的上清液至离心管中，并转移至氮气吹干装置上以将上清液吹干；移取一定量的复溶液至上清液吹干的离心管中，在1500rpm-2500rpm的转速下涡旋混合1min-3min(比如1min、2min或3min)，再在10000rpm-15000rpm的转速下高速离心4min-6min(比如4min、5min或6min)，得到待测样品。举例来说，对于1500rpm-2500rpm这一取值范围，具体取值可以为1500、1700、2000、2300或2500；对于10000rpm-15000rpm这一取值范围，具体取值可以为10000、11000、12000、13000、14000或15000。本发明实施例中，通过简化前处理步骤，缩短样品处理时间。在上述实施例十的实现基础之上，至少可以存在下述实施例十一至实施例十四，或其中一个或多个实施例的结合。实施例十一本发明实施例与实施例十基本相同，相同之处不再赘述，不同之处在于：所述内标工作液的移取量为10μl。实施例十二本发明实施例与实施例十基本相同，相同之处不再赘述，不同之处在于：所述沉淀蛋白试剂为甲醇，甲醇的用量为100μl-300μl。比如，这一用量取值可以为100、150、200、250或300。实施例十三本发明实施例与实施例十基本相同，相同之处不再赘述，不同之处在于：所述萃取试剂为正己烷，正己烷的用量为800μl-1200μl。比如，这一用量取值可以为800、900、1000、1100或1200。实施例十四本发明实施例与实施例十基本相同，相同之处不再赘述，不同之处在于：所述复溶液为含体积比为70％-100％甲醇和体积比为0.1％-0.5％甲酸的水，所述复溶液的用量为50μl-200μl。举例来说，对于70％-100％这一取值范围，具体取值可以为70、80、90或100；对于0.1％-0.5％这一取值范围，具体取值可以为0.1、0.2、0.3、0.4或0.5。此外，复溶液的用量取值可以为50、100、150或200。综合上述实施例一至实施例十四，至少可以存在下述实施例十五。实施例十五本发明实施例提供了一种检测血液中7-酮基胆固醇含量的方法，可以包括以下步骤。(一)标准溶液的标定首先用移液器移取10μl6种不同浓度标准工作液c和10μl内标工作液置于离心管中，再移取加入80μl稀释液(甲醇：水＝85:15)，混合制成6种不同浓度的标准溶液，将上述标准溶液在转速为2000rpm下涡旋混匀1min后，移取上述上清液，利用高效液相串联质谱仪对上述上清液进行检测，得到6种不同浓度的7-酮基胆固醇和内标物的标准溶液的色谱图，从上述每种浓度的标准溶液的色谱图中得到7-酮基胆固醇色谱峰面积和内标物色谱峰面积，以上述6个不同浓度的7-酮基胆固醇色谱峰面积与内标物色谱峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y，以上述标准工作液中的7-酮基胆固醇浓度与内标工作液中的内标物浓度的比值为作为标准曲线方程的横坐标x，将以上检测所得的6种不同浓度的数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y＝a×x+b，并且得系数a、b；上述标准工作液c为含有7-酮基胆固醇的溶液，内标工作液为含有7-酮基胆固醇同位素内标的溶液。(a)标准储备液的配制标准储备液a：精确称取7-酮基胆固醇标准品10mg置于10ml容量瓶，用甲醇进行溶解，并定容于10ml，得到标准储备液e，并在-80℃条件下保存，有效期为6个月。(b)标准工作液的配制标准工作液b：取适量步骤(a)中标准储备液a，用甲醇进行稀释混合，得到分别含有20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml的7-酮基胆固醇的系列标曲混合中间液c，并在-80℃条件下保存，有效期为3个月。(c)内标储备液的配制内标储备液c：取7-酮基胆固醇-d7标准品1mg置于10ml容量瓶，用甲醇进行溶解，并定容至10ml，得到内标储备液d，并在-80℃条件下保存，有效期为1年。(d)内标工作液的配制取适量步骤(c)中内标储备液d，用85％的甲醇水溶液进行稀释，得到含150ng/ml的7-酮基胆固醇-d7的内标工作液，-80℃保存，避光，有效期1年。(二)检测血液的离心取待检测血液5ml，在离心速度为3500rpm下离心10min，取上清液得血浆，上述血浆置于-20℃冷冻下保存至分析前备用。全血基本能产生一半的血清或血浆，试验通常需要血清或血浆至少300μl。(三)待测样品处理(e)用移液枪移取10μl步骤(d)的内标工作液于1.5ml的离心管中，然后加入100μl步骤(二)中所述血浆，再加入200μl甲醇，在2000rpm的转速下涡旋混合3min后，加入1000μl正己烷，在2000rpm的转速下涡旋混合10min后，再在14000rpm的转速下高速离心10min，移取900μl离心后上清液至干净的1.5ml离心管中，将盛有上清液的1.5ml离心管转移至氮气吹干装置上，将上清液吹干，移取100μl含85％甲醇和0.3％甲酸的水至上清吹干的1.5ml离心管中，在2000rpm的转速下涡旋混合3min后，再在14000rpm的转速下高速离心5min，移取90μl即为待测样品。(四)待测样品的检测使用高效液相串联质谱仪对上述步骤(e)待测样品进行检测，同时得到上述待测样品的7-酮基胆固醇和内标物的色谱图。从该色谱图中可以得到7-酮基胆固醇色谱峰面积与内标物色谱峰面积，将7-酮基胆固醇色谱峰面积与相应内标物色谱峰面积的比值y、代入上述步骤(一)的标准曲线方程y＝a×x+b中，通过计算得到待检测样品中7-酮基胆固醇与内标物的相对浓度x。内标物在内标工作液中的浓度是已知的，由此计算得到该待样品的7-酮基胆固醇的浓度。液相条件为：色谱柱：phenomenex公司的kinetexc18色谱柱(2.1×50mm2.6μm)；洗脱条件：流动相为含0.3％甲酸的水和含0.3％甲酸的甲醇；分析时间：4.5min；柱温：30℃；进样量：10μl；流速：0.5ml/min。串联质谱条件为：采用大气压化学电离源esi，正离子扫描模式，选择反应监测模式，鞘气流速为10l/min，鞘气温度为300℃，加热气流速为12l/min，加热气温度为250℃，雾化电压为40psi，毛细管电压为4500psi。此外，串联质谱条件还包括下述表2所示内容。表2物质名称7-酮基胆固醇7-酮基胆固醇-d7保留时间(min)3.1983.180母离子401.6408.7子离子383.6390.6dwell100100fragmentor135135ce2020cav77本发明实施例中技术方法论证如下：一、本发明实施例的线性关系根据上述步骤(一)中拟合得到的标准曲线方程，表明7-酮基胆固醇的线性范围如下：7-酮基胆固醇在2ng/ml到100ng/ml范围内，线性良好，相关系数r2﹥0.9900。二、本发明实施例的检测限和定量限选取含低浓度7-酮基胆固醇的血浆样本，根据所选取血浆样本的已知浓度，用生理盐水做不同程度的稀释，从而制备得到不同浓度的血浆样本稀释液，加入10μl内标工作液，按本实施例前处理作样本处理后在相同测定条件下进行测定，得到相应色谱图，并据此以定量离子色谱峰面积—浓度作图。结果表明，7-酮基胆固醇的检测限和定量限如下：(1)检测限(lod)：0.16ng/ml。(2)定量限(loq)：0.2ng/ml。其中，以信噪比为10时为定量限，以信噪比为3时为检测限。三、该方法的回收率和精密度取7-酮基胆固醇标准工作液配制成高、中、低3种浓度进行加样回收率和精密度实验，按本实施例方法进行测定，重复分析测定3批次，7-酮基胆固醇的回收率如表3。7-酮基胆固醇在低、中、高的3个添加水平范围内的平均回收率为99.59％～101.25％，精密度为1.62％～1.75％。表3综合上述验证试验，本实施例的回收率，检测限和精密度等各项技术指标均符合要求，该方法检测人血浆中7-酮基胆固醇，重现性良好，且加样回收率良好，从而提高检测结果的准确度，消除系统误差。此外，在本发明实施例中，一标准溶液中7-酮基胆固醇的色谱图可以如图4所示；一标准溶液中7-酮基胆固醇同位素内标的色谱图可以如图5所示；一血浆样本中7-酮基胆固醇的色谱图可以如图6所示；一血浆样本中7-酮基胆固醇同位素内标的色谱图可以如图7所示。由图4-7可知，血浆样本中7-酮基胆固醇的保留时间与其标准工作溶液一致。该方法以同位素标记物为内标物，使得目标化合物的识别更为准确，分析时间短、干扰小，内标定量适宜特异性强、准确度和灵敏度高。综上所述，本发明的实施例具有至少如下有益效果：1、本发明实施例中，检测血液中7-酮基胆固醇含量的方法包括：利用高效液相串联质谱仪分别检测至少三个标准溶液，得到各个标准溶液的色谱图，该标准溶液含浓度已知的7-酮基胆固醇和内标物；根据得到的标准溶液的色谱图，拟合得到标准曲线方程；处理待检测血液得到血液样品，并加入浓度已知的内标物，经样品前处理以得到待测样品；在相同检测条件下检测待测样品得到色谱图；根据待测样品的色谱图和标准曲线方程，得到待检测血液中7-酮基胆固醇的含量。因此，本发明实施例能够检测血液中7-酮基胆固醇的含量。2、本发明实施例中，将内标法与高效液相色谱质谱联用法相结合，使干扰因素大大减少，且特异性强、灵敏度高、检测结果更为准确，同时分析时间缩短。3、本发明实施例中，以同位素标记物为内标物，使得目标化合物的识别更为准确，分析时间短、干扰小，内标定量适宜特异性强、准确度和灵敏度高。需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个......”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同因素。最后需要说明的是：以上所述仅为本发明的较佳实施例，仅用于说明本发明的技术方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。当前第1页12