鉴别复原乳和超高温灭菌乳的方法与流程

本发明涉及仪器分析、食品检验领域，具体而言，涉及鉴别复原乳和超高温灭菌乳的方法。

背景技术：

复原乳又称“还原乳”或者“还原奶”，是指牛奶经浓缩、干燥成为浓缩乳或者乳粉，再添加适量的水，制成与生乳中水、非脂固形物比例相当的乳液。由于复原乳是由乳粉勾兑而成，乳粉经过高温处理后，营养成分在氨基酸、蛋白质、维生素和糖类等方面与原料奶相比有较大的损失，特别是一些维生素、免疫球蛋白、乳铁蛋白、含硫氨基酸、赖氨酸等损失严重，而纯牛奶中的营养成分基本保存。

目前存在的以复原乳冒充鲜奶的做法，不仅降低了乳品的营养价值，而且严重侵犯了消费者合法权益。因此，研究合适的鉴别指标及完善复原乳的检测方法十分必要，既能够有效保护消费者的知情权，又能够净化和规范乳品市场。

目前，检测复原乳的方法主要集中在热处理后所导致的热损害产物的检测方面，如乳品中的荧光物质、热变性蛋白以及美拉德反应产物(糠氨酸、乳果糖)等。已有的国标方法中，利用高效液相色谱和酶解法检测液态乳中的糠氨酸和乳果糖的含量，这种方法检测周期长、前处理复杂、操作繁琐，而且上述两种指标容易受到储藏时间和环境的影响，很容易造成假阳性，不能适应大批量的抽样检测。因此，建立更加准确、高效地判别复原乳和超高温灭菌乳的检测方法具有重大的现实意义。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供鉴别复原乳和超高温灭菌乳的方法，所述方法基于高效液相色谱-高分辨质谱联用，方便、灵敏、精确，能够实现对超高温灭菌乳和复原乳的快速自动化判别。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

鉴别复原乳和超高温灭菌乳的方法，其包括步骤：

a)采用高效液相色谱-高分辨质谱分别采集复原乳和超高温灭菌乳的乳样的非靶向代谢组学数据，并分别在两者的非靶向代谢组学数据中提取两者的特征信息；

b)建立分析模型，并对所述特征信息进行分析，确定所述复原乳和所述超高温灭菌乳的差异性代谢物；

c)构建鉴别所述复原乳与所述超高温灭菌乳的拟靶向代谢组学检测方法以筛查步骤b)中所述差异性代谢物，获得所述差异性代谢物的特征信息；

d)基于步骤c)中获得的所述差异性代谢物的特征信息，构建pca-class判别分析模型，并基于所述pca-class判别分析模型实现对待测乳样的判定。

可选地，步骤a)中，采用高效液相色谱采集数据的条件包括：

以流动相a和流动相b进行梯度洗脱；

正离子模式下，流动相a为0.05v/v％～0.15v/v％的甲酸-水溶液，优选为0.1v/v％的甲酸-水溶液；流动相b为0.05v/v％～0.15v/v％的甲酸-乙腈溶液，优选为0.1v/v％的甲酸-乙腈溶液；

负离子模式下，流动相a为3mm～8mm乙酸胺-水溶液，优选为5mm乙酸胺-水溶液；流动相b为3mm～8mm乙酸胺-乙腈溶液，优选为5mm乙酸胺-乙腈溶液。

可选地，所述梯度洗脱的程序为：

正离子模式下，0～5min时，流动相b2v/v％；5～8min时，流动相b2v/v％～10v/v％；8～18min时，流动相b10v/v％～95v/v％；18.1min以后，流动相b100v/v％，并平衡1～2min；

负离子模式下，0～5min时，流动相b2v/v％；5～8min时，流动相b2v/v％～10v/v％；8～16min时，流动相b10v/v％～95v/v％；16.1min以后，流动相b100v/v％，并平衡1～2min。

可选地，所述梯度洗脱的流速为0.2～0.5ml/min，优选0.4ml/min。

作为一种实施方式，步骤a)中，采用高效液相色谱采集数据的条件包括：

正离子模式下：流动相a和b分别为0.1％甲酸-水和0.1％甲酸-乙腈溶液，流动相b梯度为0min，2％；5min，2％；8min，10％；12min，95％；18min，95％；18.1min，100％；平衡1.9min，流速0.4ml/min，进样量为5μl，柱温40℃。负离子模式下：流动相a和b分别为5mm乙酸胺-水和5mm乙酸胺-乙腈溶液，流动相b梯度为0min，2％；5min，2％；8min，10％；12min，95％；16min，95％；16.1min，100％；平衡1.9min，流速0.4ml/min，进样量为5μl，柱温40℃。

可选地，步骤a)中，采用所述高分辨质谱采集数据的条件包括：

采集模式为数据关联采集模式(ida)；

采用电喷雾离子源(esi)，数据采集范围m/z为50da～1000da；

正离子模式下，喷雾电压(ionsprayvoltage)为4000v～6000v，优选5500v；去簇电压为20v～120v，优选80v；

负离子模式下，喷雾电压为-6000v～-4000v，优选-4500v；去簇电压为-20v～-120v，优选-80v；

气帘气压力(curtaingas，cur)为15psi～40psi，优选35psi；喷雾气压为15psi～70psi，优选50psi；加热辅助气压力(gs2)为0psi～70psi，优选50psi；离子源温度(temperature，tem)为450℃～550℃，优选550℃；碰撞能为35±15ev。

可选地，所述高分辨质谱为高分辨飞行时间质谱。

作为一种实施方式，利用高分辨质谱hplc-q-tof，对乳样进行非靶向代谢组学分析。

本发明的技术方案中，采用高分辨四极杆飞行时间质谱仪，其具有高通量、高灵敏度、高精密度的分析技术，能够全面分析特定生物样品中的所有代谢物，并对提取液中的代谢物进行定性、定量的分析，检测能力能够达到痕量水平。同时，结合化学计量学方法，能够鉴别出超高温灭菌乳和复原乳中各表征因子，并建立可行性强，准确度高的复原乳和超高温灭菌乳判别模型，能够为乳品的真实性鉴别提供了强有力的技术支撑。

可选地，步骤a)中在提取特征信息之前，还包括对所述非靶向代谢组学数据进行预处理的步骤；

所述预处理包括：进行噪音过滤及基线校正后，对色谱峰进行提取、对齐、标准化和归一化。

可选地，所述色谱峰的提取范围为50da～1000da；质量宽度为0.01da～0.03da，优选为0.02da。

可选地，当所述色谱峰的强度<100或者信噪比<3时，不进行提取。

作为一种实施方式，所述预处理包括对原始数据进行提取、滤噪、基线校正、保留时间校准、峰识别、峰匹配以及获得二维数据矩阵，包括质荷比、保留时间、峰面积等。

可选地，提取所述特征信息的过程包括：

将经预处理的色谱峰数据中缺失值>50％的特征信息剔除，剩余缺失值以该特征信息最小值的1/2计算，进行缺失值填充；

将相对标准偏差>20％的特征信息剔除，并对色谱峰数据进行标准化处理，提取特征信息。

可选地，步骤b)中，所述分析模型选自非监督分析、有监督分析或化学计量学分析中的至少一种。

可选地，所述分析模型包括主成分分析、偏最小二乘方差分析、单因素方差分析或化学计量学分析中的至少一种。

可选地，步骤d)中，通过交叉验证对所述pca-class判别分析模型进行训练。

所述交叉验证的方法包括：

采用7折交叉验证，将总体样本平均分为7组，将每个子集数据分别做一次验证集，其余的6组子集数据作为训练集，建立模型；

使用所建立的模型预测缺失组的残差平方和，重复操作7次，获得总体的残差平方和；

若增加主成分将减少总的残差平方和，则保留该主成分；反之，则将该主成分剔除，从而获得模型的预测能力。

作为一种实施方式，鉴别复原乳和超高温灭菌乳的方法包括步骤：

1)用高分辨质谱分别检测用全脂奶粉配制的复原乳和超高温灭菌乳的乳样，对样品进行前处理和非靶向代谢组学数据信息的采集。

2)对非靶向代谢组学数据进行预处理，对筛选出的代谢物进行特征信息的提取，然后结合非监督分析和有监督分析数据分析，对特征值信息进行化学计量学分析，采用主成分分析(pca)和正交偏最小二乘方差(opls-da)的分析模型，确定可将两种乳完全分类的显著性差异代谢物；

3)基于步骤2)确定的差异代谢物，构建鉴别超高温灭菌乳与复原乳拟靶向筛查的方法(idatomrm)，用于针对特定代谢物的筛查工作。

4)基于拟靶向筛选出的差异性代谢物特征信息构建pca-class判别分析模型，对所构建的模型进行训练，实现对未知样品鉴别。

可选地，所述乳样的制备方法包括：

将所述复原乳或所述超高温灭菌乳离心，取下层液体溶于有机溶剂后再次离心，取上层溶液，经微孔过滤膜过滤后，获得所述乳样。

可选地，所述离心的转速为8×10³rpm～1×10⁴rpm；所述离心的时间为10min～30min。

可选地，所述有机溶剂选自乙腈、甲醇、水，或者它们的混合溶剂中的至少一种。

可选地，所述有机溶剂为乙腈。

可选地，所述微孔过滤膜的孔径为0.2～0.5μm，优选为0.22μm。

可选地，所述复原乳包括浓缩乳和/或乳粉中的至少一种的调制乳。

可选地，所述复原乳为全脂奶粉的调制乳。

可选地，以蛋白质含量计，所述复原乳的浓度为1～10g/100ml；优选为3g/100ml。

作为一种实施方式，所述复原乳采用全脂奶粉溶于水，并按照蛋白质含量3.0g/100ml浓度配制。

作为一种实施方式，所述乳样的制备方法包括：将复原乳或超高温灭菌乳离心，取下层液体溶于乙腈，再离心分离出上层溶液，用0.22μm微孔滤膜后，获得乳样，上机测定。

可选地，所述pca-class判别分析模型以二维图像输出；

当待鉴别样品的二维图像落入第四象限时，判定为复原乳；

当待鉴别样品的二维图像落入第二象限时，判定为超高温灭菌乳；

当待鉴别样品的二维图像落入第一象限时，表示未作出判别；

当待鉴别样品的二维图像落入第三象限时，表示出现误判。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明提供的鉴别复原乳和超高温灭菌乳的方法，采用高分辨四极杆飞行时间质谱仪进行，所述方法简单高效、易操作，并且能够对乳品中代谢物进行全面分析，实现乳品的在线自动化检测，极大提高了样品的检测效率。

(2)本发明提供的鉴别复原乳和超高温灭菌乳的方法，其所建立的鉴别模型可行性强，准确度高，能够为乳品的真实性鉴别提供方便实用的技术支撑。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一种实施方式中，超高温灭菌乳(u)和复原乳(r)的主成分得分图(pca)；其中，a表示在正离子模式下的主成分得分图，b表示在负离子模式下的主成分得分图；

图2为本发明一种实施方式中，基于opls-da模型，超高温灭菌乳和复原乳的偏最小二乘方差判别分析结果；其中，a表示在正离子模式下的opls-da得分图，b表示在负离子模式下的opls-da得分图；

图3为本发明一种实施方式中，超高温灭菌乳(u)和复原乳(r)的不同代谢物丰度的s-plot图；其中，a表示在正离子模式下的s-plot图，b表示在负离子模式下的s-plot图；

图4为本发明一种实施方式中，通过交叉验证获得的受试者工作特征曲线(roc)；其中，a表示在正离子模式下的roc曲线，b表示在负离子模式下的roc曲线；

图5为本发明一种实施方式中，超高温灭菌乳(u)和复原乳(r)的cooman图；其中，a表示在正离子模式下的cooman图，b表示在负离子模式下的cooman图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

作为一种实施方式，本发明中的复原乳是用全脂奶粉溶于水，按照蛋白质含量3.0g/100ml浓度配制。

作为一种实施方式，本发明中的超高温灭菌乳选择市售超高温灭菌奶(uht)。

作为一种实施方式，基于高分辨四极杆飞行时间质谱仪鉴别超高温灭菌奶与复原乳的方法，其包括步骤：

1)乳样的制备

乳样的制备：复原乳是用全脂奶粉溶于水，按照蛋白质含量3.0g/100ml浓度配制。超高温灭菌奶(uht)为市售；将乳品取样、离心，取下层液体溶于乙腈，再离心分离出上层溶液，过0.22μm滤膜后，获得乳样，上机待测。

2)数据的采集和预处理

利用高分辨四极杆飞行时间质谱仪分别检测复原乳和超高温灭菌乳的乳样，采集原始数据；对原始数据进行预处理和分析，进行基线的校正，噪音的去除、保留时间的校准、色谱峰的识别、峰匹配，获得二维数据矩阵，包括质荷比、保留时间、峰面积等。此外，预处理分析方法还包括去除缺失值，剔除峰值响应偏低的峰或者难以正确识别的峰、去除同位素峰，将峰面积作为变量进行提取，归一化处理，最终获得所有代谢物的峰面积。

3)数据分析

对获得的峰面积结果进行无监督的主成分分析(pca)和有监督的正交偏最小二乘方差的分析(orthpls-da)，结合单因素方差分析，最终筛选出可将两种乳分类的表征因子。基于获得的表征因子建立靶向的uplc-ms/ms的检测方法，对样品进行测定获得表征因子的相对峰面积，最后基于筛选出的表征因子构建鉴别超高温灭菌乳与复原pca-class判别分析模型。

实施例1

乳样的采集与制备

采集30个品牌的超高温灭菌乳和30个品牌的全脂奶粉(牛乳粉)，均购自北京、呼伦贝尔两地。其中，采用所采购的全脂奶粉溶于水，按照蛋白质含量3.0g/100ml浓度配制得到复原乳。

复原乳的配制方法为：根据蛋白质含量为每100ml牛乳中含3.0g，将乳粉加入到超纯水中，在水浴锅中恒温至40℃，手摇均质得到复原乳的乳样。

待测乳样的制备：分别取上述超高温灭菌乳和复原乳各2ml，在8000rpm下离心30min，除去分子量大的脂类物质；分离出下层溶液，取1ml，加入2ml乙腈，涡旋5min，沉淀蛋白质；然后在10000rpm下离心10min，分离上层溶液，以0.22μm的微孔过滤膜过滤，上机待测。

非靶向代谢组学数据的采集

利用高效液相色谱-高分辨四级杆飞机时间质谱对上待测乳样进行检测。

实验所用的高效液相色谱仪器，仪器型号为hplc(30a,shimadzu,japan)，色谱柱为c18(zorbaxeclipsec18,3.0mm×150mm,1.8μm,agilent,usa)。正离子模式下：流动相a和b分别为0.1％甲酸-水和0.1％甲酸-乙腈溶液，流动相b梯度为0min，2％；5min，2％；8min，10％；12min，95％；18min，95％；18.1min，100％；平衡1.9min，流速0.4ml/min，进样量为5μl，柱温40℃。负离子模式下：流动相a和b分别为5mm乙酸胺-水和5mm乙酸胺-乙腈溶液，流动相b梯度为0min，2％；5min，2％；8min，10％；12min，95％；16min，95％；16.1min，100％；平衡1.9min，流速0.4ml/min，进样量为5μl，柱温40℃。

实验所用的高分辨四级杆飞行时间质谱仪，仪器型号为q-triple-tof-ms(absciexinc.,fostercity,ca,usa)，采用电喷雾离子源(esi)，数据采集范围m/z：50-1000da，采用数据关联采集模式(ida)模式，动态背景扣除，电喷雾电离正离子模式喷雾电压(ionsprayvoltage)：5500v，去簇电压为70v；负离子模式去簇电压为-70v。喷雾电压：-4500v；气帘气压力(curtaingas，cur)：30psi；雾化气压力(gs1)：45psi；加热辅助气压力(gs2)：65psi；离子源温度(temperature，tem)：550℃；碰撞能为35±15ev。

非靶向代谢组学数据的预处理和特征提取

利用高分辨质谱数据提取软件peakview2.2(absciex,usa)，对检测到的全部色谱峰进行噪音的过滤及基线的校正，进行色谱峰的提取、对齐、标准化和归一化，然后对色谱峰的峰特征进行提取，获得全部代谢物的相对峰面积和保留时间，然后进行数据的可视化分析。提取峰的参数：质量数范围：50da～1000da，质量宽度为0.02da，峰强度低于100或者信噪比小于3的峰不进行提取。最终，在正负离子模式下共得到1885和1077化合物。

将提取到的所有的代谢物的所有信息导入数据预处理软件excel中。首先，缺失值估计，将大于50％的缺失值的特征值剔除，剩下的缺失值用该特征值在所有样品中的最小值的一半来计算，进行缺失值的填充；其次，特征值的过滤，根据质控样品的相对标准偏差大于20％的特征值进行剔除。再次将所有的数据进行标准化处理。最终，导入数据处理软件spss22.0和scima-p中，进行可视化分析。

多元统计分析

作为多变量统计分析的重要手段，无监督的主成分分析(pca)和有监督正交偏最小二乘分析(orthpls-da)被应用在复原乳和超高温灭菌乳的潜在的差异性生物标志物的鉴别当中。

如图1所示，在pca得分图上，质控样品(qc)在得分图中聚集度很高，说明前处理和仪器状态良好，分析方法可靠、准确；其次，96.7％的样品都落在95％的置信区间当中，前五个成分对差异的累计解释度超过了60％，并且有很好的分离度，说明pca模型对于两种奶有很好的区分鉴别能力，超高温灭菌奶(u)和复原乳(r)之间存在明显的差异，可以通过pca进行很好的区分。

因此，进一步采用有监督的分析方法orthpls-da模型，对复原乳和uht奶的显著性差异代谢物进行筛选，结果如图2所示。r²x(cum)、r²y(cum)分别是表示模型对x和y矩阵的解释能力，q²y(cum)表示模型的预测能力，r²y(cum)和q²y(cum)值越接近1，说明模型越稳定可靠。在opls-da模型中，在正离子模式下计算前两个主成分的计算的r²y(cum)和q²y(cum)分别为0.967和0.925。在负离子模式下计算前两个主成分r²y(cum)和q²y(cum)分别为0.966和0.921，说明两个模型的均具有良好的预测能力(q²>0.5)。

基于opls-da模型的s-plot图筛选区分复原乳的生物标记物，图3表示变量的协方差和相关性信息的总和，通常是离中心越远的点，对分类的影响越大，同时结合变量的重要性(variableimportanceintheprojection,vip)大于1的原则，筛选出一系列的差异性的生物标志物，然后结合单因素方差分析(t-test，spss22.0)检验后，最终筛选出正离子模式下94个代谢物和负离子模式下71差异代谢物，分别列于表1和表2中。

拟靶向代谢组学方法的建立

基于非靶向代谢所筛选出的差异代谢物，优化其母离子、子离子信息、去簇电压、碰撞能参数，通过四级杆线性离子阱串联质谱(uplc-ms/ms)建立拟靶向(mrm)代谢组学方法，色谱条件和质谱条件与非靶向检测方法参数一致，最终筛选出86种代谢物进行最终的拟靶向检测。通过pca得分图(图1)可以看出，两种牛奶存在明显的差异。如图4所示，通过交叉验证获得的受试者工作特征曲线(roc)，曲线下面积(auc)用于估算每个模型的准确度，所有研究模型均为1，说明模型有很好的判别能力。

判别模型的建立

以pca-class模型用作最终模型的建立和预测，临界距离(dcrit)的临界极限由显着性水平0.05的f检验确定，决定了数据与分类模型的距离。图5所示的cooman图显示了建模集和预测集(20个真实样品)交叉分类验证的结果。由图5中可以发现，在正负离子模式下，能够明显看出实际样品可以实现很好的分类，20个样品在正离子模式下的鉴别率超过了90％，负离子模式下鉴别率达到了100％。

表1正离子模式下基于lc-ms/ms的靶向代谢组学差异性代谢物的质谱信息

表2负离子模式下基于lc-ms/ms的靶向代谢组学差异性代谢物的质谱信息

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。