一种紫草液相分离时色谱峰的质量的定量分析方法与流程

1.本发明涉及一种相对定量分析方法，尤其涉及新疆紫草乙醇提取物的石油醚萃取样品液相分离时各个色谱峰的相对定量；属于中草药分析技术领域。


背景技术：

2.新疆紫草为紫草科软紫草属植物。作为传统的中药，新疆紫草具有多种生物活性，如抑菌、伤口愈合、抗炎、抗肿瘤等。新疆紫草中的主要成为为萘醌类成分，如紫草素、乙酰紫草素、β,β-二甲基丙烯酰紫草素等。
3.关于紫草的成分含量定量测定方法文献主要有：孙健文等采用反相高效液相色谱法法同时测定新疆紫草中紫草素、乙酰紫草素、β,β-二甲基丙烯酰紫草素的含量(中国药房,2018,29(04):455-457.)。澜兰
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艾则孜等建立了高效液相色欧阳测定紫草中左旋紫草素含量的方法(新疆中医药,2014,32(06):47-49.)等。目前对紫草类药材的定量测定，多数是对单一或者多个萘醌类成分的同时测定，检测器多数用的是紫外检测器。也有一些研究采用了不同于紫外的检测方法进行定性定量分析，例如，liao等采用高效液相色谱-飞行时间质谱法同时测定了紫草(包括新疆紫草，硬紫草和内蒙紫草)中9个萘醌类和4个呋喃类化合物(chin pharm j(中国药学杂志),2016,51:1212-1218.j chromatogr a,2015,1425:158-172.)。tao等利用高效液相色谱-电化学法(hplc-ecd)法测定了紫草中紫草素、乙酰紫草素、去氧紫草素、异丁酰紫草素、β,β-二甲基丙烯酰紫草素的含量(j yangzhou u(nat sci ed)(扬州大学学报
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自然科学版),2017,20:33-37.)。而本发明采用了一种电喷雾检测器(cad)进行定量分析，针对复杂的新疆紫草样品，做到各个成分的定量。cad属于通用型检测器，是一种新型原理的、高灵敏度、重现性较好的检测器，它基于雾化检测器的原理，洗脱液经雾化后形成颗粒，经过漂移管干燥后与带电氮气碰撞，使得目标化合物带上正电荷，最后，通过静电计测量电荷的量，该测量值与目标化合物的质量成一定比例关系。它的检测技术完全不依赖于化合物的分子结构，达到了通用性目的，能对大多数化合物提供一致响应性，同时能达到较高的灵敏度和低检测极限，很容易检测到纳克数量级的化合物，并且与液相色谱分离系统联用，其重现性、稳定性很好，因此能准确的用于定量分析或半定量分析。


技术实现要素：

4.本发明提供了一种同时检测新疆紫草中多种化学成分的相对定量分析方法，该方法完善了新疆紫草定量评价体系，采用的流动相系统比较简单，结果方法快速、准确,重现性好，检测周期短，且仅使用一种对照品即可达到准确定量，因此可解决对照品数量不足的情况下对于新疆紫草的定量分析。
5.为了实现上述技术，本发明提供了一种新疆紫草的液相色谱-电喷雾检测器(hplc-cad)串联的定量分析方法，其包括以下步骤，：以β,β-二甲基丙烯酰紫草素甲醇溶液为参比溶液，以新疆紫草的石油醚萃取物甲醇溶液为待测溶液，采用液相色谱-电喷雾检测
器检测，根据检测结果计算待测溶液中多个成分的含量。
6.优选的方案，所述的待测溶液的制备方法为：826g新疆紫草药材粉碎后过2号筛，经70％-95％乙醇常温下冷浸萃取72小时，收集滤液，滤渣用同样的方法再冷浸萃取2次，每次72小时，收集并合并滤液在50-55℃下减压旋蒸干燥，干燥后样品再用石油醚萃取，收集石油醚层液体，30-40℃下减压旋蒸干后，取14mg石油醚层干燥后的样品复溶于1ml甲醇中得到的样品。
7.优选的方案，所述的参比溶液包括一系列不同浓度的β,β-二甲基丙烯酰紫草素甲醇溶液，由6mg/ml的β,β-二甲基丙烯酰紫草素甲醇溶液按倍数逐级稀释得到。
8.较优选的方案，所述新疆紫草粉末包括新疆紫草全草、根、茎、叶中至少一种粉末。
9.优选的方案，所述的高效液相色谱的条件为：
10.色谱柱为c18色谱柱；
11.流动相a为乙腈，流动相b为水，流速为0.7-1ml/min，柱温为25-35℃，进样量为10-100μl；
12.采用等度洗脱程序，0-50min内，流动相a和流动相b的体积比为70％:30％；
13.较优选的方案，色谱柱为华谱c18色谱柱，内径为4.6，柱长为250mm，填料粒径为5μm；流动相a为乙腈，流动相b为水，流速为1ml/min，柱温为30℃；
14.优选的方案，所述的电喷雾检测器的条件为，雾化温度为30-80℃。
15.较优选的方案，所述的电喷雾检测器的条件为，雾化温度为35℃。
16.优选的方案，以一系列不同浓度的β,β-二甲基丙烯酰紫草素的甲醇溶液为参比，建立参比样品log(质量)与log(cad峰面积)的关系，采用加权1/x2最小二乘法进行回归计算，求得的线性回归方程与相关系数；再对待测样品溶液进行检测，并根据检测结果计算待测样本液相分离时各个色谱峰的质量；其中，x为参比log样品质量。
17.本发明的定量分析方法可靠，简单高效，灵敏度，准确度高。
附图说明
18.图1，参比样品β,β-二甲基丙烯酰紫草素的log(质量)与log(cad峰面积)标准曲线图；
19.图2，新疆紫草待测样品分离的高效液相色谱-电喷雾检测器色谱图。
具体实施方式
20.下面结合具体实施方式，对本发明做进一步的详细说明。
21.液相色谱型号：ultimate3000
22.二极管阵列检测器型号:ultimate 3000rs diode array detector
23.电喷雾检测器型号：thermo corona cad
24.实施例1：
25.参比样品β,β-二甲基丙烯酰紫草素的log(质量)与log(cad峰面积)关系建立，采用液相色谱-二极管阵列检测器-电喷雾检测器串联检测器，所述的高效液相色谱条件为：色谱柱为华谱c18色谱柱，内径为4.6，柱长为250mm，填料粒径为5μm；流动相流动相a为乙腈，流动相b为水，流速为1ml/min，柱温为30℃；采用等度洗脱条件，0-50min内，流动相a和
流动相b的体积比列为：70％:30％；电喷雾检测器的雾化温度为35℃。
26.参比溶液的配制，取β,β-二甲基丙烯酰紫草素(美国tci公司，纯度90％)对照品粉末，用甲醇配制成6mg/ml的母液，然后采取2倍体积逐级稀释，总共得到12个浓度。对照品溶液由浓度从小到大进样，分别进样20μl，检测电喷雾色谱峰面积。建立参比样品log(质量)与log(cad峰面积)的关系，采用加权1/x2最小二乘法进行回归计算，求得的线性回归方程与相关系数，r2＝0.9962，回归方程为y＝0.7465*x+0.5627，以log(质量)横坐标，log(cad峰面积)为纵坐标。利用数据处理软件graph pad prism 6软件做出标准曲线图(图1)，
27.其中图1的原始数据如下：
[0028][0029][0030]
日间重复性考察，6个浓度的β,β-二甲基丙烯酰紫草素系列标准品溶液(6mg/ml,1.5mg/ml,0.375mg/ml,0.09375mg/ml,0.02344mg/ml,0.005859mg/ml)，按照上述同样的液相色谱-电喷雾检测器方法连续4天进样，每天分别进样1次，高效液相色谱条件为：色谱柱为华谱c18色谱柱，内径为4.6，柱长为250mm，填料粒径为5μm；流动相流动相a为乙腈，流动相b为水，流速为1ml/min，柱温为30℃；采用等度洗脱条件，0-50min内，流动相a和流动相b的体积比列为：70％:30％；电喷雾检测器的雾化温度为35℃，进样量2 0μl。连续4天，β,β-二甲基丙烯酰紫草素的峰面积rsd如下表，可以看到rsd在10％之内，说明之间重复性良好，方法稳定可靠。sd：标准偏差；mean:平均值；rsd:相对标准偏差；
[0031]
浓度(mg/ml)0.0058590.023440.093750.3751.56第一天0.67652.09346.675218.501247.1963106.5273第二天0.59731.87896.345717.695444.855105.7286第三天0.56581.75695.613615.416839.069292.1378第四天0.5451.7435.867116.333339.161691.6445sd0.057720.16220.47591.37694.102708.2286mean0.596151.868056.125416.986742.5705399.00955rsd(％)9.682178.680967.76948.10579.63748.31087
[0032]
实施例2：
[0033]
待测样品溶液(新疆紫草的乙醇提取物的石油醚萃取物甲醇溶液)，待测样品溶液的制备过程为：826g新疆紫草药材粉碎后过2号筛，经95％乙醇常温下冷浸萃取72小时，收集滤液，滤渣用同样的方法冷浸重新再萃取2次，每次72小时，收集并合并滤液在50-55℃下减压旋蒸干燥，干燥后样品再用5l石油醚萃取，收集石油醚层液体，30-40℃下减压旋蒸干后，取14mg石油醚层干燥后的样品复溶于1ml甲醇中得到的样品。
[0034]
待测样品溶液采用液相色谱-二极管阵列检测器-电喷雾检测器串联检测器分析，液相色谱色条件为：色谱柱为华谱c18色谱柱，内径为4.6，柱长为250mm，填料粒径为5μm；流动相流动相a为乙腈，流动相b为水，流速为1ml/min，柱温为30℃；采用等度洗脱条件，0-50min内，流动相a和流动相b的体积比列为：70％:30％；电喷雾检测器的雾化温度为35℃。进样量这里设置了为30μl，待测样品的分离的cad色谱图如图2，根据实施例1的对照品溶液的log(质量)与log(cad峰面积)的关系，并根据待测样品溶液cad色谱峰面积检测结果计算待测样本液相分离时各个色谱峰的质量，同时也能准确的得到各个色谱峰的质量占比。例如：当待测样品进样量为30μl，通过cad峰面积带入标曲可以得到色谱峰f1-f10的成分的质量和质量占比如下表：
[0035][0036]