一种减肥茶中西布曲明的拉曼快速检测方法与流程

本发明涉及保健品中违禁减肥药检测技术领域，尤其涉及一种减肥茶中西布曲明的拉曼快速检测方法。

背景技术：

西布曲明及其盐酸盐是一种中枢神经抑制剂，具有兴奋、抗抑郁、抑食等作用。主要通过其胺类(仲胺和伯胺类)代谢产物而产生作用，其主要机理为抑制去甲肾上腺素、5-羟色胺和多巴胺的再摄取而增强饱食感。1997年，西布曲明获美国fda批准上市。由于西布曲明可能增加服用者患心脏病及中风几率，中国药监局已于2010年10月强制停止在中国大陆生产销售。

关于保健食品中西布曲明的检测尚无正在执行的国家标准和行业标准，但是国家食品药品监督管理总局分别于2017年2月和11月分别发布了《食品中西布曲明等化合物的测定》和《保健食品中75种非法添加化学药物的检测》等两条补充检验方法。两条补充检验方法均采用高效液相色谱-串联质谱测定，虽然有比较优秀的检出限，但是实验成本高昂，检测时间需要数个小时，难以用于快速检测及大批量抽检活动。

针对补充检验方法中的不足，以及目前尚无关于拉曼增强快速检测方面的技术，为此我们设计出了一种减肥茶中西布曲明的拉曼快速检测方法来解决以上问题。

技术实现要素：

本发明的目的是为了解决现有技术中实验成本高昂，检测时间需要数个小时，难以用于快速检测及大批量抽检活动，而提出的一种减肥茶中西布曲明的拉曼快速检测方法。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种减肥茶中西布曲明的拉曼快速检测方法，包括以下操作步骤：

s1、样品制备：取适量减肥茶固体，加入5-50倍质量体积的水溶液，涡旋振荡1min或超声提取3min左右，得到减肥茶液；

s2、前处理：将s1中得到的减肥茶液离心至澄清，取1体积上清液，加入0.5-2体积乙酸乙酯或相似有机溶剂，振荡萃取，静置分层；取出有机相，按0.01-0.05g/ml的比例加入gcb，振荡后，取出有机相，加入0.5-2体积的1mm-1m酸液进行反萃取，取水相待测；

s3、检测：在拉曼检测管中，加入s2中水相待测样品，再加入金属纳米粒子和凝聚剂，混匀进行拉曼检测。

优选的，所述s1中，减肥茶固体为拆开包装后的固体颗粒或整个渗透包装，优选的，减肥茶产品本身为液体时，可以不需加后续操作。

优选的，所述s1中，加入5-50倍质量体积的水溶液，所述水溶液可以是温水或室温水。

优选的，所述s2中，相似有机溶剂包含乙酸乙酯、戊烷、己烷、环己烷、庚烷、石油醚、二氯甲烷、三氯甲烷和四氯化碳的一种或多种混合溶液，优选的，乙酸乙酯及极性在2-5之间的混合溶剂。

优选的，所述s2中，所述1mm-1m酸液包含盐硫酸、硝酸、盐酸、磷酸和乙酸的一种或多种混合溶液。

优选的，所述s3中，金属纳米粒子为40-60nm粒径的金纳米粒子，所述金纳米粒子的合成步骤为：将50ml0.01％的氯金酸加热至沸腾，迅速加入0.5ml1％柠檬酸钠，高速搅拌30min，冷却至室温。

优选的，所述s3中，凝聚剂包含含氯离子无机化合物，所述含氯离子无机化合物为包含钠、钾、镁、钡、铁、锌的氯盐或钠、钾、镁、钡、铁、锌盐与盐酸的混合溶液。

优选的，所述s3中，待测液、金属纳米粒子和凝聚剂加入比例为1:1-10:0-2。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明通过简单的提取、萃取和除杂步骤，可以在5-10min内完成前处理操作，最后通过简便快捷的表面拉曼增强方法检测，得出带有分子振动和转动信息的拉曼光谱谱图；可以根据谱图信息进行定性和线性范围内的定量判断，对比除hplc-ms外的其它检测方法，是最有效的控制假阳性、假阴性结果的检测方法，并利用金胶在酸性条件下通过氯离子凝聚剂对目标分子的有效检出，足使本发明的检出限远低于市面上减肥产品中西布曲明的有效添加量(＞0.5％)，达到ppm级别，满足对减肥产品中违禁添加药物的快速筛查；该方案能够快速、灵敏地识别减肥茶中的西布曲明，前处理简单、试剂廉价，检测方式快捷，可以在10分钟内得到反映分子结构信息的拉曼光谱谱图，根据拉曼光谱位移识别西布曲明特征峰及其强度，可以定性和定量判断减肥茶中西布曲明存在情况，在食品快速检测领域具有广阔的应用空间。

附图说明

图1为西布曲明标准品表面增强拉曼光谱特征信号图；

图2为实施例1中某减肥茶不同浓度加标的表面增强拉曼光谱特征信号图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。

参照图1-2，一种减肥茶中西布曲明的拉曼快速检测方法，包括以下操作步骤：

s1、样品制备：取适量减肥茶固体，加入5-50倍质量体积的水溶液，涡旋振荡1min或超声提取3min左右，此处加入水溶液的作用是提取西布曲明之用，所加入的质量体积在5-50倍为优化条件，加入水太少会影响整体提取效率和基质富集过量，加入水太多会影响单位体积提取液的提取浓度，增大后续萃取步骤试剂使用量；涡旋振荡和超声时间视提取效率而定，当所加入水为温水时，可以适当减少提取时间；

s2、前处理：将上述减肥茶液离心至澄清，取1体积上清液，加入0.5-2体积乙酸乙酯或相似有机溶剂，振荡萃取，静置分层；取出有机相，按0.01-0.05g/ml的比例加入gcb，振荡后，取出有机相，加入0.5-2体积的1mm-1m酸液进行反萃取，取水相待测；加入乙酸乙酯等溶剂是为了萃取提取液中的西布曲明，加入量太多或太少都会影响西布曲明在有机相的分配浓度，经过大量实验证明，加入0.5-2体积乙酸乙酯或相似有机溶剂为最优化条件；而后在萃取液中添加gcb的是通过gcb的多孔结构吸附减肥茶中基质，gcb添加量过少会导致除基质不充分，过多会导致西布曲明也被过量吸附，按0.01-0.05g/ml的比例加入gcb是最优化条件。最后加入酸液的目的是通过西布曲明在酸液中的溶解优势反萃取有机相中的目标物，1mm-1m为有效反萃取的酸液浓度范围，大于1m则由于酸度太高易造成腐蚀而不推荐；

s3、检测：在拉曼检测管中，加入上述s1中水相待测样品，再加入金属纳米粒子和凝聚剂，混匀进行拉曼检测；

具体地，所述s1中，减肥茶固体可以是拆开包装后的固体颗粒或整个渗透包装，当减肥茶产品本身为液体时，可以不需加后续操作；此处减肥茶也可以是具有其它名称的，相同性质的减肥功能饮料；

其中，所述s1中，加入5-50倍质量体积的水溶液，其中水溶液可以是温水或室温水；温水可以根据浸泡效率适当降低涡旋或超声时间；

具体地，所述s2中，相似有机溶剂包含乙酸乙酯、戊烷、己烷、环己烷、庚烷、石油醚、二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳及其任意比例混合溶液；优选乙酸乙酯及极性在2-5之间的混合溶剂；

其中，所述s2中，1mm-1m酸液包含盐硫酸、硝酸、盐酸、磷酸、乙酸及其任意比例混合溶液；

具体地，所述s3中，金属纳米粒子为40-60nm粒径的金纳米粒子。金纳米粒子的合成：将50ml0.01％的氯金酸加热至沸腾，迅速加入0.5ml1％柠檬酸钠，高速搅拌30min，冷却至室温；

其中，所述s3中，凝聚剂包含含氯离子无机化合物，含氯离子无机化合物为包含钠、钾、镁、钡、铁、锌的氯盐，或钠、钾、镁、钡、铁、锌盐与盐酸的混合溶液，优选钠的氯盐或其盐酸混合溶液；

具体地，所述s3中，待测液、金属纳米粒子和凝聚剂加入比例为1:1-10:0-2；由于待测液中包含的基质具有凝聚作用，当反萃取溶液中含有氯离子时，是否添加凝聚剂视待测液与金属纳米粒子的凝聚情况而定。

实施例一

对减肥茶中不同浓度西布曲明加标的检测，具体步骤如下：

1、标准品配置：准确称取西布曲明0.1g(精确至0.0001g)，用超纯水溶解并定容至10ml，标记为10000ppm；

2、标准系列溶液配置：分别取上述10000ppm标准品1ml，2ml，5ml用超纯水定容至10ml，分别标记为1000ppm，2000ppm，5000ppm。

3、样品加标：分别取1g减肥茶固体颗粒至15ml离心管中，分别均匀加入超纯水，1000ppm，2000ppm，5000ppm西布曲明标准品100ul，标记为空白，100ppm，200ppm和500ppm西布曲明模拟样品；

4、样品制备：在上述离心管中加入10ml去离子水，涡旋振荡1min；

5、前处理：取上述减肥茶液体样品1ml于2ml离心管中，5000rpm离心3min；收集上清液(小于1ml)于2ml离心管中，并加入1ml乙酸乙酯，振荡10s，静置分层；取上层(小于1ml，大于0.5ml)于2ml离心管中，加入0.01ggcb，振荡10s，静置10s；取上清液于0.5ml，加入0.5ml0.1mhno3，振荡10s，静置分层，下层即为待测液；

6、检测：取100ul待测液，加入100ul0.1mnacl溶液和200ul金纳米粒子，混匀后在785拉曼上检测，检测结果得出附图2。

本发明利用水提取减肥茶固体中的西布曲明，通过极性有机溶剂萃取和固相除杂，再通过酸液进行反萃取，可以在除去减肥茶基质的基础上有效提取出探针分子；结合表面增强拉曼技术，采用金属纳米粒子对探针分子实现特异性的信号增强，能够成功避开基质干扰并得到探针分子的拉曼增强信号。本发明的检测方法对西布曲明标准品的检出限可达0.1mg/kg，减肥茶实际样品中的检出限可达50mg/kg，远低于市场中减肥类保健品中实际添加浓度。图1为西布曲明标准品表面增强拉曼光谱特征信号图，横坐标是拉曼位移，纵坐标是拉曼信号，其特征峰位移在636，764，1093cm^-1，其中1093cm^-1是主要特征峰。图2是本发明实施例1中对减肥茶及其加标模拟样品的表面增强拉曼

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。