四味珍层冰硼滴眼液指纹图谱的建立方法及其指纹图谱与流程

本发明属于中药分析
技术领域：
，涉及中药制剂的质量控制方法，具体涉及中药制剂四味珍层冰硼滴眼液高效液相色谱法指纹图谱的建立方法及其指纹图谱。
背景技术：
：中药指纹图谱是指某些中药材或中药制剂经过适当的处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图。它可以较全面的反映药材所含化学成分的种类和数量，有效地体现中药成分的整体性和综合作用，以其快速、准确等特点已被广泛运用于中药分析鉴定和质量控制等方面，也受到了国际社会的认可，已成为国内外公认的鉴别中药品种和评价中药质量的最有效手段。四味珍层冰硼滴眼液中的主要成分为珍珠层粉，珍珠层粉是由蚌科动物三角帆蚌hyriopsiscumingii(lea)、褶纹冠蚌cristariaplicata(leach)等贝壳的珍珠层经加工磨制成的粉末，是传统中药，收载于《中国药典》2015版一部，具有平肝潜阳，退翳等功效。珍珠层粉经过水解后，获得珍珠层粉水解液，从而使珍珠层粉中的有效成分更好地发挥作用。据国内有关珍珠层化学成分的报道，珍珠层的主要成分是碳酸钙，含有少量的微量元素和氨基酸等，对其化学成分研究并不深入，这无疑阻碍了珍珠层的进一步开发和利用。因此，为了能够更好的应用珍珠层动物药资源，阐明其药效的化学依据，有必要对其化学成分进行系统的研究。目前经过研究表明，珍珠层中含有寡肽类等化学成分。本发明通过对多份不同批次的四味珍层冰硼滴眼液进行hplc指纹图谱研究，建立了四味珍层冰硼滴眼液的指纹图谱，该图谱能有效地表征四味珍层冰硼滴眼液制剂的质量，有利于全面监控该中药制剂的质量，且该方法具有简便、稳定、精密度高、重现性好等优点，可快速、准确地鉴别产品的真伪优劣。技术实现要素：本发明的目的是提供一种四味珍层冰硼滴眼液指纹图谱的建立方法，以及由此方法得到的四味珍层冰硼滴眼液标准指纹图谱。为达到本发明的目的所采用的技术方案，用高效液相色谱法建立四味珍层冰硼滴眼液指纹图谱的方法，具体包括如下步骤：（1）对照品溶液的制备：精密称取对照品适量，加水溶解并等倍稀释制成对照品储备液；（2）供试品溶液的制备：分别吸取各批次四味珍层冰硼滴眼液1.0～2.0ml，10,000～15,000r/min2～6℃离心10～20min，取上清备用，2～6℃冷藏；（3）色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相为a相：0.08～0.12%tfa-水，b相：60～80%乙腈水溶液-0.08～0.1%tfa水；流速为0.3～0.8ml/min；柱温为20～40℃；检测波长为200～240nm。（4）测定：精密吸取供试品溶液10～30µl注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。优选的，所述步骤（1）中对照品溶液的制备，对照品溶液的浓度为50μg/ml左右。优选的，所述步骤（2）中供试品溶液的制备步骤为：分别吸取各批次四味珍层冰硼滴眼液1.5ml，12,000r/min，4℃离心15min，取上清备用，4℃冷藏。优选的，所述步骤（3）中的色谱条件为：色谱柱采用agilent，eclipsexdb-c18（3.0×150mm，3.5µm），采用梯度洗脱，a相为0.1%tfa-水，b相为70%乙腈水溶液-0.085%tfa水；流速为0.4ml/min；柱温为30℃；检测波长为220nm。所述步骤（3）色谱条件中所述的梯度洗脱，梯度洗脱程序以如下体积浓度配置进行：0min，流动相a为98%的0.1%tfa-水，流动相b为2%的乙腈水溶液-0.085%tfa水（7:3）；20min，流动相a为98%的0.1%tfa-水，流动相b为2%的乙腈水溶液-0.085%tfa水（7:3）；60min，流动相a为90%的0.1%tfa-水，流动相b为10%的乙腈水溶液-0.085%tfa水（7:3）；65min，流动相a为90%的0.1%tfa-水，流动相b为10%的乙腈水溶液-0.085%tfa水（7:3）；70min，流动相a为98%的0.1%tfa-水，流动相b为2%的乙腈水溶液-0.085%tfa水（7:3）；80min，流动相a为98%的0.1%tfa-水，流动相b为2%的乙腈水溶液-0.085%tfa水（7:3）。其中tfa水质量比为7:3。tfa为三氟乙酸，是有机化合物的良好溶剂。优选的，所述步骤（4）测定中，供试品溶液进样量为20µl。优选的，所述指纹图谱中有9个特征共有峰，其中2号峰为l-酪氨酰甘氨酰甘氨酸，4号峰为l-酪氨酰甘氨酸，5号峰为l-酪氨酰甘氨酰甘氨酰甘氨酰甘氨酸，具体如下：1号峰，平均保留时间为12.280min，峰面积为：77.008；2号峰，平均保留时间为13.855min，峰面积为：241.530；3号峰，平均保留时间为17.842min，峰面积为：88.588；4号峰，平均保留时间为23.918min，峰面积为：89.861；5号峰，平均保留时间为30.421min，峰面积为：59.534；6号峰，平均保留时间为59.814min，峰面积为：266.571；7号峰，平均保留时间为25.769min，峰面积为：65.096；8号峰，平均保留时间为27.892min，峰面积为：62.182；9号峰，平均保留时间为39.431min，峰面积为：87.837；9个共有峰的保留时间rsd在0.58%～1.88%。以上9个共有峰的保留时间rsd符合指纹图谱的检测要求。本发明的另一目的在于提供前述得到的指纹图谱在珍珠层粉药材及珍珠层粉提取液和制剂检测中的应用。作为本发明的优选实施方式，对14份不同批次四味珍层冰硼滴眼液指纹图谱数据进行研究，建立了四味珍层冰硼滴眼液高效液相色谱指纹图谱的方法，包括以下步骤：（1）对照品溶液的制备：精密称取对照品适量，加水溶解并等倍稀释制成对照品储备液；（2）供试品溶液的制备：分别吸取各批次珍珠层粉水解液1.5ml，12,000r/min4℃离心15min，取上清备用，4℃冷藏；（3）高效液相色谱分析：色谱柱采用agilent，eclipsexdb-c18；采用梯度洗脱，a相为0.1%tfa-水，b相为70%乙腈水溶液-0.085%tfa水；流速为0.4ml/min；柱温为30℃；检测波长为220nm，进样量为20μl，按表1进行梯度洗脱：表1四味珍层冰硼滴眼液梯度洗脱程序表时间（min）a相b相098%2%2098%2%6090%10%6590%10%7098%2%8098%2%在此条件下进行hplc分析，得到四味珍层冰硼滴眼液指纹图谱。（4）标准指纹图谱的确定：按照本发明提供的方法，对不同批号的14批四味珍层冰硼滴眼液建立了hplc指纹图谱，通过分析比较，确定了9个共有特征峰，计算各共有特征峰的保留时间，其平均值为：12.280（峰1）、13.855（峰2）、17.842（峰3）、23.918（峰4）、30.421（峰5）、59.814（峰6）、25.769（峰7）、27.892（峰8）、39.431（峰9）。依上述色谱方法测定了14份不同批号的四味珍层冰硼滴眼液hplc指纹图谱，采用国家药典委员会颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统a版》软件导入14批次四味珍层冰硼滴眼液hplc指纹图谱数据，设定s8（批号150112）为参照图谱，选取“时间窗宽度”为0.20min，选定2个峰面积相对较大的峰进行多点校正，自动匹配，以中位数法生成对照图谱。并建立14批四味珍层冰硼滴眼液hplc指纹图谱色谱叠加图，见图1。（5）相似度评价：四味珍层冰硼滴眼液样品s1-s14与对照指纹图谱r的相似度均大于0.800，即四味珍层冰硼滴眼液各批次相似，质量稳定性较好，符合指纹图谱的要求。本发明的有益效果如下：（1）用本发明所提供的方法所建立的hplc指纹图谱，能有效地表征四味珍层冰硼滴眼液的质量，为该中药制剂生产和质量控制提供科学依据。（2）通过指纹图谱主要特征峰的相对稳定能够有效控制四味珍层冰硼滴眼液的质量，有效保证产品质量稳定、均一，从而确保本品的安全性和有效性。（3）本发明具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好等优点，可快速、准确地鉴别珍珠层粉药材及珍珠层粉提取液药材和制剂的真伪优劣。附图说明图1是14批四味珍层冰硼滴眼液hplc指纹图谱叠加图；图2是四味珍层冰硼滴眼液hplc指纹图谱共有模式。具体实施方式实施例1四味珍层冰硼滴眼液hplc指纹图谱的方法建立与验证1.仪器与材料1.1仪器：agilent1260高效液相色谱仪；fresco17型微量台式冷冻离心机（赛默飞世尔科技公司）；ab135-s型电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；xmt608型yc-800层析实验冷柜（北京亚星仪科科技发展有限公司）。1.2对照品与试剂l-酪氨酰甘氨酰甘氨酸对照品、l-酪氨酰甘氨酰甘氨酰对照品、l-酪氨酰甘氨酸对照品、l-色氨酸对照品均为自制，所有对照品纯度均大于98%。乙腈（美国天地公司，色谱纯），三氟乙酸（tfa）（阿拉丁，色谱纯），水为纯净水(杭州娃哈哈集团限公司)。1.3珍视明滴眼液共14批，分别记为s1-s14，为江西珍视明药业有限公司不同年份和月份生产的产品。色谱条件与系统适应性试验色谱柱为agilent，eclipsexdb-c18（3.0×150mm，3.5μm）。流动相为a相（0.1%tfa-水），b相（0.085%tfa+70%乙腈水溶液），采用梯度洗脱：0min2%b，20min2%b，60min10%b，65min10%b，70min2%b，80min2%b。流速：0.4ml/min，进样量：20μl，柱温：30°c，检测波长：220nm。对照品溶液的制备精密称取l-酪氨酰甘氨酰甘氨酸对照品10.26mg，置于50ml容量瓶中，分别加水溶解稀释，摇匀后，定容，其质量浓度分别为205.2μg/ml作为对照品储备液。供试品溶液的制备不同批次的珍视明滴眼液分别量取适量于12000r/min、4°c离心15min，取上清备用，4°c冷藏，作为供试品溶液。方法学验证3.1精密度试验取同一份珍视明滴眼液（s1）供试品溶液，连续进样6次，分别记录各色谱峰的保留时间和峰面积，计算各峰保留时间和峰面积的相对标准偏差rsd。各峰保留时间rsd在0.14~0.51%，峰面积rsd在0.64%~1.33%，均小于3%，表明仪器精密度良好。重复性试验取同一批号的珍视明滴眼液供试品溶液6份进样，分别记录各色谱峰的保留时间和峰面积，计算各峰保留时间和峰面积的rsd。各峰保留时间rsd在0.26%~0.79%，峰面积rsd在0.80~1.25%，表明本方法重复性良好，符合指纹图谱的检测要求。稳定性试验取同一份珍视明滴眼液供试品溶液，分别在0h、2h、4h、8h、12h、24h进样6次。分别记录各色谱峰的保留时间和峰面积，计算各峰的保留时间及峰面积的rsd。各峰保留时间rsd在0.23%~0.76%，峰面积rsd在1.37~2.59%，表明供试品溶液在24h内稳定。测定精密吸取供试品溶液与对照品溶液各20μl注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。实施例214批珍视明滴眼液指纹图谱的检测及数据分析1.1珍视明滴眼液指纹图谱测定取14批珍视明滴眼液，按实施例1条件进行测定，得14批样品的hplc图谱。在所建立的色谱条件下，珍视明滴眼液样品的特征峰有较好的分离，保留时间较为稳定，同时9个共有峰均能稳定出现。结果见表2和表3。1.2相似度评价采用国家药典委员会颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统a版》软件导入14批次珍视明滴眼液hplc指纹图谱数据，设定s8（批号150112）为参照图谱，选取“时间窗宽度”为0.20min，选定2个峰面积相对较大的峰进行多点校正，自动匹配，以中位数法生成对照图谱，如图2。14批样品与对照指纹图谱相似度在0.859～0.996之间，表明珍视明滴眼液质量稳定性较好，结果见表4。珍视明滴眼液样品s1-s14与对照指纹图谱r的相似度均大于0.800，即珍视明滴眼液各批次相似，质量稳定性较好，符合指纹图谱的要求。当前第1页12