一种氧氟沙星快速检测方法与流程

本发明涉及食品安全检测技术领域，尤其涉及一种氧氟沙星快速检测方法。

背景技术：

氧氟沙星(ofloxacin，oflx)又名氟嗪酸，属于第三代喹诺酮类广谱型抗菌药物，对于革兰氏阳性菌以及革兰氏阴性菌具有强大的抗菌作用。因其广谱、高效、价格低廉等特点，被广泛应用于兽药以及水产养殖中的抗菌药物。此外，该类药物还会被用作饲料添加剂以达到增加动物体重的效果。

大部分的兽药都具有致癌性、致突变性以及致畸性。目前大多数的氧氟沙星类兽药在动物体内的残留水平一般不会引起机体急性中毒，但一次性大量摄入残留量超标的动物性食品，则可能引起机体的急性中毒反应。敏感体质人群可能会对氧氟沙星兽药残留产生过敏反应，严重时则会危及生命。此类抗生素类兽药的长期大量使用，会极大增加病原菌的耐药性，对人类疾病的治疗效果产生不良影响，威胁人类健康。此外在当下环境、经济、贸易飞速发展的情况下，兽药残留对环境的可持续发展以及生态环境的平衡带来影响，对于我国的畜牧业及经济贸易发展极为不利。

以膜为固相载体的胶体金免疫层析技术是20世纪80年代在单克隆抗体技术和新材料技术基础上发展起来的一项新型检测技术。由于其具有快速、便捷、不需特殊设备、结果判断直观、可以现场进行检测的特点，近年来越来越受到人们的重视，其技术发展迅速，在检测领域得到了广泛应用。但是对于某些检测目标物含量极低的样本，胶体金试纸条的检测灵敏度受到很大限制。同时检测的生物样本中可能含有颜色物质会严重影响检测的结果和灵敏度。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，本发明提供了一种氧氟沙星快速检测方法，采用偶联抗氧氟沙星单克隆抗体的金磁微粒免疫检测待测样品中的氧氟沙星含量；所述免疫检测的层析试纸条底板上依次搭接设置有滤纸、样品垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述硝酸纤维素膜上设置有检测线和质控线，所述检测线上包被有氧氟沙星人工抗原，所述质控线上包被有二抗。

其中，所述纳米金磁颗粒与所述单克隆抗体结合的方式为静电吸附法或共价偶联法中的任意一种。

其中，所述纳米金磁微粒的内核为四氧化三铁、钴和镍形成的磁核，外壳为胶体金材料形成。

其中，所述金磁微粒的大小为10-500nm。

优选地，所述金磁微粒的大小为50nm，100nm，150nm，200nm，250nm，300nm，350nm，400nm，450nm。

其中，所述抗氧氟沙星单克隆抗体的浓度为1-1000μg/ml。

优选地，所述抗氧氟沙星单克隆抗体的浓度为100μg/ml，200μg/ml，300μg/ml，400μg/ml，500μg/ml，600μg/ml，700μg/ml，800μg/ml，900μg/ml。

其中，所述氧氟沙星人工抗原的喷膜浓度为0.1-10mg/ml,喷量为0.1-10μl/cm。

优选地，

所述氧氟沙星人工抗原的喷膜浓度为0.5mg/ml，1mg/ml，2mg/ml，3mg/ml，4mg/ml，5mg/ml，6mg/ml，7mg/ml，8mg/ml，9mg/ml；

所述氧氟沙星人工抗原的喷量为0.5μl/cm，1μl/cm，2μl/cm，3μl/cm，4μl/cm，5μl/cm，6μl/cm，7μl/cm，8μl/cm，9μl/cm。

其中，所述二抗包括羊抗鼠和驴抗鼠，所述二抗的喷膜浓度为0.1-10mg/ml，喷量为0.1-10μl/cm。

优选地，

所述二抗的喷膜浓度为0.5mg/ml，1mg/ml，2mg/ml，3mg/ml，4mg/ml，5mg/ml，6mg/ml，7mg/ml，8mg/ml，9mg/ml；

所述二抗的喷量为0.5μl/cm，1μl/cm，2μl/cm，3μl/cm，4μl/cm，5μl/cm，6μl/cm，7μl/cm，8μl/cm，9μl/cm。

其中，所述氧氟沙星快速检测的结果判定包括定性和定量两种方式，具体步骤为：将偶联单克隆抗体的纳米金磁微粒滴加到层析试纸条加样孔中，一段时间后用免疫层析分析仪读取，记录t线吸光度、c线吸光度和t/c值；

1)定性分析：用肉眼观察结果进行定性分析，t线不显色则说明样品中氧氟沙星的含量高于最低检测下限1pg/ml，t线显色则说明样品中没有氧氟沙星或氧氟沙星的含量低于最低检测下限1pg/ml。

2)定量分析：使用免疫层析分析仪测量t线、c线的吸光度，t线和c线的吸光度的比值记为t/c值，以不同氧氟沙星的浓度为横坐标，t/c值为纵坐标绘制标准曲线，参考所做的标准曲线图，确定普通样品中的氧氟沙星含量。

本发明提供的氧氟沙星快速检测方法，是利用纳米金磁微粒的磁学性质、特征颜色和易于偶联抗体的特性，将纳米金磁微粒标记抗氧氟沙星抗体，然后将此标记物加入到样品中，同时，将氧氟沙星全抗原包被在硝酸纤维膜上形成检测线，羊抗鼠二抗包被在硝酸纤维膜上作为质控线，再将处理过的样品垫、硝酸纤维膜、吸水纸和滤纸依次粘贴在支撑板上，利用竞争法检测样品中是否含有氧氟沙星和定量检测氧氟沙星。

当待测样品中含有一定浓度的氧氟沙星时，氧氟沙星先与金磁微粒标记抗体结合，将其滴加在试纸条加样孔中，由于层析作用反应形成抗原(氧氟沙星)—纳米金磁微粒抗体复合物不会与检测线上的氧氟沙星全抗原反应，所以检测线上没有探针富集或者少量富集，多余的纳米金磁微粒标记物继续移动到控制带位置，由于二抗与纳米金磁微粒标记的抗体发生免疫反应，又富集在控制带上，1～10分钟后，取出试纸条，用肉眼在检测带和质控带上观察结果，也可以通过免疫层析分析仪进行结果的定量判读。如果质控线处都没有颜色或者没有明显信号，说明试纸条有质量问题，测试无效。

本发明的有益效果：

本发明提供的氧氟沙星快速检测方法，具有以下优点：

1、本发明采用的纳米金磁微粒，兼有磁性纳米粒子的超顺磁性以及胶体金表面高效偶联抗体的性能；由于纳米金磁微粒可以借助其表面的静电作用、疏水作用及au-sh作用等非共价键作用，物理性的吸附抗体等蛋白物质，偶联率高，偶联效果稳定、而且在偶联过程中能够保证抗体的活性不受影响。

2、本发明将免疫磁分离和免疫层析有机整合，免去了将氧氟沙星从免疫磁珠中洗脱下来的步骤，提高了捕获效率；免去了将胶体金喷在结合垫上的步骤，免疫学反应更加均一，定量检测时变异系数小；减少了工作量和基质干扰。

3、能同时对目标物氧氟沙星进行定性定量检测。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对实施方式中需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施方式，对应本领域的普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的氧氟沙星快速检测方法中纳米金磁微粒偶联单克隆抗体的结构图；

图2是本发明实施例提供的氧氟沙星快速检测方法中纳米金磁微粒免疫磁分离、检测步骤和结果示意图。

具体实施方式

以下是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

本发明提供了一种氧氟沙星快速检测方法，采用偶联抗氧氟沙星单克隆抗体的金磁微粒免疫检测待测样品中的氧氟沙星含量；所述免疫检测的层析试纸条底板上依次搭接设置有滤纸、样品垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述硝酸纤维素膜上设置有检测线和质控线，所述检测线上包被有氧氟沙星人工抗原，所述质控线上包被有二抗。所述纳米金磁颗粒与所述单克隆抗体结合的方式为静电吸附法或共价偶联法中的任意一种，所述纳米金磁微粒的内核为四氧化三铁、钴和镍形成的磁核，外壳为胶体金材料形成；所述金磁微粒的大小为10-500nm；所述抗氧氟沙星单克隆抗体的浓度为1-1000μg/ml；所述氧氟沙星人工抗原的喷膜浓度为0.1-10mg/ml,喷量为0.1-10μl/cm；所述二抗包括羊抗鼠和驴抗鼠，所述二抗的喷膜浓度为0.1-10mg/ml，喷量为0.1-10μl/cm。

所述氧氟沙星快速检测的结果判定包括定性和定量两种方式，具体步骤为：将偶联单克隆抗体的纳米金磁微粒滴加到层析试纸条加样孔中，一段时间后用免疫层析分析仪读取，记录t线吸光度、c线吸光度和t/c值；

1)定性分析：用肉眼观察结果进行定性分析，t线不显色则说明样品中氧氟沙星的含量高于最低检测下限1pg/ml，t线显色则说明样品中没有氧氟沙星或氧氟沙星的含量低于最低检测下限1pg/ml。

2)定量分析：使用免疫层析分析仪测量t线、c线的吸光度，t线和c线的吸光度的比值记为t/c值，以不同氧氟沙星的浓度为横坐标，t/c值为纵坐标绘制标准曲线，参考所做的标准曲线图，确定普通样品中的氧氟沙星含量。

本发明提供了一种氧氟沙星快速检测方法，首先配置偶联缓冲液、清洗缓冲液和封闭剂。

偶联缓冲液配制方法为：将3ml浓度为19.07g/ml的硼砂与7ml浓度为12.37g/ml的硼酸混合后，稀释10倍；

清洗缓冲液配制方法为：称取0.43g2-(n-吗啉代)乙磺酸缓冲溶液溶于200ml的无菌蒸馏水中，调节ph为5.5～6.0；

封闭剂配制方法为：取50mg脱脂奶粉加入1mlph为7.4的磷酸盐缓冲溶液溶液配成封闭剂。

实施例1

采用本发明提供的氧氟沙星快速检测方法对牛奶中氧氟沙星进行检测，包括如下步骤：

1.制备偶联单克隆抗体的纳米金磁微粒：

1.1纳米金磁微粒的处理：取300μl上述方法制备得到的偶联缓冲液置于2ml的离心管中，取0.5mg的50nm纳米金磁微粒与之混合，磁分离3min后，弃上清；

1.2偶联反应：取抗氧氟沙星单克隆抗体250μg，与步骤1.1制备得到的0.75mg纳米金磁微粒混合，置于1ml偶联缓冲液中，在温度37℃时，放在转速为15rpm的旋转仪上，偶联45min，磁分离5min弃上清，再用上述方法制备得到的1ml清洗缓冲液清洗3遍；

1.3封闭：清洗后，用上述方法制备得到的封闭剂1ml与磁珠混合封闭1h。

2.使用偶联单克隆抗体的纳米金磁微粒捕获牛奶中的氧氟沙星

取25ml灭菌后的牛奶加入到225mlph为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，加入一定浓度的氧氟沙星标准品，氧氟沙星标准品浓度调整为100pg/ml、50pg/ml、25pg/ml、12.5pg/ml、6.25pg/ml；

取1ml各个浓度的标准品、取1ml待测牛奶样品，加封闭后的免疫纳米金磁微粒100μg，混合孵育30min，温度37℃，转速15rpm，孵育后磁分离5min后，弃上清，用ph为7.4的磷酸盐缓冲溶液清洗后，复溶于ph为7.4的磷酸盐缓冲溶液中。

3.制作氧氟沙星免疫层析试纸条

将氧氟沙星兔多抗和兔抗鼠二抗喷到硝酸纤维膜上分别作为检测线和质控线，氧氟沙星浓度为1.5mg/ml，羊抗鼠二抗浓度为0.5mg/ml，喷量均为0.5μl/cm，37℃真空干燥过夜，将样本垫、硝酸纤维膜、吸水纸依次粘贴在pvc底板上，贴好后将其切成4mm宽的条子，装卡；将制备好的试纸条置于锡箔袋中加干燥剂密封，置于干燥缸保存备用。

4.利用竞争法法对样品进行目测和使用仪器测定结果

将捕获到氧氟沙星的金磁微粒稀释到浓度100μg/ml，取100μl滴加到试纸条加样孔中，10min后用免疫层析分析仪读取，记录t线吸光度、c线吸光度和t/c的值，以氧氟沙星标准溶液的浓度为横坐标，分别以t线吸光度、t/c值为纵坐标绘制标准曲线。用肉眼观察结果进行定性分析，t线不显色则说明牛奶样品中氧氟沙星的含量高于1pg/ml，t线显色则说明牛奶样品中没有氧氟沙星或是含有氧氟沙星的量低于1pg/ml。最后参考所做的标准曲线图，确定牛奶样品中氧氟沙星的浓度。

实施例2

采用本发明提供的氧氟沙星快速检测方法对牛肉中氧氟沙星进行检测，包括如下步骤：

1.制备偶联单克隆抗体的纳米金磁微粒：

1.1纳米金磁微粒的处理：取250μl上述方法制备得到的偶联缓冲液置于2ml离心管中，取0.75mg的50nm纳米金磁微粒与之混合，磁分离4min后，弃上清；

1.2偶联反应：取制备好的抗氧氟沙星单克隆抗体200μg，与步骤1.1制备得到的1.0mg纳米金磁微粒混合，置于1ml偶联缓冲液中。在温度37℃时，放在转速为10rpm的旋转仪上，偶联时间50min，磁分离5min弃上清，再用上述方法制备得到的1ml清洗缓冲液清洗3遍。

1.3封闭：清洗后，用上述方法制备得到的封闭剂1ml与磁珠混合封闭1h。

2.使用偶联单克隆抗体的纳米金磁微粒捕获牛肉中的氧氟沙星

取25g灭菌后的牛肉加入到225mlph为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，加入一定浓度的氧氟沙星标准品，氧氟沙星标准品浓度调整为100pg/ml、50pg/ml、25pg/ml、12.5pg/ml、6.25pg/ml；

取1ml各个浓度的标准品、取1g待测牛肉样品，加封闭后的免疫纳米金磁微粒150μg，混合孵育60min，温度37℃，转速15rpm，孵育后磁分离3min后，弃上清，用ph为7.4的磷酸盐缓冲溶液清洗后，复溶于ph为7.4的磷酸盐缓冲溶液中。

3.制作氧氟沙星免疫层析试纸条

将氧氟沙星兔多抗和兔抗鼠二抗喷到硝酸纤维膜上分别作为检测线和质控线，氧氟沙星浓度为1.0mg/ml，羊抗鼠二抗浓度为0.4mg/ml，喷量均为1.0μl/cm，37℃真空干燥过夜，将样本垫、硝酸纤维膜、吸水纸依次粘贴在聚氯乙烯底板上，贴好后将其切成4mm宽的条子，装卡。将制备好的试纸条置于锡箔袋中加干燥剂密封，置于干燥缸保存备用。

4.利用竞争法法对样品进行目测和使用仪器测定结果

将捕获到氧氟沙星的金磁微粒稀释到浓度50μg/ml，取100μl滴加到试纸条加样孔中，10min后用免疫层析分析仪读取，记录t线吸光度、c线吸光度和t/c的值，以不同氧氟沙星的浓度为横坐标，分别以t线吸光度、t/c值为纵坐标绘制标准曲线。用肉眼观察结果进行定性分析，t线不显色则说明牛肉样品中氧氟沙星的含量高于1pg/ml，t线显色则说明牛肉样品中没有氧氟沙星或是含有氧氟沙星的量低于1pg/ml。最后参考所做的标准曲线图，确定牛肉样品中氧氟沙星的浓度。

本发明提供的氧氟沙星快速检测方法，定量检测氧氟沙星的浓度范围在6.25～100pg/ml之间。

图1是本发明实施例提供的氧氟沙星快速检测方法中纳米金磁微粒偶联单克隆抗体的结构图，图2是本发明实施例提供的氧氟沙星快速检测方法中纳米金磁微粒免疫磁分离、检测步骤和结果示意图。

以上实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都是属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。