一种抗抑郁药物的指纹图谱检测方法与流程

本发明涉及中药分析领域，更具体的说是涉及一种抗抑郁药物的指纹图谱检测方法。

背景技术：

中药指纹图谱是指某些中药材或中成药经适当处理后，利用现代信息采集技术和质量分析手段得到的能够显现中药材或中成药化学特征的图像、图形、光谱谱图及其数据的一种图谱。中药指纹图谱作为质量控制的一种方式，逐渐被人们所重视，而色谱指纹图谱的最基本的属性是完整性和模糊性，它是一种综合的，可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性。指纹图谱应该具备指纹性，即：(1)特征性和专属性，指所指定的纹图谱是该中药所独有的，与其它中药相区别，如种属、产地、或采收季节的差异等，而且图谱所呈现出来的化学信息具有高度的选择性；(2)稳定性、重现性，中药的指纹图谱应该是从某中药的多批次中归纳出的共性，在规定的方法和条件下，图谱中的共有峰或特征峰应相对稳定；(3)有效性、完整性，所指定的指纹图谱在规定条件下应能再现指纹特征(如共有峰数目、大小、位置等)，其误差应在允许的范围内。

抑郁情绪是常见的心境障碍性病症，以心境低落为主症，并有相应思维和行为改变的一种情感障碍疾病，临床表现为心境低落、思维迟缓、食欲降低、睡眠障碍等等，严重危害人们的身心健康。如今生活节奏加快，就业竞争加剧，出现抑郁情绪的人数逐年增加，严重的抑郁情绪会发展为抑郁症，甚至出现自杀等情绪。

指纹图谱方法对于药物检测具有一定的局限性例如：中药材本身的质量差别较大，不同批次、产地等对指纹图谱的检测也有较大的影响；指纹图谱的检测受环境以及仪器的影响较大，制定的标准不能满足各个时间段或是不同实验室的要求；另外药材提取分离到分析检测的规范化程度不够，也限制了指纹图谱的检测。

因此，结合上述问题，提供一种抗抑郁药物的指纹图谱检测方法，是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了一种抗抑郁药物的指纹图谱检测方法，该方法利用高效液相色谱法，对于贯叶连翘、白芍、栀子、合欢花、牡丹皮的中药理活性成分进行了有效表征，能有效实现对被检测中药组合物的质量控制，该指纹图谱检测方法具有重复性、稳定性好的优点。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种抗抑郁药物的指纹图谱检测方法，采用液相色谱法，色谱条件为：

色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料；

流动相a为乙腈，流动相b为磷酸水溶液，梯度洗脱；

检测波长为230-300nm；

流速为1ml/min；

进样量为10μl；

理论塔板数以标准品金丝桃苷峰计，≥3000；

标准品溶液制备：取金丝桃苷，精密称定，加50％甲醇水溶液制成每1ml含1mg的溶液；

梯度洗脱条件为：

优选的，所述的抗抑郁药物由如下重量份的原料组成：贯叶连翘3份、白芍12份、栀子6份、牡丹皮10份、合欢花10份。

优选的，所述的抗抑郁药物制备的具体步骤如下：

s1，按比例称取贯叶连翘、白芍、栀子、合欢花、牡丹皮，备料；

s2，贯叶连翘加10倍量60％乙醇，加热回流提取2次，每次1.5小时，合并提取液，浓缩，减压干燥；白芍加10倍量70％乙醇，加热回流提取2次，每次1.5小时，合并提取液，浓缩，减压干燥；栀子加10倍量80％乙醇，加热回流提取2次，每次1.5小时，合并提取液，浓缩，减压干燥；合欢花加10倍量纯水，加热回流提取2次，每次1.5小时，合并提取液，浓缩，减压干燥；牡丹皮加10倍量纯水，经水蒸气蒸馏法得提取物。

s3，将上述所得提取物a-e按重量比15:14:7:5:0.6研磨混合均匀，过80目药典筛，得到抗抑郁的复合制剂。

优选的，所述抗抑郁药物的指纹图谱为：

指纹图谱包括15个共有峰：各峰的相对保留时间分别为：

(1)9.153、(2)11.695、(3)15.111、(4)16.559、(5)19.563、(6)20.383、(7)32.511、(8)44.247、(9s)44.856、(10)45.764、(11)49.397、(12)51.643、(13)53.324、(14)88.658、(15)96.463。

优选的，所述指纹图谱的共有峰为：

1号峰，保留时间为9.153，rsd为0.08％，峰面积为1336.402，占总峰面积百分比为4.432％；

2号峰，保留时间为11.695，rsd为0.04％，峰面积521.328，占总峰面积百分比为1.729％；

3号峰，保留时间为15.111，rsd为0.04％，峰面积305.260，占总峰面积百分比为1.012％；

4号峰，保留时间为16.559，rsd为0.04％，方，峰面积437.930，占总峰面积百分比为1.452％；

5号峰，保留时间为19.563，rsd为0.06％，峰面积406.334，占总峰面积百分比为1.348％；

6号峰，保留时间为20.383，rsd为0.04％，峰面积1151.954，占总峰面积百分比为3.820％；

7号峰，保留时间为32.511，rsd为0.04％，峰面积820.504，占总峰面积百分比为2.721％；

8号峰，保留时间为44.247，rsd为0.09％，峰面积1617.883，占总峰面积百分比为5.365％；

9s号峰，保留时间为44.856，rsd为0.07％，峰面积1299.504，占总峰面积百分比为4.309％；

10号峰，保留时间为45.764，rsd为0.09％，峰面积1336.627，占总峰面积百分比为4.433％；

11号峰，保留时间为49.397，rsd为0.09％，峰面积2051.489，占总峰面积百分比为6.803％；

12号峰，保留时间为51.643，rsd为0.05％，峰面积563.488，占总峰面积百分比为1.869％；

13号峰，保留时间为53.324，rsd为0.03％，峰面积895.859，占总峰面积百分比为2.971％；

14号峰，保留时间为88.658，rsd为0.02％，峰面积646.792，占总峰面积百分比为2.145％；

15号峰，保留时间为96.463，rsd为0.04％，峰面积9089.165，占总峰面积百分比为30.142％；

优选的，所述方法中所述流动相a的ph为2.0-7.0。

优选的，所述方法中所述流动相a的ph为2.5。

优选的，所述方法中用于液相色谱法测定的对照品溶液，其制备方法为：取金丝桃苷置入容量瓶中，加入甲醇水溶液，超声溶解，定容，过滤，得到滤液为对照品溶液。

优选的，所述方法中用于液相色谱法测定的供试品溶液，其制备方法为：取所述抗抑郁药物干粉置入容量瓶中，加入甲醇水溶液，超声溶解，定容，过滤，得到滤液为供试品溶液。

优选的，所述的甲醇水溶液为40％-60％的甲醇溶液。

经由上述技术方案可知，与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

1、本发明建立了利用高效液相色谱法的一种中药组合物的指纹图谱检测方法及其指纹图谱，对于其贯叶连翘、白芍、栀子、合欢花、牡丹皮中药理活性成分进行了有效表征，提供了一种有效地检测方法，实现某些中药组合物的质量控制；

2、本发明提供的指纹图谱检测方法其重复性和稳定性较好。

3、通过指纹图谱检测方法可有效监控不同批次，不同产地的药材，为药材进厂检验提供参考依据

4、本发明中的中药组方通过动物药效实验，有助于缓解抑郁情绪，具有抗抑郁的作用，本发明在以药效为导向的基础上，开展抗抑郁中药组合物的质量控制方法，不仅为明确地阐述其指纹特征与药效的关系提供依据，能有效地控制中药组合物的活性成分的质量，为中药组合物的扩大生产和临床合理用药提供理论依据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1贯叶连翘提取物的指纹图谱；

图2为本发明实施例2白芍提取物的指纹图谱；

图3为本发明实施例3栀子提取物的指纹图谱；

图4为本发明实施例4牡丹皮提取物的指纹图谱；

图5为本发明实施例5合欢花提取物的指纹图谱。

图6为本发明实施例6中药组合物的指纹图谱；

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

本发明实施例1公开了贯叶连翘指纹图谱测定，采用的技术方案如下：

1、制备方法

贯叶连翘加10倍量60％乙醇，加热回流提取2次，每次1.5小时，合并提取液，浓缩，减压干燥；称量0.71g，至于25ml容量瓶中，加入50％甲醇水溶液，超声20min溶解，加入50％的甲醇水定容至刻度，滤过，即得贯叶连翘提取物样品溶液。

2、主要仪器

色谱系统：agilenttechnologies1260infinityii(g7111b1260quatpump,g7129a1260vialsampler,g7116a1260mct,g7117b1290dad)；

超声波清洗仪：kq-600de，昆山市超声仪器有限公司；

旋转蒸发仪：re-52a,上海亚荣生化仪器厂；

循环水式真空泵：shz-d(iii)，巩义市予华仪器有限公司。

3、试剂

甲醇：20180606，纯度≥99.9％，国药集团化学试剂；

乙腈：20180731，纯度≥99.9％，国药集团化学试剂；

磷酸：纯度≥85％，天津市科密欧化学试剂有限公司；

纯净水：20180927，屈臣氏。

4、色谱条件

色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，采用梯度洗脱，流动相a为乙腈，流动相b为磷酸水，检测波长为300nm，流速为1ml/min，柱温30℃，进样体积为10ul；梯度洗脱程序为：

5、测定

吸取上述贯叶连翘提取物样品溶液注入液相色谱仪，按照高效液相色谱法测定，得到贯叶连翘提取物指纹图谱，其中指纹峰有：

1号峰，保留时间rt为14.972，rsd为0.8％，峰面积为755.783，占峰面积比为2.603％；

2号峰，保留时间rt为16.424，rsd为0.4％，峰面积为1195.265，占峰面积比为4.116％；

3号峰，保留时间rt为19.465，rsd为0.3％，峰面积为1032.728，占峰面积比为3.556％；

4号峰，保留时间rt为20.287，rsd为0.4％，峰面积为2684.446，占峰面积比为9.244％；

5号峰，保留时间rt为21.278，rsd为0.5％，峰面积为968.582，占峰面积比为3.335％；

6号峰，保留时间rt为26.564，rsd为0.2％，峰面积为523.280，占峰面积比为1.802％；

7号峰，保留时间rt为44.227，rsd为0.3％，峰面积为4200.473，占峰面积比为14.464％；

8号峰，保留时间rt为44.847，rsd为0.3％，峰面积为3439.290，占峰面积比为11.843％；

9号峰，保留时间rt为45.769，rsd为0.5％，峰面积为3686.598，占峰面积比为12.695％；

10号峰，保留时间rt为51.697，rsd为0.4％，峰面积为1622.576，占峰面积比为5.587％；

11号峰，保留时间rt为53.377，rsd为0.3％，峰面积为737.842，占峰面积比为2.541％；

实施例2：

本发明实施例2公开了白芍提取物指纹图谱测定，采用的技术方案如下：

1、制备方法

白芍加10倍量70％乙醇，加热回流提取2次，每次1.5小时，合并提取液，浓缩，减压干燥，称量0.71g，至于25ml容量瓶中，加入50％甲醇水溶液，超声20min溶解，加入50％的甲醇水定容至刻度，滤过，即得白芍提取物样品溶液。

2、主要仪器

色谱系统：agilenttechnologies1260infinityii(g7111b1260quatpump,g7129a1260vialsampler,g7116a1260mct,g7117b1290dad)；

超声波清洗仪：kq-600de，昆山市超声仪器有限公司；

旋转蒸发仪：re-52a,上海亚荣生化仪器厂

循环水式真空泵：shz-d(iii)，巩义市予华仪器有限公司

3、试剂

甲醇：20180606，纯度≥99.9％，国药集团化学试剂；

乙腈：20180731，纯度≥99.9％，国药集团化学试剂；

磷酸：纯度≥85％，天津市科密欧化学试剂有限公司；

纯净水：20180927，屈臣氏。

4、色谱条件

色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，采用梯度洗脱，流动相a为乙腈，流动相b为磷酸水，检测波长为230nm，流速为1ml/min，柱温30℃，进样体积为10ul；梯度洗脱程序为：

5、测定

吸取上述白芍提取物样品溶液注入液相色谱仪，按照高效液相色谱法测定，得到白芍提取物指纹图谱，其中指纹峰有：

1号峰，保留时间rt为9.374，rsd为0.5％，峰面积为9410.198，占峰面积比为5.785％；

2号峰，保留时间rt为11.937，rsd为0.9％，峰面积为2016.463，占峰面积比为1.240％；

3号峰，保留时间rt为27.011，rsd为0.5％，峰面积为22562.261，占峰面积比为13.871％；

4号峰，保留时间rt为30.912，rsd为0.6％，峰面积为68138.645，占峰面积比为41.892％；

5号峰，保留时间rt为44.947，rsd为0.7％，峰面积为18202.291，占峰面积比为11.191％；

6号峰，保留时间rt为50.365，rsd为0.6％，峰面积为4852.267，占峰面积比为2.983％；

7号峰，保留时间rt为56.724，rsd为0.5％，峰面积为2196.713，占峰面积比为1.351％；

8号峰，保留时间rt为99.365，rsd为0.2％，峰面积为1948.910，占峰面积比为1.198％。

实施例3：

本发明实施例3公开了栀子提取物指纹图谱测定，采用的技术方案如下：

1、制备方法

栀子加10倍量80％乙醇，加热回流提取2次，每次1.5小时，合并提取液，浓缩，减压干燥；称量0.71g，至于25ml容量瓶中，加入50％甲醇水溶液，超声20min溶解，加入50％的甲醇水定容至刻度，滤过，即得栀子提取物样品溶液。

2、主要仪器

色谱系统：agilenttechnologies1260infinityii(g7111b1260quatpump,g7129a1260vialsampler,g7116a1260mct,g7117b1290dad)；

超声波清洗仪：kq-600de，昆山市超声仪器有限公司；

旋转蒸发仪：re-52a,上海亚荣生化仪器厂

循环水式真空泵：shz-d(iii)，巩义市予华仪器有限公司。

3、试剂

甲醇：20180606，纯度≥99.9％，国药集团化学试剂；

乙腈：20180731，纯度≥99.9％，国药集团化学试剂；

磷酸：纯度≥85％，天津市科密欧化学试剂有限公司；

纯净水：20180927，屈臣氏。

4、色谱条件

色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，采用梯度洗脱，流动相a为乙腈，流动相b为磷酸水，检测波长为300nm，流速为1ml/min，柱温30℃，进样体积为10ul；梯度洗脱程序为：

5、测定

吸取上述栀子提取物样品溶液注入液相色谱仪，按照高效液相色谱法测定，得到栀子提取物指纹图谱，其中指纹峰有：

1号峰，保留时间rt为14.912，rsd为0.4％，峰面积为1933.598，占峰面积比为4.781％；

2号峰，保留时间rt为15.761，rsd为0.4％，峰面积为819.484，占峰面积比为2.026％；

3号峰，保留时间rt为16.615，rsd为0.2％，峰面积为608.844，占峰面积比为1.505％；

4号峰，保留时间rt为18.178，rsd为0.5％，峰面积为907.286，占峰面积比为2.243％；

5号峰，保留时间rt为19.971，rsd为0.8％，峰面积为2888.059，占峰面积比为7.141％；

6号峰，保留时间rt为32.594，rsd为0.8％，峰面积为27584.143，占峰面积比为68.205％；

实施例4：

本发明实施例4公开了牡丹皮提取物指纹图谱测定，采用的技术方案如下：

1、制备方法

牡丹皮加10倍量纯水，经水蒸气蒸馏法得提取物。

2、主要仪器

色谱系统：agilenttechnologies1260infinityii(g7111b1260quatpump,g7129a1260vialsampler,g7116a1260mct,g7117b1290dad)；

超声波清洗仪：kq-600de，昆山市超声仪器有限公司；

旋转蒸发仪：re-52a,上海亚荣生化仪器厂

循环水式真空泵：shz-d(iii)，巩义市予华仪器有限公司。

3、试剂

甲醇：20180606，纯度≥99.9％，国药集团化学试剂；

乙腈：20180731，纯度≥99.9％，国药集团化学试剂；

磷酸：纯度≥85％，天津市科密欧化学试剂有限公司；

纯净水：20180927，屈臣氏。

4、色谱条件

色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，采用梯度洗脱，流动相a为乙腈，流动相b为磷酸水，检测波长为274nm，流速为1ml/min，柱温30℃，进样体积为10ul；梯度洗脱程序为：

5、测定

吸取上述牡丹皮提取物样品溶液注入液相色谱仪，按照高效液相色谱法测定，得到牡丹皮提取物指纹图谱，其中指纹峰有：

1号峰，保留时间rt为97.110，rsd为0.09％，峰面积为3076.943，占峰面积比为99.650％

实施例5：

本发明实施例5公开了合欢花指纹图谱测定，采用的技术方案如下：

1、制备方法

合欢花加10倍量纯水，加热回流提取2次，每次1.5小时，合并提取液，浓缩，减压干燥；称量0.71g，至于25ml容量瓶中，加入50％甲醇水溶液，超声20min溶解，加入50％的甲醇水定容至刻度，滤过，即得合欢花提取物样品溶液。

2、主要仪器

色谱系统：agilenttechnologies1260infinityii(g7111b1260quatpump,g7129a1260vialsampler,g7116a1260mct,g7117b1290dad)；

超声波清洗仪：kq-600de，昆山市超声仪器有限公司；

旋转蒸发仪：re-52a,上海亚荣生化仪器厂

循环水式真空泵：shz-d(iii)，巩义市予华仪器有限公司。

3、试剂

甲醇：20180606，纯度≥99.9％，国药集团化学试剂；

乙腈：20180731，纯度≥99.9％，国药集团化学试剂；

磷酸：纯度≥85％，天津市科密欧化学试剂有限公司；

纯净水：20180927，屈臣氏。

4、色谱条件

色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，采用梯度洗脱，流动相a为乙腈，流动相b为磷酸水，检测波长为256nm，流速为1ml/min，柱温30℃，进样体积为10ul；梯度洗脱程序为：

5、测定

吸取上述合欢花提取物样品溶液注入液相色谱仪，按照高效液相色谱法测定，得到合欢花提取物指纹图谱，其中指纹峰有：

1号峰，保留时间rt为3.133，rsd为0.5％，峰面积为3036.946，占峰面积比为10.294％；

2号峰，保留时间rt为3.956，rsd为0.3％，峰面积为5068.172，占峰面积比为17.179％；

3号峰，保留时间rt为7.329，rsd为0.2％，峰面积为536.413，占峰面积比为1.818％；

4号峰，保留时间rt为15.243，rsd为0.2％，峰面积为2024.062，占峰面积比为6.861％；

5号峰，保留时间rt为20.146，rsd为0.5％，峰面积为396.857，占峰面积比为1.345％；

6号峰，保留时间rt为45.385，rsd为0.6％，峰面积为434.784，占峰面积比为1.474％；

7号峰，保留时间rt为54.011，rsd为0.8％，峰面积为7220.747，占峰面积比为24.475％；

实施例6：

本发明实施例6公开了抗抑郁药物中药组合物的指纹图谱检测测定，采用的技术方案如下：

原料：贯叶连翘3g、白芍12g、栀子6g、合欢花10g、牡丹皮10g。

1、制备方法

贯叶连翘加10倍量60％乙醇，加热回流提取2次，每次1.5小时，合并提取液，浓缩，减压干燥；白芍加10倍量70％乙醇，加热回流提取2次，每次1.5小时，合并提取液，浓缩，减压干燥；栀子加10倍量80％乙醇，加热回流提取2次，每次1.5小时，合并提取液，浓缩，减压干燥；合欢花加10倍量纯水，加热回流提取2次，每次1.5小时，合并提取液，浓缩，减压干燥；牡丹皮加10倍量纯水，经水蒸气蒸馏法得提取物。

2、主要仪器

色谱系统：agilenttechnologies1260infinityii(g7111b1260quatpump,g7129a1260vialsampler,g7116a1260mct,g7117b1290dad)；

超声波清洗仪：kq-600de，昆山市超声仪器有限公司；

旋转蒸发仪：re-52a,上海亚荣生化仪器厂

循环水式真空泵：shz-d(iii)，巩义市予华仪器有限公司。

3、试剂

甲醇：20180606，纯度≥99.9％，国药集团化学试剂；

乙腈：20180731，纯度≥99.9％，国药集团化学试剂；

磷酸：纯度≥85％，天津市科密欧化学试剂有限公司；

纯净水：20180927，屈臣氏。

4、色谱条件

色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，采用梯度洗脱，流动相a为乙腈，流动相b为磷酸水，检测波长为230nm、238nm、256nm、274nm、300nm，流速为1ml/min，柱温30℃，进样体积为10ul；梯度洗脱程序为：

5、测定

吸取上述中药组合物样品溶液注入液相色谱仪，按照高效液相色谱法测定，得到中药组合物指纹图谱，其中指纹峰有：

1号峰，保留时间为9.153，rsd为0.08％，峰面积为1336.402，占总峰面积百分比为4.432％；

2号峰，保留时间为11.695，rsd为0.04％，峰面积521.328，占总峰面积百分比为1.729％；

3号峰，保留时间为15.111，rsd为0.04％，峰面积305.260，占总峰面积百分比为1.012％；

4号峰，保留时间为16.559，rsd为0.04％，方，峰面积437.930，占总峰面积百分比为1.452％；

5号峰，保留时间为19.563，rsd为0.06％，峰面积406.334，占总峰面积百分比为1.348％；

6号峰，保留时间为20.383，rsd为0.04％，峰面积1151.954，占总峰面积百分比为3.820％；

7号峰，保留时间为32.511，rsd为0.04％，峰面积820.504，占总峰面积百分比为2.721％；

8号峰，保留时间为44.247，rsd为0.09％，峰面积1617.883，占总峰面积百分比为5.365％；

9号峰，保留时间为44.856，rsd为0.07％，峰面积1299.504，占总峰面积百分比为4.309％；

10号峰，保留时间为45.764，rsd为0.09％，峰面积1336.627，占总峰面积百分比为4.433％；

11号峰，保留时间为49.397，rsd为0.09％，峰面积2051.489，占总峰面积百分比为6.803％；

12号峰，保留时间为51.643，rsd为0.05％，峰面积563.488，占总峰面积百分比为1.869％；

13号峰，保留时间为53.324，rsd为0.03％，峰面积895.859，占总峰面积百分比为2.971％；

14号峰，保留时间为88.658，rsd为0.02％，峰面积646.792，占总峰面积百分比为2.145％；

15号峰，保留时间为96.463，rsd为0.04％，峰面积9089.165，占总峰面积百分比为30.142％；

实施例7：

本发明实施例7为方法学验证，采用的技术方案如下：

1、对照品溶液的制备

取适量金丝桃苷,加50％甲醇,配制成浓度1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.125mg/ml、0.0625mg/ml、0.03125mg/ml的对照品溶液。

2、标准曲线制备及线性范围确定

取适量金丝桃苷标准品溶液经0.45μm微孔滤膜过滤，按设定的色谱条件，分别进样10μl，以色谱峰面积为纵坐标，以浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到金丝桃苷的线性回归方程及线性范围。

金丝桃苷回归方程为y＝19800.1399x-148.0636，r²＝0.99975；金丝桃苷在线性范围内与峰面积线性关系良好。

3、精密度实验

精密吸取上述金丝桃苷标准品溶液,用hplc进行测定，连续进样5次，每次10μl，测定其峰面积rsd值，检测其高效液相色谱仪的精密度。

金丝桃苷保留时间rsd是0.06％；峰面积rsd是1.07％

4、稳定性实验

取中药组合物样品，分别在3h、6h、9h、12h、15h按上述色谱条件,用hplc进行测定,进样量10μl。对其峰面积进行积分，计算积分值的相对标准偏差，检测其稳定性。

金丝桃苷保留时间rsd是0.04％；峰面积rsd是5.05％。

5、重现性实验

取同一批样品,按供试品溶液制备方法,制备份供试品溶液,按上述色谱条件,用hplc进行测定,进样量10μl。对其面积进行积分,计算相对标准偏差，检测其重现性。

金丝桃苷保留时间rsd是0.09％；峰面积rsd是3.05％

6、加样回收率实验

称取已知含量中药组合物样品，共5份,分别加入一定量的金丝桃苷对照品,按供试液制备方法制备样品5份,每份样品连续进样次每次进样10μl，用标准曲线法测定含量，计算对照品的平均加样回收率。

金丝桃苷含量rsd是0.12％；峰面积rsd是2.19％。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。