一种基于荧光耦合出射的光镊纵向定位反馈装置及方法与流程

本发明涉及成像及光镊操作技术领域，特别涉及一种基于荧光耦合出射的光镊纵向定位反馈装置及方法。

背景技术：

光镊一般是利用紧聚焦激光中的光压形成散射力和梯度力，并对微小粒子和细胞进行捕获和操纵的一种技术。其非接触、无损伤等特性在生物医学、显微成像中都有着巨大应用潜力，极大地促进了多学科、跨学科的发展。作为一种远场方法，通过先进的加工手段和精密的机械控制，其能够在纳米精度对光束进行设计、操纵以及微调，但被捕获的纳米颗粒的定位依旧具有不准确性，其只能提供一个有效的控制手段却难以反映出光束作用于颗粒后纳米粒子的具体位置。而且由于样品的复杂多样性，所设计的光束在经过各类散射之后也会产生一定的误差。也正因为如此，被用在光物理、生物医学中的光镊技术往往不能及时地得到捕获效果的反馈，使得微操纵技术在现实使用中一直难以获得更广泛的应用。解决此类问题的常规手段往往需要花更多时间和使用复杂的设备去提高成像分辨率，利用超分辨成像技术来进一步对样品进行定位。但如何高效的将样品快速定位并动态调节光束一直是待解决的问题。

针对光镊中光束的动态调控，一般的实现方法大多都是利用高灵敏度的定位平台并匹配现有的商用显微镜。其基于光镊的原理，将聚焦激光束对粒子施加的力分为两部分，沿光束传播方向的轴向光力一般控制纳米颗粒于基底附近；而垂直光束轴线方向的径向光力一般具有高斯分布的强度且是吸引力，它将微小粒子引向光轴，并将其约束在光轴中心附近。即光学力的径向分量可以有效地将微小颗粒限制在一个二维区域中，因此通过调节激光束的强度可以很好的控制微小颗粒在二维区域的位置。即使其半峰全宽无法突破衍射极限，但其调制深度与光束总功率成正比，所以通过调整光束功率可以提高所需的横向定位精度，理论上可以降低到几纳米。但是其只能在面内控制调节，无法实现纵向的高分辨信息反馈。同时所需平台设施价格昂贵，不易扩展，限制了实验室阶段的样品测试。而如今利用计算机图像分析识别技术对模糊样品进行追迹复原。其也只能根据现有成像来优化，并不能真正完整有效的实现纵向位置的有效定位。因而常规的方法目前都存在着一定的局限性，不利于本领域技术人员更好地将光镊技术运用于生物、医疗和实验应用中。

技术实现要素：

本发明提出一种基于荧光耦合出射的光镊纵向定位反馈装置及方法以解决传统光镊技术中动态调控光束时样品纵向位置定位精度不高的问题。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种基于荧光耦合出射的光镊纵向定位反馈装置，包括分光镜、物镜、成像透镜、成像传感器、浸没溶液、多层载物片、收集透镜、信号采集传感器、前置透镜和位移控制装置，所述成像传感器、成像透镜、分光镜、物镜、多层载物片、收集透镜和信号采集传感器由上至下沿光轴依次设置，所述浸没溶液位于多层载物片上方，荧光样品悬浮于所述浸没溶液，前置透镜设于分光镜一侧，且前置透镜与所述位移控制装置连接，所述位移控制装置能够调节前置透镜的位置，用于捕获荧光样品的激光经前置透镜扩束后经分光镜反射再经物镜聚焦到多层载物片上方并捕获浸没溶液中的荧光样品，荧光样品所发出的光经过多层载物片以不同角度向下出射。

进一步地，所述位移控制装置与采集传感器相连，位移控制装置根据信号采集传感器所收到的信号改变前置透镜的位置。

进一步地，所述多层载物片包括自上而下设置的聚合物层、金属层和介质层。

进一步地，所述聚合物层为聚甲基丙烯酸甲酯层，其厚度为5nm至10nm。

进一步地，所述介质层为纳米量级厚度且由不同折射率的介电材料构成。

进一步地，所述信号采集传感器内设有高通滤波片，高通滤波片用于滤除激光。

进一步地，信号采集传感器入口处设置有窄带滤波片，保证所收集的信号是单色的荧光。

采用上述所述的基于荧光耦合出射的光镊纵向定位反馈装置的纵向定位反馈方法，包括以下步骤：

步骤一：依据所选择的荧光样品制备对应的多层载物片，将含有荧光样品的浸没溶液滴于制备的多层载物片上；

步骤二：在成像传感器中观测样品和激光，调节分光镜和物镜，用于捕获荧光样品的激光经前置透镜扩束后经分光镜反射再经物镜聚焦到多层载物片上方并捕获浸没溶液中的荧光样品，并记录激光聚焦点的位置，荧光样品所发出的光经过多层载物片以不同角度向下出射，由于多层载物片的调制，辐射荧光会主要集中在若干个不同角度区域，取不同角度区域之间的荧光辐射最弱处对应的角度为分界角；

步骤三：通过收集透镜和信号采集传感器采集分界角内外的荧光，测量不同角度区域所收集的荧光强度比值，依据所制备的多层载物片的结构和偶极子辐射理论计算不同深度偶极子在各个角度区域的荧光辐射强度，得到辐射荧光强度比值和纵向深度的关系，再根据所测量的荧光强度比值得到荧光样品位于浸没溶液之中的纵向位置，并将信号反馈给位移控制装置，进而改变前置透镜的位置，重复此过程从而完成所述纵向位置的精准定位。

进一步地，步骤一中所述多层载物片的制备方法为：在透明基底上交替沉积不同折射率的介质层，然后蒸镀金属层，再旋涂pmma聚合物层，最后烘干。

进一步地，步骤三中所述分界角依据多层载物片的结构不同而选择不同的角度。

本发明在传统光镊技术中通过将玻璃载玻片换为多层载物玻片，并在下方额外添加了荧光收集装置，使系统在光镊捕获的同时可以采集到荧光耦合出射的信号，进而测量不同耦合出射模式的强度比值。结合所设计的多层载物玻片结构以及微调过程中光束的变化，精确计算出荧光样品的纵向位置并反馈给电控精密位移台，从而实现光镊系统中的精确动态反馈。

相比于现有技术，本发明的优点在于：

(1)高精度的纵向定位：在传统光镊技术中引入多层载物玻片并扩展了光镊系统，提供了一种新的校准反馈手段，在对荧光样品进行观测和捕获的同时可以利用收集装置测量耦合出射强度，结合多层载物玻片的结构特性，可以在浸没溶液中任意绝对位置高精度的纵向定位；

(2)结构简单、成本低廉：无需商业显微系统中复杂的共聚焦部件、无需超分辨成像中所需的特殊荧光材料，仅仅利用多层载物玻片固有的多层结构，和简单的收集装置，即可实现纵向微小位移的观测，同时反馈信号给前置透镜，及时调整光束，同时，在物镜前添置前置透镜也有利于各种复杂矢量光束在光镊捕获时高效聚焦；

(3)易于扩展、应用范围广：本发明中的基于荧光耦合出射的光镊纵向定位反馈装置，易于附加于现有的光镊装置，可以在传统的光束缚、光捕获中实现各类荧光样品纵向位置的实时观测，在光镊系统中可以方便的动态调控光束位置，提高现有传感精度。

附图说明

图1为本发明基于荧光耦合出射的光镊纵向定位反馈装置的结构示意图。

图2为实施例中依多层载物片结构所计算的纵向位置与分界角外内比值的关系图。

图3为本发明的基于荧光耦合出射的光镊纵向定位反馈方法步骤三的流程图。

图中附图标记为：1、分光镜，2、物镜，3、成像透镜，4、成像传感器，5、浸没溶液，6、荧光样品，7、多层载物片，8、收集透镜，9、信号采集传感器，10、前置透镜，11、位移控制装置。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

如图1所示，一种基于荧光耦合出射的光镊纵向定位反馈装置，包括分光镜1、物镜2、成像透镜3、成像传感器4、浸没溶液5、多层载物片7、收集透镜8、信号采集传感器9、前置透镜10和位移控制装置11，所述成像传感器4、成像透镜3、分光镜1、物镜2、多层载物片7、收集透镜8和信号采集传感器9由上至下沿光轴依次设置，所述浸没溶液5置于多层载物片7上方，荧光样品6悬浮于所述浸没溶液5，前置透镜10设于分光镜1一侧，且前置透镜10与位移控制装置11相连，位移控制装置能够控制前置透镜10的位置。其中，多层载物片7优选为多层载物玻片，位移控制装置11优选为电控精密位移台，用于捕获荧光样品6的激光经前置透镜10扩束后经分光镜1反射再经物镜2聚焦到多层载物片7上方并捕获浸没溶液中的荧光样品6，荧光样品6所发出的光经过多层载物片7以不同角度向下出射。

所述位移控制装置11与采集传感器9相连，位移控制装置11根据信号采集传感器9所收到的信号改变前置透镜10的位置。

所述多层载物片7包括自上而下设置的聚合物层、金属层和介质层。其中，聚合物层优选为聚甲基丙烯酸甲酯层，其厚度为5nm至10nm；金属层厚度为40nm至50nm。所述介质层为纳米量级厚度且由不同折射率的介电材料构成。从而保证了荧光样品所发出的荧光一部分在分界角内出射，一部分在分界角外出射。

所述荧光样品可以位于浸没溶液中任意位置。且当荧光样品位于浸没溶液中不同纵向位置时，所述信号采集传感器收集到的荧光在分界角内和分界角外的强度比值不同。

所述信号采集传感器9内设有高通滤波片，高通滤波片用于滤除激光。保证了收集到的光信号都是纯净的荧光信号。

在信号采集传感器9入口处设置有窄带滤波片，保证所收集的信号是单色的荧光。

所述收集透镜数值孔径足够大，可以完成分界角内外荧光的收集。可选择地，收集透镜可以用物镜代替，实现分界角内外荧光的收集。

采用上述基于荧光耦合出射的光镊纵向定位反馈装置的纵向定位反馈方法，具体包括以下步骤：

步骤一：依据所选择的荧光样品6制备对应的多层载物片7，将含有荧光样品6的浸没溶液5滴于制备的多层载物片7上；

步骤二：在成像传感器4中观测样品和激光，调节分光镜1和物镜2，用于捕获荧光样品的激光经前置透镜10扩束后经分光镜1反射再经物镜2聚焦到多层载物片7上方并捕获浸没溶液中的荧光样品6，并记录激光聚焦点的位置，荧光样品6所发出的光经过多层载物片7以不同角度向下出射，由于多层载物片7的调制，辐射荧光会主要集中在若干个不同角度区域，取不同角度区域之间的荧光辐射最弱处对应的角度为分界角；

步骤三：通过收集透镜8和信号采集传感器9采集分界角内外的荧光，测量不同角度区域所收集的荧光强度比值，依据所制备的多层载物片7的结构和偶极子辐射理论计算不同深度偶极子在各个角度区域的荧光辐射强度，得到辐射荧光强度比值和纵向深度的关系，再根据所测量的荧光强度比值得到荧光样品6位于浸没溶液5之中的纵向位置，并将信号反馈给位移控制装置11，进而改变前置透镜10的位置，重复此过程从而完成所述纵向位置的精准定位。

步骤一中所述多层载物片7的制备方法包括：在透明基底上交替沉积不同折射率的介质层，然后蒸镀金属层，再旋涂聚合物层，最后烘干。

步骤三中所述分界角依据多层载物片7的结构不同而选择不同的角度。

上述步骤三中荧光样品位于浸没溶液中的纵向位置的精准定位，需要结合粗调时候所观测的激光聚焦面和测量的荧光强度比值共同确定。根据焦面位置确定荧光样品大致的位置范围，然后通过电控精密位移台微调前置透镜使光束上下微调聚焦，同时利用荧光强度比值变化趋势判定荧光样品的运动方向以及其精确位置。从而再次反馈信号于电控精密位移台，完成光镊实验中对荧光样品的精确动态调控。

实施例1

一种基于荧光耦合出射的光镊纵向定位反馈装置，包括分光镜1、物镜2、成像透镜3、成像传感器4、浸没溶液5、荧光样品6、多层载物玻片7、收集透镜8、信号采集传感器9、前置透镜10和电控精密位移台11。所述成像传感器4、成像透镜3、分光镜1、物镜2、多层载物玻片、收集透镜8和信号采集传感器9沿光轴依次设置，所述浸没溶液5置于多层载物玻片7上方，荧光样品6悬浮于所述浸没溶液5，所述电控精密位移台11连接前置透镜10，并控制前置透镜10的位置。

进一步地，所述多层载物玻片7包括自上而下设置的聚合物层、金属层、介质层。所述多层载物玻片7的介质层厚度可以根据待测荧光样品6的不同而更换。

进一步地，所述多层载物玻片7的聚合物层为聚甲基丙烯酸甲酯层，其厚度为10nm。

进一步地，所述多层载物玻片7的金属层材料为银，厚度为40nm。

进一步地，所述多层载物玻片7的介质层为交替的氮化硅层和二氧化硅层，每层厚度不超过200nm。

进一步地，所述前置透镜10可以根据电控精密位移台所收到的信号而改变位置。已设定了高电平信号右移(远离分光镜1方向)，低电平信号左移(靠近分光镜1方向)。

进一步地，浸没溶液5为水溶液，所述荧光样品6悬浮于浸没溶液5中。当荧光样品6位于浸没溶液5中不同纵向位置时，所述信号采集传感器9收集到的荧光在分界角内外比值不同。

进一步地，所述信号采集传感器9含有高通滤波片，将收集到的激光滤去。额外地，在所述信号采集传感器9前添加了窄带滤波片，保证所收集的信号是单色的荧光。

进一步地，所述收集透镜8选择为物镜，可以完成分界角内外荧光的收集。

采用上述基于荧光耦合出射的光镊纵向定位反馈装置的纵向定位反馈方法，在此实施例中，将样品定位至多层载物玻片上方200nm处。包括以下步骤：

(1)依据选择的荧光样品6为掺杂罗丹明6g的荧光小球，制备多层载物玻片，所述多层载物玻片的制备包括：在透明盖玻片上交替沉积氮化硅和二氧化硅，然后再蒸镀金属层，最后再旋涂pmma聚合物层，烘干后再将含有荧光样品6的浸没溶液5滴于多层载物玻片的上方；

(2)在成像传感器4中观测，调节分光镜1，使激光光束聚焦于多层载物玻片上方附近并捕获荧光样品6，并确定激光焦面位置，位于多层载物玻片上方200nm处附近；

(3)通过收集透镜8和信号采集传感器9采集分界角内外的荧光，取分界角为58°，测得分界角内和分界角外所收集的荧光强度初始比值为12.5，依据步骤一中所制备多层载物玻片7的结构，计算出荧光样品位于浸没溶液之中距离多层载物玻片200nm处时分界角内外的荧光强度比值为11.93，定义为参考值，如图2。首先让电控精密位移台得到高电平信号，再将初始值信号反馈给电控精密位移台，进而调节前置透镜10的位置右移，改变聚焦光束位置。再次记录并计算所收集的荧光强度比值，并再次自动反馈调节前置透镜的位置，直到所测定的强度比值与参考值的差小于0.01。从而完成纵向位置的精准定位，如图3。

此方法通过所记录传感器中不同角度的不同出射强度，利用其比值完成了所捕获样品的位置精准定位，其误差理论小于16nm。

本实施例所述的纵向定位反馈法可以在保证光镊实验中定位精度的同时完成离载物基片较远位置的纵向定位，完成深层样品的扫描与探测。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。