趋化因子CCL8在制备皮肌炎病情及预后评估试剂中的应用的制作方法

本发明涉及生物诊断和医药领域，具体涉及趋化因子ccl8在制备皮肌炎病情及预后评估试剂中的应用。

背景技术：

皮肌炎(dermatomyositis，dm)是一类自身免疫性炎性肌病，以特征性皮肤病变、骨骼肌非化脓性炎性改变和进行性肌无力为主要临床表现，发病机制尚不明确。皮肌炎患者常合并间质性肺炎(interstitiallungdisease，ild)，部分患者肺部病变进展迅速，预后不良。目前临床上主要依据患者临床表现及一些实验室检查指标(如激酶、c反应蛋白、血清铁蛋白及肌炎特异性抗体滴度等)来综合评估病情。已有很多尝试应用生物标记物来帮助诊断及评估dm病情的研究，但目前尚无特异且灵敏的指标用于判断患者病情和预测患者结局。

趋化因子是一类功能类似、分子量约8-12kda的小分子蛋白。已有研究者报道趋化因子cxcl10、cx3cl1、cxcl8和ccl2等与皮肌炎患者疾病活动度相关，但是目前尚缺乏大样本及对dm患者血浆趋化因子的系统分析，尚未发现较合适的用于评估dm病情的趋化因子。

因此，若能筛选出可以准确有效地监测和评估dm病情、预测患者预后的趋化因子，对患者及时治疗和实现良好的医患沟通起着至关重要的作用。

技术实现要素：

本发明的目的在于研究趋化因子ccl8在皮肌炎患者病情及预后评估中的作用，提供一种皮肌炎病情及预后评估的试剂盒，为临床上治疗和评估dm预后提供理论依据和实验数据。

趋化因子ccl8，又名单核细胞趋化蛋白2(monocytechemoattractantprotein2，mcp-2)，可以趋化并激活多种免疫细胞，如和过敏反应相关的肥大细胞、嗜酸性粒细胞及嗜碱性粒细胞，和炎症反应相关的单核-巨噬细胞、t细胞及nk细胞等。前人研究表明趋化因子cxcl10、cx3cl1、cxcl8和ccl2等与皮肌炎患者疾病活动度相关，可用于皮肌炎的诊断或病情评估，而关于ccl8和dm患者病情及预后的详细研究尚未见报道。

在本研究中，我们以确诊皮肌炎且未合并其他免疫病的患者血浆标本为研究对象，对其进行了蛋白芯片检测，并扩大样本用elisa法验证蛋白芯片检测结果，结合患者生化指标及临床表现判断相关性。研究结果显示，皮肌炎患者血浆ccl8水平显著高于健康人群，且其表达水平和患者病情及预后有关；在博来霉素诱导的小鼠间质性肺炎模型中，ccl8加重肺部病变。临床治疗有效的皮肌炎患者血浆ccl8水平较治疗前降低。

基于dm患者血浆ccl8的特异性高表达且与病情及预后密切相关，ccl8可作为dm的潜在的生物标志物，应用于dm患者血浆标本的检验，为dm患者病情及预后评估提供一定的理论基础。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1)本发明验证了dm患者血浆中ccl8高表达，且ccl8水平与患者病情及预后相关，本发明首次提出血浆ccl8可作为皮肌炎潜在的生物标记物，应用于皮肌炎患者的检测、病情评估和预后分析；

2)本发明为ccl8加重肺部病变提供了实验数据和理论基础；

3)本发明为通过干预阻断ccl8通路来改善皮肌炎预后提供了技术启示，其有可能作为皮肌炎未来靶向治疗的特定靶点，为皮肌炎治疗提供新思路。

附图说明

图1是健康人和dm患者血浆蛋白芯片分析结果图，其中：横坐标为aah-cyt-g5蛋白芯片中健康人和dm患者血浆样本中筛选出的趋化因子，纵坐标表示各趋化因子的荧光强度，hc代表健康人，dm代表dm患者；

图2是健康人和dm患者血浆样本elisa检测结果图，其中：横坐标的hc代表健康人，dm代表dm患者，纵坐标表示血浆ccl8表达量；

图3是治疗前后dm患者的血浆ccl8表达水平图，其中：横坐标的before和after分别表示激素加免疫抑制剂治疗前和有效治疗后的dm患者的血浆ccl8，纵坐标表示血浆ccl8的表达量；

图4是血浆ccl8水平与临床表现的分析结果图，其中：a为血浆ccl8高水平的dm患者(ccl8high)和血浆ccl8低水平的dm患者(ccl8low)出现向阳性皮疹的比例，b为血浆ccl8高水平的dm患者(ccl8high)和血浆ccl8低水平的dm患者((ccl8low)出现gottron征的比例；

图5是血浆ccl8水平与皮肌炎实验室检查指标分析结果图，其中：a、b、c分别为血浆ccl8高水平的dm患者(ccl8high)和血浆ccl8低水平的dm患者(ccl8low)的血清铁蛋白(sf)、c反应蛋白(crp)、血清白蛋白(alb)的测定结果，d为血浆ccl8水平与用力肺活量(fvc)相关性结果，其中：横坐标为ccl8的含量，纵坐标为fvc预测值；

图6是血浆ccl8水平与dm患者生存期相关性分析结果图，其中，a为dm患者死亡原因饼状图，b为血浆ccl8高水平的dm患者(ccl8high)和血浆ccl8低水平的dm患者(ccl8low)的生存期与生存率相关性图；

图7是c57bl/6小鼠肺组织he染色图，其中：ctrl为对照组，blm为博来霉素处理组，blm+pbs为博来霉素+磷酸盐缓冲液组，blm+ccl8为博来霉素+重组ccl8组。

具体实施方式

为了使本领域技术领域人员更好地理解本发明的技术方案，下面通过具体实施例对本发明作进一步说明。

下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所用的试剂、方法和设备，如无特殊说明，均为本技术领域常规试剂、方法和设备。

实施例1

1、样品的选取及处理

实验组(dm)：抽取皮肌炎(dm)患者的新鲜外周血并离心分离出血浆，然后迅速放入冻存管，保存于-80℃冰箱备用；

对照组(hc)：抽取无免疫病的年龄、性别相匹配的健康人(hc)的新鲜外周血并离心分离出血浆，然后迅速放入冻存管，保存于-80℃冰箱备用。

2、dm患者血浆趋化因子筛选及验证

2.1)筛选：本实验中，我们应用购自raybiotech公司的aah-cyt-g5蛋白芯片对16例健康人及16例dm患者血浆样本进行了蛋白芯片分析，系统性比较分析hc和dm患者血浆中多种趋化因子的表达差异；由图1所示的蛋白芯片分析结果可见，健康人和dm患者血浆中均表达cxcl5、cxcl2、cxcl1、cxcl7、ccl1、ccl8等趋化因子，其中，表达差异最显著的是趋化因子ccl8。

2.2)验证：

2.2.1)扩大分析样本量，参照步骤1获取41例hc及158例dm患者血浆样本，对41例hc及158例dm患者血浆样本进行elisa检测，如图2所示检测结果证实，dm患者血浆ccl8水平相较于hc显著升高。

2.2.2)对上述158例dm患者中22例dm患者多次检测血浆ccl8水平。参照步骤1获取该22例dm患者的血浆样本，采用elisa方法检测并记录这些血浆样本中ccl8表达水平，然后对这22例dm患者进行激素加免疫抑制剂治疗2个月，其中20例患者治疗有效，治疗后病情缓解，再参照步骤1获取治疗有效的20例dm患者的血浆样本并进行ccl8表达水平测定，比较治疗有效的这20例dm患者的ccl8表达水平变化情况。

由图3可见，经激素加免疫抑制剂治疗有效的dm患者的血浆ccl8表达水平显著下降，表明血浆ccl8水平与dm病情正相关。

3、血浆ccl8水平与dm患者病情的相关性

以随访成功的66例血浆ccl8高水平的dm患者(ccl8high)和63例血浆ccl8低水平的dm患者(ccl8low)为研究对象，对随访成功的这129例dm患者的血浆ccl8水平与临床表现(向阳疹和gottron征)及各项实验室检查指标(血清铁蛋白、c反应蛋白、白蛋白、用力肺活量fvc)整合分析，验证ccl8和dm患者病情的相关性。

其中，ccl8水平高低分界值为hc血浆ccl8水平均值+2sd(即67.3pg/ml)，高于该值认定为ccl8高水平，低于该值认定为ccl8低水平。

由图4可见，血浆ccl8高水平的dm患者发生向阳疹(图4a)和gottron征(图4b)的比例高于血浆ccl8低水平的dm患者，表明血浆ccl8水平与向阳性皮疹和gottron征呈正相关，即血浆ccl8水平高者更易出现向阳疹和gottron征；

由图5可见，收集所有随访成功的dm患者临床资料和检测的生化指标，综合分析生化指标和血浆ccl8水平结果，血浆ccl8高水平的dm患者的血清铁蛋白(图5a)、c反应蛋白(图5b)明显高于血浆ccl8低水平患者，血浆ccl8高水平的dm患者的血清白蛋白(图5c)低于血浆ccl8低水平的dm患者，ccl8表达水平和dm患者的fvc显著负相关(图5d)；

上述一系列临床表现(向阳疹和gottron征)及各项实验室检查指标(血清铁蛋白、c反应蛋白、白蛋白、用力肺活量fvc)结果与dm患者的病情相吻合，dm患者的血浆ccl8水平与上述一系列临床表现及各项实验室检查指标显著相关，因而血浆ccl8水平可以反映dm患者病情。

4、血浆ccl8水平与dm患者生存期的相关性

对上述66例血浆ccl8高水平的dm患者(ccl8high)和63例血浆ccl8低水平的dm患者(ccl8low)长期随访，以首次出现dm特征性皮疹(向阳疹或gottron征)为起始时间，以死亡结局或检测血浆ccl8水平后1年期限为随访终点，分析dm患者主要死亡原因，并比较血浆ccl8高水平患者和血浆ccl8低水平患者的生存期差别。

由图6a可见，肺部感染是dm患者的首要死亡原因(71.4％)；由图6b可见，血浆ccl8高水平的dm患者生存期明显短于血浆ccl8低水平的dm患者；上述结果表明，血浆ccl8水平可能与肺部感染正相关。

5、ccl8加重间质性肺炎小鼠肺部病变

将24只8周龄的c57bl/6小鼠随机分四组分别造模，所有小鼠均给予正常饮食，于第7天处死所有鼠后取肺组织做苏木精—伊红染色(he染色)，观察肺部炎症情况：

1)对照组(ctrl)：第1天，对6只8周龄的c57bl/6小鼠麻醉后气管内滴入50ul生理盐水，作为对照组；

2)博来霉素处理组(blm)：第1天，对6只8周龄的c57bl/6小鼠麻醉后气管内滴入5mg/kg博来霉素，作为博来霉素处理组；

3)博来霉素+磷酸盐缓冲液组(blm+pbs)：第1天，对6只8周龄的c57bl/6小鼠麻醉后气管内滴入5mg/kg博来霉素，分别在之后第3天、第4天气管予50ul的磷酸盐缓冲液。

4)博来霉素+重组ccl8组(blm+ccl8)：第1天，对6只8周龄的c57bl/6小鼠麻醉后气管内滴入5mg/kg博来霉素，分别在之后第3天、第4天气管予400ng的重组小鼠mcp-2(ccl8，peprotech公司购入)。

如图7所示，博来霉素可以导致急性小鼠肺部间质性炎症(blm)，而ccl8可加重间质性肺炎小鼠肺部病变(blm+ccl8)。

由上述“4、血浆ccl8水平与dm患者生存期的相关性”分析结果：血浆ccl8水平可能与肺部炎症正相关，结合图7分析结果：ccl8可加重间质性肺炎小鼠肺部病变，可以推测，dm患者的血浆ccl8水平与病情及预后密切相关。

综上所述，dm患者血浆中ccl8高表达，而且ccl8可加重间质性肺炎小鼠肺部病变，ccl8水平和患者病情及预后密切相关。所以，ccl8可作为评估dm病情的潜在生物标志物，应用于皮肌炎病情评估的试剂中，同时也为ccl8应用在皮肌炎患者病情和预后评估试剂中提供了实验数据和理论基础，有助于皮肌炎患者的诊断及疾病预后分析，可为临床预测患者结局提供重要的依据和参考价值，具有普及和推广应用价值。

实施例2

一种用于皮肌炎病情及预后评估的试剂盒，所述试剂盒包括：

a)容器；

b)装在所述容器内的ccl8蛋白的特异性抗体；

c)标签或使用说明书，所述标签或使用说明书中注明所述试剂盒用于皮肌炎病情评估以及利用所述试剂盒预测dm患者预后的使用方法。

进一步地，标签或使用说明书中注明：当dm患者血浆ccl8值≥67.3pg/ml时，则诊断该患者病情较重且预后不良；当皮肌炎患者血浆ccl8值＜67.3pg/ml时，则诊断该患者病情较轻且预后较好。

利用本发明的上述检测试剂盒，定量检测129例dm患者血浆样本(以首次出现dm特征性皮疹(向阳疹或gottron征)为起始时间，以死亡结局或检测血浆ccl8水平后1年期限为随访终点)中ccl8的含量，随访过程中死亡患者49例，至随访终点存活患者80例。

结果表明，当采用ccl8的蛋白含量的截断点为67.3pg/ml时，结果如下表1所示，用ccl8评估dm预后的敏感性为81.6％，特异性为67.5％。

表1.ccl8诊断试剂盒诊断结果表

以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。