一种基于液晶变焦透镜的光切片显微成像方法和装置与流程

本发明属于光学成像领域，具体涉及一种基于液晶变焦透镜的光切片显微成像方法和装置。

背景技术：

现代生命科学研究经常需要对基因或者蛋白质表达的完整时空模型进行多维成像。为了可视化发育事件的精确分布，理想情况下，该模型可在活体的胚胎细胞中观察并获取。此时，光学显微镜便为非侵入式进行活体胚胎细胞研究提供重要实现手段。

近年来，科研工作者提出了几种允许对大样本进行三维重构的技术。例如光学投影断层扫描可以对固定胚胎进行高分辨率成像；磁共振成像和光学相干断层扫描同样可以实现非侵入性成像，但是不容易提供特定的对比度。

在诸多显微技术中，光切片显微成像技术由于其成像速度高、低光漂白性和无侵入式等特点，在对活体胚胎样本成像中取得了不错的成果。这种技术一大特征为照明光路与探测光路正交。在照明光路中，常利用柱透镜或者振镜扫描的方式产生光片，对样品的特定平面进行照明，与样品照明平面正交的探测光路对被照明的结构进行探测成像，最终对所获得的多视角或者多平面的数据进行数据融合即可获得样本的三维结构。如公开号为cn108982455a的专利申请文件提供的一种多焦点光切片荧光显微成像方法和装置，该技术可以亚细胞级别分辨率对细胞进行成像。

为了使样品能被均匀照明激发，光片的有效照明区域常常被限制在共焦参数范围内。照明光片的厚度是制约三维成像时纵向分辨率的重要因素，照明样品所用的光片越薄，则纵向分辨率越高。如何利用更薄的光片对样品进行照明仍是一个值得研究的问题。

技术实现要素：

本发明提供了一种基于液晶变焦透镜的光切片显微成像方法和装置，利用液晶变焦透镜的可电控焦距特性实现样品横向不同区域照明。该种方法和装置简单，操作方便；可实现使用更薄的光片对样品进行照明了，进一步提高了光切片显微成像轴向分辨率。

为实现上述的发明目的，本发明所采用的具体技术方案如下：

一种基于液晶变焦透镜的光切片显微成像方法，包括以下步骤：

1)激光光束经过扩束后入射扫描振镜；

2)控制扫描振镜振动，使入射激光经过照明物镜后沿y向振动形成虚拟光片；

3)改变变焦透镜的焦距，使光片聚焦在样品不同x向区域，并利用探测物镜收集样品不同x向照明区域激发的荧光；

4)移动样品，使光片照明样品不同z向切面，探测物镜收集样品不同z向切面激发的荧光；

5)利用多幅荧光强度图像进行数据处理，重构得到样品三维图像。

优选的，在步骤3)中，所用变焦透镜为液晶变焦透镜，通过调节液晶变焦透镜的输入电流，改变液晶变焦透镜的焦距。

本发明采用液晶变焦透镜，通过改变输入电流或者电压来实现变焦，相较于传统机械传动控制的变焦透镜，系统不易受到外力损伤，响应时间更快。

优选的，至少改变激光的聚焦位置三次，在x向上分段多次照明样品。

为了得到更高的轴向分辨率，本申请利用虚拟光片，以更窄的范围扫描样品；为克服出现的有效照明区域变小的问题，通过移动光片有效照明区域，完成样品的横向扫描成像。

优选的，所述x向为照明光轴方向；z向为沿着探测光轴方向；y向为垂直于照明光轴和探测光轴方向；x向、y向和z向两两相互垂直；构成空间三维直角坐标系。

优选的，所述的照明物镜与探测物镜正交放置。

本发明还提供一种基于液晶变焦透镜的光切片显微成像装置，包括激发光路模块和探测光路模块；

所述的激发光路模块包括依次布置的：

激光器，发出激光光束；

扩束透镜组，对入射激光进行扩束，以使激光光束大小能够充满入瞳；

扫描振镜，用于控制光束进行y向振动，形成虚拟光片；

扫描透镜，用于配合扫描振镜对样品进行y方向扫描；

变焦透镜，用于改变激光光束在样品x向的聚焦位置；

压电移动平台，用于沿z向移动样品，使样品不同z向切面被照明；

照明物镜，用于将入射激光聚焦到样品进行照明，激发荧光；

所述的探测光路模块包括：

探测物镜，用于收集不同样品平面上被激发的荧光信号；

管镜，用于将探测物镜收集的荧光信号聚焦到scmos相机；

scmos相机，用于收集所述样品激发的荧光强度信号并成像；

计算机，用于控制所述的扫描振镜、变焦透镜、压电移动平台和scmos相机，分别改变扫描透镜的振动角度，实现对样品进行y向扫描；改变变焦透镜焦距，实现对样品进行x向的照明；改变压电移动平台的位置，实现沿z向移动样品，使样品不同z平面照明；控制scmos相机与扫描振镜同步，实现卷帘曝光，收集不同照明位置样品所激发的荧光信号，并进行数据处理，得到三维高分辨图像。

所用变焦透镜为液晶变焦透镜，通过调节液晶变焦透镜的输入电流，改变液晶变焦透镜的焦距。

优选的，所述的照明物镜与探测物镜正交摆放。

优选的，所述scmos相机由计算机模块控制，与扫描振镜同步工作，以卷帘模式逐行曝光每行像素，并记录样品激发的荧光信号。

本发明采用卷帘曝光模式，单独曝光具体的一行或者几行像素，可以避免来自其他高度位置的样品激发的荧光，提高成像的信噪比。

本申请中，所述扫描振镜、液晶变焦透镜、压电平台以及scmos均有计算机模块控制，以严格的时序控制工作时间，实现对样品的扫描。

优选的，所述的激发光路模块可包括两束照明光路：

扩束后的激光光束可经过分束系统，分束形成所述的两束照明光路，每束照明光路上依次设置有：扫描振镜、扫描透镜、变焦透镜和照明物镜；

两束照明光路内的照明光束由计算机控制同步照明样品，激发荧光。

本发明原理如下：

如图2所示，高斯光束在经过照明物镜后，随着其传播距离的增加，先是汇聚成最细的一个点，而后又逐渐发散。其光束最细处的位置称为束腰。计算机控制扫描振镜转动，使光束沿y向快速振动，形成虚拟光片照明样品。在不同传播距离上，高斯光束的光强是不一致的。一般认为，在共焦参数范围内(如图2中2·z0所示范围)，激光光强分布均匀，故在光切片成像系统中常用该范围内的光源作为有效照明区域进行样品照明。但由于光束在远离束腰位置呈发散分布，使得光片是具有一定厚度，离束腰越远的位置其厚度2·w(z)则越大，这极大地影响了成像时的轴向分辨率。

为了提高轴向分辨率，则需要使照明样品所用光片的厚度边薄，故本发明选择比共焦参数更窄范围内的光片作为有效照明区域对样品进行照明，比如可将长度为1/n(n>1)共焦参数的光片作为其有效照明区域(如图2中所示范围)。为了补偿由于有效光片长度变短而引起的视场变窄的问题，则可利用液晶变焦透镜改变激光聚焦束腰的位置，从而使得虚拟光片的有效照明区域在x向上进行移动，完成样品的x向照明。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明方法实现方便，利用液晶变焦透镜的可变焦特性，可实现样品x向分段照明，只需使用1/n(n>1)共焦参数长度的光片照明样品，照明样品光强更加均匀，且照明使用的光片厚度更薄，可有效提高轴向分辨率。

附图说明

图1为本发明一种基于液晶变焦透镜的光切片显微成像装置的示意图。

图2为激光沿y向扫描形成虚拟光片的示意图。

图3为样品池固定样品，虚拟光片扫描样品示意图。

图4分别为不同液晶变焦透镜焦距下样品分段照明示意图，其中，(a)图为有效光片照明区域照明样品左侧示意图，(b)图为有效光片照明区域照明样品中部示意图，(c)图为有效光片照明区域照明样品右侧示意图。

图5为采用双向照明实现本发明方法的装置示意图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图来详细说明本发明，但本发明并不仅限于此。

实施例1

如图1所示的光切片显微成像装置，包括：激光器1、单模光纤2、透镜3、透镜4、反射镜5、扫描振镜6、扫描透镜7、液晶变焦透镜8、照明物镜9、待测样品10、压电移动平台11、探测物镜12、管镜13、scmos相机14、计算机15。

激光器1发出激光光束，单模光纤2、透镜3和透镜4依次放置在激光光束光路的光轴上。单模光纤2用于激光光束进行滤波，透镜3和透镜4组成扩束系统，用于对激光扩束。

扩束后的激光经由反射镜5反射进入扫描振镜6上。扫描振镜6由计算机15控制，使激光沿着y向快速振动，在照明物镜前焦面形成虚拟光片(如图2所示)，实现对样品的y向扫描。

从扫描振镜6出射的光束入射到扫描透镜7和液晶变焦透镜8上。液晶透镜8由计算机15控制，通过改变输入液晶变焦透镜8的电流大小来改变液晶变焦透镜的焦长，从而光束可以以平行光束、汇聚光束和发散光束三种方式入射照明物镜9。照明物镜9用于将入射光束聚焦在待测样品10上，如图3所示，待测样品固定在样品池(如图3小圆柱体所示)上。当入射光束以平行光入射照明物镜9的入瞳时，聚焦后的光束束腰中心位于照明物镜9的像方焦平面上，即像距等于照明物镜9的焦距，如图4(b)所示；当入射光束以汇聚的形式入射照明物镜9的入瞳时，聚焦后的光束束腰中心位于照明物镜9的像方焦平面左方，即像距小于照明物镜9的焦距，如图4(a)所示；当入射光束以发散的形式入射照明物镜9的入瞳时，聚焦后的光束束腰中心位于照明物镜9的像方焦平面右方，即像距大小于照明物镜9的焦距，如图4(c)所示。通过以上方式，使得光束被聚焦在待测样品10不同位置上，从而可以只利用比共焦参数更窄范围内的光片作为有效激发光源，实现利用更薄的光片照明样品，可有效提高提高成像的轴向分辨率。

待测样品10被照明平面位于探测物镜12的焦平面。载有待测样品10的样品池固定在压电移动平台11上，通过计算机15控制压电移动平台沿z向移动样品，使样品不同的z切面被从照明物镜9出射的激光照明。待测样品10被照明区域所激发的荧光被探测物镜12接收，随后经由管镜13聚焦，成像至scmos相机14。scmos相机14由计算机15控制其曝光模式与曝光时间。计算机15控制scmos相机14以卷帘模式曝光并且与扫描振镜6同步，从而使得当激光在y向照明样品时，scmos相机14对应行像素同步曝光。这样做的优点为可以避免来自其他y向上样品所激发的散射光的影响，提高成像对比度。

计算机15将scmos采集的多幅荧光图像进行处理，提取有效信息并对待测样品10进行三维重构。

采用图1所示的基于液晶变焦透镜的光切片显微成像装置工作方法如下：

(1)激光器1发出激光光束经由透镜3和透镜4组成的扩束系统扩束后入射到扫描振镜6，被指引进入照明物镜11后聚焦到样品的具体某个样品面上。由计算机15分别控制扫描振镜6、液晶变焦透镜8、压电移动平台11以及scmos相机14的工作时序；

(2)利用计算机15控制控制压电移动平台11使样品的z1切面被照明，使振镜6扫描待测样品10的y1方向，同时控制液晶变焦透镜8的焦距，使得聚焦后的虚拟光片有效照明区域坐落于扫描样品的左侧部位(如图4(a)所示)；

(3)控制scmos相机14与待测样品10照明位置y1对应的v1行像素曝光；

(4)保持液晶变焦透镜8的焦距不变、压电移动平台11位置不变，改变扫描振镜6的角度，使样品的y2位置被照明，控制scmos相机14下一行v2行像素曝光；

(5)重复步骤(4)，直至待测样品10的左侧位置被扫描完毕，由计算机读取scmos相机14的信息并保存；

(6)改变液晶变焦透镜8的焦距，使得虚拟光片有效照明区域均匀照明待测样品10的中部和右侧(如图4(b)、4(c)所示)，重复步骤(3)-(5)，直至待测样品10的剩下区域信息完整记录；

(7)利用计算机15控制压电移动平台11使样品的z2切面被照明，重复步骤(2)-(6)，使得不同层的样品信息被记录；

(8)最终通过计算机15从所获取的所有数据中提取光片有效照明区域所激发的待测样品10的荧光信息并融合，实现对样品的三维重构。

实施例2

如图5所示，该实施例光切片显微成像装置也可以采用双边照明的方式实现。图5与图1相比，将图1中的反射镜5替换为半透半反镜，加入了反射镜16、第二照明物镜17、第二液晶变焦透镜18、第二扫描透镜19和第二扫描振镜20。半透半反镜将经过扩束后的激光光束以50：50的比例进行分束并分别入射两条照明光路。第二照明物镜17须与第一照明物镜9水平对齐且与探测物镜12正交放置。第二扫描振镜20须与第一扫描振镜6同步工作，从而使得两侧照明光路能同时照明样品同一位置。第二液晶变焦透镜18与第一液晶变焦透镜8相同，均有计算机模块15控制输入电流大小，以实现沿x方向改变虚拟光片有效照明区域的位置。利用双边照明，理论上可以控制第一液晶变焦透镜8和第二液晶变焦透镜18的焦长变化范围更短，可选地实现以4等分照明样品，利用通过扫描振镜6和扫描振镜20振动激光沿y向扫描所产生的虚拟光片厚度更薄区域照明，进一步获取比单边照明更高的z方向的分辨率，改善了成像质量。其他方法和步骤与实施例1相同。

以上所述仅为本申请的较佳实施举例，并不用于限制本申请，凡在本申请精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。