用于细菌毒素的基于孢子的生物混合微型机器人和自动化检测系统的制作方法

发明领域

本发明一般涉及使用官能化微型机器人设备、自动化荧光识别和检测方法以及相关的检测系统来检测微生物毒素和确定细菌的存在。

背景技术：

人体中存在成千上万种细菌。有益细菌可以帮助人体将大的食物分子分解成可用的燃料并且产生维生素来保护人体免受疾病侵害，而有害细菌可以使我们的身体不适，并且感染有害细菌可以引发一系列与细菌有关的疾病并且甚至导致死亡。为了及早治愈细菌感染，快速、灵敏和及早地鉴定临床样本中的特定细菌是有利的。例如，艰难梭菌(clostridiumdifficile(c.diff))是革兰氏阳性厌氧菌和胃肠道病原体，在发达国家造成数十万医院感染，感染艰难梭菌可以导致从轻度腹泻到甚至致死性假膜性结肠炎的一系列与艰难梭菌有关的疾病(cdad)。市售的艰难梭菌诊断策略通常包括酶免疫测定(eia)，细胞培养物细胞毒性中和测定(ccna)，谷氨酸脱氢酶(gdh)测定和对粪便样品进行的分子测定，乙状结肠镜检查或结肠镜检查，以及计算机断层(ct)扫描。这些商用诊断策略或是通过缀合技术利用由艰难梭菌产生的两种毒素的特异性靶向来检测，或是对疑似感染部位进行直接观察。然而，这些常规的艰难梭菌筛查受到以下限制：分析成本高，对参考物的依赖性强，处理时间长(例如24-48小时)，灵敏度和特异性变动大，来自临床图像的非特异性和低准确性信息，以及要求明显的感染部位。开发一种简单、快速且实时监视的诊断方法将有利于临床需求，并且有助于临床医生在感染开始时开出有效治疗的处方。

技术实现要素：

本发明的实施方案涉及用于实施在流体中检测靶分子例如检测毒素的材料、设备、方法和系统。检测可以使用运动控制系统和图像处理器而基于连续运动的荧光微型机器人的强度识别和追踪。本发明包括在数十分钟内进行至少一个循环步骤的细菌毒素检测方法，该方法可以包括初始优化选择步骤和连续运动检测步骤。此外，本发明涉及设计用于检测细菌毒素的所有材料、设备和系统。

在一方面，本发明提供了用于检测靶分子的在流体中推进的设备，该设备包括微型机器人。通过利用从微米/纳米材料继承的独特机械运动和官能化容易性，由各种类型的能源驱动的人工微米/纳米机器人可以用于遥感策略。运动传感设备可以提供实时和现场测量，并且还可以引起“运动中(on-the-move)”反应，从而加快由来自连续运动的内置(built-in)样品溶液混合和改善的接触所产生的反应速率。运动维度的引入为高效的化学/生物传感分析提供了解决方案。本技术的实施方案可以包括生物混合(biohybrid)官能化微型机器人，以与靶分子例如毒素分子相互作用。

生物混合官能化微型机器人包括芯、磁性涂层和检测探针涂层。芯可以是天然孢子，其具有独特且复杂的三维雕塑构造并且可以大量培养。在芯的表面上是中间层。中间层可以由用于在流体中驱动和操控以及锚定官能团的分级结构构成。在中间层的表面上是检测探针涂层，其可以由官能化碳量子点构成，所述官能化碳量子点用于在流体中附着于靶分子(例如毒素分子)，从而产生荧光变化以进行追踪。使用检测探针涂层，生物混合官能化微型机器人适用于检测靶分子的存在，以基于“运动中”反应的荧光变化来检测样本中生物靶标的存在。

在实施方案中，可以通过逐步涂覆技术来配置生物混合官能化微型机器人。如此获得的官能化微型机器人可以用于基于在数十分钟内在各种介质中连续运动所引起的荧光变化来检测一系列靶标毒素。微型机器人可以包括天然孢子芯、中间层涂层和检测探针涂层。天然孢子芯可以包括任何植物和真菌的孢子。芯也可以是合成芯，并且优选合成多孔芯。例如，芯可以包括介孔二氧化硅微米/纳米结构。多孔芯的存在有利于：大规模制造官能化微型机器人，目视观察用以追踪，以及检测探针的高质量负载，以使在低于纳克/毫升的水平(与市售elisa相当)下具有良好灵敏度。中间层涂层可以包括驱动和操控的结构以及含有与自组装单层分子缀合的磁性纳米颗粒的官能化组件，其可以为微型机器人提供用于在磁场发生器中运动的磁特性和用于进一步缀合的官能性。磁性涂层可以包括fe3o4纳米颗粒，其可以扩展到其他磁性颗粒，诸如镍、铁及其氧化物以及其他磁性金属氧化物。如本文所使用的，术语“磁性”是指响应于磁场的材料特性，例如但不限于顺磁性和铁磁性。检测探针涂层可以包括具有荧光发射的碳点和各种特异性基团或配体分子，例如，靶向重复性寡肽的寡糖，靶向内毒素的苯基硼酸(papa)，与霉菌毒素和蓖麻毒素b毒素结合的不同适体。检测探针涂层还可以包括具有相同的靶向检测官能度的其他荧光探针。在实施方案中，检测探针涂层可以包括具有不同特异性靶向能力的不同探针类型用以检测不同靶标。检测探针涂层中的检测探针可以与靶分子例如生物靶标结合并且与其形成复合物。可以检测这样的复合物形成，并且基于运动官能化微型机器人的传感荧光变化来确认靶分子的存在。测试流体中的靶标可以包括细菌毒素，例如艰难梭菌毒素的毒素a和毒素b，革兰氏阴性细菌的内毒素，来自腐烂食品中的真菌的霉菌毒素(赭曲毒素a(ochratoxina)和串珠镰孢菌毒素b1(fumonisineb1))，甚至以及植物蓖麻毒素b毒素。

在另一个方面，本发明提供了检测流体中的细菌毒素的系统，所述系统基于官能化微型机器人连同自动化荧光识别和检测方法。该系统可以包括如上所述的运动荧光微型机器人和运动控制系统，该运动控制系统以自动或手动操作模式在流体中推进微型机器人运动。该系统还包括成像设备，例如倒置荧光显微镜或荧光发射多重读取器(multi-reader)，并且可以直接应用于检测毒素靶标的存在。该方法包括对荧光微型机器人的初始优化识别以及随后的随着运动的强度估计，这通过运动控制系统来实现。

在实施方案中，该系统可以使用官能化微型机器人和运动控制系统进行配置，该运动控制系统由磁场发生器、控制器箱和用于荧光观察的机动样品平台构成。运动控制系统可以推进官能化微型机器人在各种介质中游动，用以基于“运动中化学(chemistry-on-the-move)”反应所引起的荧光强度的变化来检测特定浓度的靶标毒素的存在。运动控制系统还可以以手动或自动操作模式控制官能化微型机器人运动。磁场发生器提供外部旋转磁场，并且包括多个电磁线圈和/或旋转磁铁。控制器箱包括硬件和软件以控制官能化微型机器人的运动路径的自动规划，以完成荧光变化的实时监视。样品平台可以包括机动自动台和样品架(holder)，并且可以用于移动样品以进行初始优化识别和荧光观察，这将在下面更详细地讨论。该系统可以集成到倒置荧光显微镜上，或者与荧光发射多重读取器集成在一起，用以通过基于官能化微型机器人的运动所引起的加速荧光变化来感测复合物形成，以检测生物或临床样本中细菌毒素的存在。

可以以提供以下优点中的一个或多个的特定方式来实施本发明中描述的主题。例如，所公开的官能化微型机器人可以通过逐步涂覆使用低成本天然孢子大规模地生产，这优于常规的耗时且昂贵的模板辅助合成，该模板辅助合成通常使用模板(如阳极氧化铝模板)以通过初始沉积和随后移除模板来获得所需的结构。所公开的官能化微型机器人包括孢子的复杂三维雕塑和多孔结构，其提供了用于在涂覆过程中附着于功能性纳米颗粒的活性位点，并且因此提供了靶分子的接触反应位点。由磁性纳米颗粒构成的官能化微型机器人可以在外部磁场的同时非接触式定向控制下远程驱动，这比需要另外的定向引导的燃料推进的微型机器人更好。官能化微型机器人也可以在各种流体中推进，所述流体包括生物流体，诸如血清、粘液、尿液、粪便上清液和胃酸。微型机器人还显示出可控制的游动追踪轨迹。包含碳点的官能化微型机器人可以在绿光激发下发射红光，其可以在暗场下进行追踪。在实施方案中，微型机器人可以包括除碳点以外的荧光纳米颗粒，例如聚合物点、硅纳米颗粒、二硫化钼(mos2)纳米颗粒、mxene纳米颗粒及其组合。荧光纳米颗粒可以响应于与碳点相同或不同的激发波长而发射相同或不同波长的光。微型机器人的官能化可以通过带有配体分子(例如寡糖、适体、苯基硼酸和其他毒素靶向分子)的碳点而引入。官能化微型机器人可以通过观察随着运动的荧光变化来建立有效的基于运动的靶分子检测。官能化微型机器人的运动可以增强溶液混合，并且提高靶分子在测试溶液中的扩散速率。与仅依赖于常规扩散的静态微型机器人相比，改善的混合和扩散导致产生了更快、更有利的识别反应。官能化微型机器人可以在多种生物医学和临床相关应用中提供以下优点：高检测效率、规模放大的合成以及ng/ml水平的痕量样品分析。与elisa的商用探针(抗体)相比，具有检测探针的官能化微型机器人更便宜，并且能够产生和具有独特的运动性能。

所公开技术的运动控制系统可以使官能化微型机器人以不同的模式运动。运动控制系统可以包括自动控制操作模式，其中微型机器人的运动是预定的，并且被存储在存储器中并且被执行以使得所存储的运动被执行。运动控制系统可以包括手动模式，其中用户经由用户界面可以实时地控制微型机器人的运动。在实施方案中，自动控制操作模式可以具有比手动模式更高的精度。例如，自动控制模式可以包括控制算法，该控制算法使微型机器人以小于5μm的精度误差遵循期望的路径。通过在检测开始时进行初始最佳识别，可以使用所公开技术的运动控制系统来搜索在试样中的所有微型机器人中具有最高荧光的微型机器人，从而提高检测灵敏度。通过排除检测具有低初始荧光的微型机器人来提高灵敏度，在检测步骤中可以将其视为猝灭的微型机器人，其可能导致毒素的假阳性检测。

所公开技术的运动控制系统还可以在要求的时间内在测试样本中以预先设计的路径连续且自动地推进微型机器人。在实施方案中，预先设计的路径覆盖了用于在检测过程中检测荧光的成像设备的视场内的区域。将样品放入样品架后，检测过程是快速和自动的。此外，检测过程比标准的酶联免疫吸附测定(elisa)更快和更简单。例如，检测过程可以花费数十分钟，例如10-30分钟，而elisa花费多于两小时。不同于通过繁琐的温育和漂洗过程进行的elisa，本技术仅将微型机器人加入测试上清液中，然后使用检测系统来评价结果。

使用装备有官能化微型机器人的运动控制系统选择性检测靶分子(例如细菌毒素)的能力可以用于许多生物分析领域，例如包括食品安全、生物/化学威胁检测以及细菌感染疾病的早期诊断阶段。本发明的一个或多个实施方案的细节在附图和以下描述中说明。本发明的其他特征、目的和优点根据附图和详细描述以及权利要求书将是明显的。

附图简述

下面参照以下附图详细描述本发明的说明性方面。旨在将本文公开的实施方案和附图视为说明性的而非限制性的。各个附图中的类似参考符号和标记表示类似的元件。

图1是在配备有倒置荧光显微镜的运动控制系统中使用所公开的官能化微型机器人进行毒素检测的示意图。

图2示出了制备所公开的官能化微型机器人的流程。

图3示出了所公开的官能化微型机器人的形态和结构。

图4a和4b示出了在绿光激发(激发滤光片：537-552nm，发射滤光片：582-637nm)下所公开的官能化微型机器人的光学图像和荧光图像。

图5示出了所公开的官能化微型机器人在旋转磁场中运动和以不同倾斜角的相应运动模式的示意图。

图6示出了在5秒的时间帧内所公开的官能化微型机器人在去离子水(diw)、磷酸盐缓冲盐水(pbs)、细胞培养基(dmem)、胎牛血清(fbs)、和来自猪胃的粘液、来自猪肠的肠粘液(imucus)中的运动轨迹。

图7a和7b示出了所公开的官能化微型机器人的运动速度相对于频率以及速度相对于倾斜角的曲线。

图8示出了在手动操作中在6秒内在去离子水(diw)、磷酸盐缓冲盐水(pbs)、细胞培养基(dmem)、胎牛血清(fbs)、来自猪胃的粘液、来自猪肠的肠粘液(imucus)中运动的所公开的官能化微型机器人的荧光追踪轨迹，和在diw中以预设的o型、∞型和cu型路途经的荧光追踪轨迹。

图9示出了运动和静态的官能化微型机器人在来自培养的艰难梭菌细菌的不同上清液中的荧光延时图像。

图10示出了相应的变化曲线，其示出了不同样品在不同时间的荧光猝灭(由imagej程序计算的积分密度)。

图11a示出了在不同粪便样品中航行10分钟的运动和静态的官能化微型机器人的荧光猝灭。

图11b示出了在0.1c粪便样品中行进不同时间的运动和静态的官能化微型机器人的荧光猝灭。

图12示出了39秒的追踪，其示出了在开始时和在30分钟后所公开的官能化微型机器人在临床粪便上清液中的推进，以及在临床粪便上清液中官能化微型机器人随运动时间的速度变化。

图13示出了用于在实际样本中以不同操作模式检测细菌毒素的运动控制系统的示意图。

图14是用于推进所公开的官能化微型机器人的磁场发生器(例如自主开发的五通道电磁线圈系统)的实例的示意图。

图15是基于核心计算机和一系列设备的控制方案。

图16是自动识别的算法的示意图。

图17是自动控制的算法的示意图。

图18是用于自动控制所公开的微型机器人以进行检测的机动样品平台。

图19是用于在配备有倒置荧光显微镜的运动控制系统中使用所公开的官能化微型机器人自动检测毒素靶标的示例性方法的流程图。

图20示出了在手动操作模式下使用所公开的检测系统与倒置荧光显微镜的组合在pbs、正常粪便上清液、艰难梭菌感染患者的粪便上清液中的追踪荧光轨迹。

图21示出了在自动操作模式下使用所公开的检测系统与倒置荧光显微镜的组合在自动操作模式下所公开的官能化微型机器人在艰难梭菌感染患者的粪便上清液中的延时图像。

发明详述

通过参照形成本公开内容一部分的发明详述可以更容易地理解本发明。本发明不限于本文描述和/或示出的特定材料、设备、方法或系统。除非另外限定，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域中的普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然与本文中所述那些类似或等效的材料、设备、方法和系统可以用于实施或测试本发明，但是以下描述合适的方法和材料。本发明涉及两个方面：官能化微型机器人设备以及基于自动化荧光识别和检测方法的得到的检测系统。

例如，所公开技术的微型机器人能够以受控的方式运动并且提供例如包括作为生物标记的荧光追踪和流体中的靶分子的运动检测的能力。所公开的微米/纳米材料和工程改造的微结构也可以被称为磁性孢子、荧光磁性微型机器人、可操控的微型机器人和磁性微型机器。在实施方案中，所公开技术的微型机器人可以被配置为传感微型机器人或微型机器，其可以检测来自生物或非生物样本的靶分子的存在或不存在。

在本发明的实施方案中，生物混合官能化微型机器人可以在测试流体中在旋转磁场中被推进。磁性驱动的运动使得生物混合官能化微型机器人具有多种应用，包括货物运输、生物医学、环境修复、小物体操纵和基于运动的生物传感。例如，这些官能化微型机器人提供了基于随着“运动中”反应的荧光变化来检测样本中靶分子的存在的能力。

检测靶分子的存在的能力可以例如在早期筛查、诊断和监视细菌方面以及在理解细菌相关疾病的基础生物学方面具有意义。官能化微型机器人可以用于在体外检测静态或稳态流体中的细菌毒素，甚至细菌。

例如，所公开的包含配体分子(例如寡糖)的官能化微型机器人可以使得能够感测具有受体分子(例如重复性寡肽)的靶标细菌毒素，其中在配体分子和受体分子之间存在的高亲和力触发荧光猝灭。例如，寡糖官能化微型机器人可以基于荧光变化来感测靶标细菌毒素，所述荧光变化是附着的寡糖与艰难梭菌毒素的特定靶标寡肽的选择性结合能力所引起的。磁性推进机构可以使得以稳定速度连续运动。例如，所公开的官能化微型机器人可以被连续地磁性驱动以检测靶标艰难梭菌在测试流体例如静态复杂生物流体中的存在。由于“运动中化学”反应增强了扩散，所以这样的连续运动可以使得能够有效地检测临床粪便上清液中的毒素，例如艰难梭菌毒素。

执行示例性实施方案以证明所公开的官能化微型机器人技术的所描述的官能和能力。例如，寡糖官能化微型机器人的检测显示出对具有相应的重复性寡肽的靶标艰难梭菌毒素(毒素a和b)具有高度特异性。用针对细菌分泌的毒素上表达的寡肽区域的特异性配体对示例性微型机器人进行官能化。例如，可以将寡糖官能化碳点附着于示例性微型机器人的改性表面上，以形成寡糖官能化微型机器人。在示例性实施方案中，示例性的寡糖官能化微型机器人用于检测表达组合的重复性寡肽(crop)的艰难梭菌毒素。crop是由多个19-24个氨基酸短重复序列和31个氨基酸长重复序列构成的蛋白质，其是艰难梭菌产生的毒素(tcda和tcdb)的特征。例如，crop通常被认为是艰难梭菌毒素的c末端受体结合结构域，靶向细胞上的碳水化合物。

如图1所示，官能化微型机器人110可以使用运动控制系统120通过磁场发生器可控制地在流体中运动。这样的运动可以通过其荧光在暗场下进行追踪。基于使用成像设备(诸如倒置荧光显微镜或多重读取器)观察荧光猝灭，官能化微型机器人可以选择性地且快速地检测靶标毒素的存在。例如，当在流体(例如细菌培养基)中遇到靶标艰难梭菌毒素时，寡糖修饰的微型机器人可以被含有重复性寡肽的艰难梭菌毒素猝灭。由重复性寡肽与寡糖和相应官能团的结合引起的荧光变化可以使寡糖修饰的微型机器人以预先选择的路径进行选择性艰难梭菌毒素检测。在不添加靶分子的情况下，官能化微型机器人也可以在流体中展现出不变的荧光。

可以进行在芯(例如天然孢子)上逐步沉积的制造，以生产官能化微型机器人。可以通过以下方法制备官能化微型机器人：首先将磁性涂层沉积到预处理的生物模板上，接下来用自组装单层官能化，最后用官能化荧光探针封装。如本文所使用的，术语层和涂层是指在主体或另一个层或涂层的表面的至少一部分上具有一定厚度和一定面积的一个或多个体积的物质。磁性涂层可以使得微型机器人能够驱动和航行。自组装单层的进一步官能化可以进一步附着检测探针或其他结构。如图2所示，给出了用于制造所公开技术的微型机器人的示例性逐步沉积技术的示意图。示例性的制造技术包括三个步骤，例如，将fe3o4纳米颗粒沉积到灵芝(g.lucidum)孢子模板上，用巯基化自组装单层修饰沉积的fe3o4，以及与寡糖官能化荧光碳点缀合。示意图210示出了磁性纳米颗粒在天然孢子芯上的沉积的实例。在实施方案中，芯可以是合成的。在实施方案中，磁性纳米颗粒可以具有20-80nm之间的最大宽度。在一些实例中，磁性fe3o4纳米颗粒可以沉积在植物或真菌的孢子上。在实施方案中，沉积的纳米颗粒在芯表面上形成涂层。示意图220示出了磁性纳米颗粒的用于进一步缀合的示例性修饰，例如使用3-巯基丙酸(mpa)以形成连接层。示意图230示出了通过edc/nhs化学的锚定检测探针的示例，例如与寡糖官能化荧光碳点缀合。可以实施所公开的沉积技术以生产磁性推进的官能化微型机器人。每个组件的结构、尺寸和官能性可以被配置为设计所公开的官能化微型机器人的各种性能参数，包括磁特性、光学性质、靶向检测能力和比表面积。性能参数的实例包括磁特性(强度)、光学性质(荧光或磷光)、靶向检测能力(特异性荧光开启或关闭)和比表面积。在实施方案中，微型机器人的饱和磁化强度为约40emu/g，这有利于磁场中的推进。在实施方案中，由于天然孢子的差异，孢子的尺寸范围可以为5μm至20μm。在实施方案中，磁性涂层可以具有50nm至200nm的厚度。在实施方案中，磁性涂层的厚度可以取决于沉积时间的持续时间。在实施方案中，磁性纳米颗粒的尺寸在长轴上可以为20nm至80nm，例如如图3所示。在实施方案中，传感探针的尺寸为约1-10nm。传感探针相对于芯和磁性涂层是极小的，并且因此传感探针涂层的厚度可以被认为是可忽略不计的。

在实施方案中，各种类型的天然孢子可以用作孢子芯。此外，在实施方案中，可以使用合成芯。可以应用所公开的沉积或封装技术以获得具有各种结构和尺寸的微型机器人。例如，可以使用石松(lycopodium)孢子或灵芝孢子。其他实例可以包括并入(例如沉积)中间磁性层，例如镍或铁或其氧化物纳米颗粒。其他示例性设计考虑因素可以包括具有不同靶向官能性的检测探针层。例如，用papa或相关官能团封装微型机器人的示例性实施方案可以实现针对细菌内毒素的靶向。具有三层结构的微型机器人的示例性设计可以使多孔芯具有多官能性，从而使微型机器人检测流体中的靶分子。

下面描述用于官能化微型机器人的制造方法的实例。如本文所述，根据本技术，可以使用其他步骤和/或材料来制造微型机器人。示例性制造方法包括以寡糖官能化的基于灵芝孢子的微型机器人为例。第一，首先对灵芝孢子进行预处理，通过顺序地在200ml无水乙醇中超声处理30分钟、在200ml去离子水中超声处理10分钟和用diw洗涤数次来移除外膜和内芯物质上的杂质，以进行冷冻干燥。然后，在超声处理的辅助下将孢子分散到60ml去离子水中，并且搅拌例如5分钟，以形成分散在去离子水中的孢子的褐色悬浮液。将feso4加入上述悬浮液中，然后搅拌例如20分钟。通过在10分钟内滴入20ml氨水(25％-27重量％)，随后密封并且进一步搅拌2小时，可以用磁铁收集褐黑色的孢子@fe3o4沉淀。收集的沉淀可以用乙醇和去离子水洗涤数次，并且冷冻干燥。在进行冷冻干燥以移除水分后，可以将褐黑色样品分散到200ml乙醇中，并且搅拌10分钟以形成均匀悬浮液，随后加入0.2mmol的3-巯基丙酸(mpa)。可以将混合悬浮液搅拌10分钟，并且在室温停留24小时。在使用磁铁收集之后，可以用乙醇洗涤羧基官能化的磁性孢子(例如3次)，以移除残余的mpa，然后冷冻干燥用于下一步制备。在进行冷冻干燥以移除乙醇含量后，可以将50mg的官能化磁性孢子分散到60ml去离子水中。然后，可以加入0.5mmoledc和0.5mmolnhs并且搅拌2小时以活化样品上的羧基。在通过0.16g天冬氨酸的温和水热处理获得的官能化荧光碳点后，将0.16g葡萄糖和0.16g对苯二胺加入混合悬浮液中，并且在温和搅拌下在室温反应24小时。通过使用edc/nhs偶联化学获得寡糖官能化的基于灵芝孢子的微型机器人，并且用磁铁收集，用乙醇和去离子水洗涤数次，并且冷冻干燥用以进一步使用。此处描述的示例性详细制造也可以扩展于并且适用于其他官能化微型机器人的制备(例如papa、适体等)。

制备的官能化微型机器人(例如，寡糖官能化微型机器人或其他附着的配体修饰的微型机器人)是在流体中被磁性推进的设备。例如，图3示出了官能化微型机器人的示例性sem图像，所述官能化微型机器人由灵芝孢子、fe3o4纳米颗粒和寡糖官能化荧光碳点构成。如图3a所示，液滴样形状的微结构具有约6-10μm的平均尺寸。如本文所使用的，术语“约”是指在指定值或值范围之上和之下的10％。在实施方案中，芯(天然存在的芯或合成芯)限定了直径为约100-400nm的孔。孔分布在芯的表面上。图3b示出了涂覆在微结构的表面上的数十纳米的纳米颗粒层，包括铁氧化物和碳点。图3c中的破裂结构示出了空腔和具有0.5-1μm的间隙的双层壁。这样的由保留的孔与组装的纳米颗粒一起构成的结构导致具有宽孔径的约12.96m²/g的高比表面积，从而提供了更多的用于吸附和反应的活性位点。

可以使用例如光场观察和追踪官能化微结构。光场发射与官能化微型机器人的激发波长相对应的激发束。例如，如图4所示，由于官能化微型机器人的红色荧光发射，可以在荧光倒置显微镜中使用绿光激发(激发滤光片：537-552nm)。也可以在磁场发生器中推进官能化微结构。例如，约10mt的旋转磁场可以用于在常规流体例如水或盐水中以约10emu/g的磁化强度推进微型机器人。在实施方案中，可以使用较高强度的磁场，然而由于长时间使用时线圈内部的焦耳热，较高强度的磁场可能影响测试介质的运动。在实施方案中，旋转磁场的控制器可以基于观察的微型机器人的运动/速度来确定磁场的强度。例如，如果例如由于流体的高粘度而确定微型机器人以低于期望的速度运动，则磁场的强度或频率可以自动增加，直到检测到的微型机器人的速度达到期望的速度。在实施方案中，速度的范围可以为2.0μm/s至40μm/s，并且可以对应于流体的粘度，例如，对于粘度较高的流体(诸如粘液)，速度可以在速度范围的低端，并且对于粘度较低的流体(诸如去离子水)，速度可以在所述范围的高端。在实施方案中，用于检测荧光的优选速度在5.5μm/s至16.9μm/s的范围内。

在实施方案中，磁场发生器的强度可以从0mt调节到30mt。磁场强度越高，推进越有效。然而，磁场的高强度受到微型机器人和线圈之间的距离以及通过线圈的电流(产生更大焦耳热)的限制。在实施方案中，微型机器人可以被配置成通过增加微型机器人的磁化强度而在粘度较高的流体或在较弱的磁场中使用。在实施方案中，旋转磁场以约4hz运行。

在实施方案中，如图5所示，微型机器人可以具有三种运动模式(自旋、旋转-平移和翻转)的由磁场引起的运动。此外，可以在各种流体(例如范围从不同的生物流体到临床上清液)中保持有效的磁性推进。例如，在去离子水(diw)、磷酸盐缓冲盐水(pbs)、细胞培养基(dmem)、胎牛血清(fbs)、胃粘液和肠粘液(imucus)中航行的基于灵芝孢子的官能化微型机器人的5秒追踪轨迹显示出优异的游动性能。此外，diw、pbs和细胞培养基dmem中的运动速度随着例如0hz至15hz的频率增加而增加。如图7a所示，fbs、间质粘液和粘液中的运动速度随着频率增加首先增加然后减小，在7至9hz之间具有最大运动速度。当以翻滚运动模式(图7b中的90°倾斜角)运动时，在所有介质中都可以达到最高速度，具有长运动位移，如图5所示。可以通过延长沉积时间(例如，2小时的初始沉积时间的12倍)来增加磁性层的厚度，以促进在高粘度的生物介质中的更有效的推进和航行。在引入官能化荧光碳点后，基于孢子的微型机器人也显示出良好的荧光响应以进行检测。例如，荧光可以随着基于孢子的微型机器人在10分钟内的运动而迅速衰减。进一步例如，在图8中给出了在diw、pbs、dmem、fbs、胃粘液和肠粘液(imucus)中航行的寡糖官能化的基于灵芝孢子的微型机器人的6秒荧光追踪轨迹。这样的微型机器人的鲜红色发射几乎不随着运动、时间延长和介质变化而减弱，表明具有良好的动态荧光稳定性。这些结果表明，即使在不同介质中运动，寡糖官能化的基于灵芝孢子的微型机器人也显示出良好的红色荧光发射。此外，官能化微型机器人的荧光特征与磁性层一起使得能够在暗场下以预先设计的路线进行磁性遥控、引导和追踪。在实施方案中，路径是在尺寸为300μm×300μm的显微镜视野中分布的点的阵列。在实施方案中，寡糖官能化的基于灵芝孢子的微型机器人可以实现预定轨迹的自动荧光运动。如图8所示，预定轨迹可以包括诸如“o”(圆形)或“∞”(8字形)的几何平面形状，并且可以包括具有直线和/或曲线轨迹的组合的复杂形状，例如cu轨迹。预定轨迹可以展示出具有高度受控精度的完美路径。在图中，每个路径中较大/较亮的荧光点代表大多数微型机器人的当前位置。线代表微型机器人扫过的路径，或者换言之，线代表微型机器人的运动轨迹。在实施方案中，轨迹的追踪误差小于微型机器人的体长的一半，并且因此具有约5μm的精度。

鉴于优异的磁性推进能力和荧光响应能力，例如基于官能化微型机器人的选择性和特异性结合能力，已经将官能化微型机器人用于检测毒素。微型机器人可以用碳点封装，所示碳点用靶向配体(例如寡糖或其特异性基团)官能化，用于高度特异性的毒素识别。微型机器人可以提供足够的推进力，用于有效地检测流体(例如生物样品和复杂的临床粪便上清液流体)中的靶分子。微型机器人可以使用简单预处理(包括稀释和离心)的流体样品和短检测时间(例如，简单溶解测试样本和收集上清液以及在数十分钟内的快速识别)来选择性地检测细菌毒素。所公开技术还可以检测或感测其他靶分子，例如毒素、化学威胁或生物分子。例如，寡糖官能化的基于灵芝孢子的微型机器人可以检测生物样品中的艰难梭菌释放的毒素。图9示出了在含有一定浓度的细菌毒素的上清液中磁性驱动的这样的微型机器人的延时图像。在被艰难梭菌毒素污染的溶液中航行10分钟的寡糖官能化的基于灵芝孢子的微型机器人显示出瞬时的荧光猝灭，而在被fuso毒素污染的溶液中磁性航行的所述微型机器人并未展现出明显的荧光猝灭。甚至在pbs和bhi溶液中磁性推进10分钟的微型机器人也未展现出荧光衰退。微型机器人的相应检测能力可以受到各种因素的影响，例如运动模式、运动持续时间和浓度。例如，与运动的微型机器人相比，在具有相同浓度的艰难梭菌毒素的溶液中，静态的官能化微型机器人不会随着时间推移而显示出任何荧光猝灭。即使在上述对照溶液中停留20分钟后，由积分密度计算的荧光仍保持基本稳定。这不仅说明了试样中其他溶质的可忽略不计的干扰作用，而且还表明由于加速的多个“即时(on-the-fly)”反应和增强的流体混合，主动运动显示出比被动操作更高的检测效率。例如，如图10所示，随着毒素浓度的增加，荧光猝灭迅速出现。寡糖官能化微型机器人的荧光猝灭的初始程度与毒素浓度直接相关，随着浓度的增加呈指数衰减。进行了其他示例性实施方案，其进一步证明了在实际应用中官能化微型机器人对靶标细菌毒素的检测能力。例如，示例性实施方案涉及观察临床粪便上清液中寡糖官能化微型机器人的荧光变化，其用于检测艰难梭菌毒素。图11a和11b示出了在不同时间和在各种粪便样品中航行的运动和静态的寡糖官能化微型机器人的荧光猝灭的变化图(通过imagej程序计算的积分密度)。即使在各种毒素浓度下航行任意时间，运动的寡糖官能化微型机器人(灰色柱)的荧光强度在正常粪便样品中也保持基本稳定。停留10分钟或在0.866ng/ml传染性粪便样本中的静态寡糖官能化微型机器人(青色柱)展现出不明显的荧光猝灭，直到浓度更高(>0.2c，c＝8.66ng/ml)或航行更长时间(>20分钟)。荧光猝灭的程度与静态或动态模式下的毒素浓度成正比，这符合stern-volmer方程。示例性的运动微型机器人可以通过灵敏的荧光猝灭有效地检测传染性粪便样品中的毒素。所公开的微型机器人还在临床样本例如临床粪便上清液中显示出稳定的连续运动。例如，如

图12所示，寡糖官能化微型机器人甚至可以通过在各种浓度的真实粪便上清液中长期运动而连续运动，并且保持稳定的速度。这些表明了微型机器人在临床样品中的抗污染能力和有效运动。

所公开的微型机器人包括自动检测特性，该特性使得能够在流体中进行连续动态检测，所述流体包括粘性流体，例如细菌培养基和临床粪便上清液。所公开的微型机器人可以例如通过控制配体分子而具有不同的靶向能力，该配体分子可以用于检测试样中的其他靶分子或检测多个靶分子。所公开的微型机器人可以在旋转磁场中使用，其可以在一定时间间隔内在自动和连续运动下快速识别临床预处理样品(例如粪便)中毒素(例如艰难梭菌毒素)的存在。

在本技术的另一个方面，公开了基于官能化微型机器人和自动化荧光识别和检测构思的用于靶分子(例如流体中的细菌毒素)的检测系统。所公开的系统包含官能化微型机器人和运动控制系统，该官能化微型机器人在连续运动下产生对外部刺激的传感响应，该运动控制系统施加推进力和导航从而以手动和自动模式控制官能化微型机器人。运动控制系统由磁场发生器、控制器箱和机动样品平台组成。磁场发生器提供旋转磁场以实现微型机器人在试样内的驱动运动。磁场发生器可以包括电磁线圈系统和/或旋转磁铁。此外，在实施方案中，可以使用其他系统来产生旋转磁场，例如，商用minimag和自主开发的magdisk。控制箱包括处理器、存储器和一系列芯片卡，以将执行命令递送至发生器。配备机动样品平台用于自动操作模式下的初始优化识别和后续检测。运动控制系统与成像设备耦合。成像设备可以包括例如倒置荧光显微镜或荧光多重读取器，用于观察荧光响应和评价检测结果。通过观察结果的反馈，可以通过基于优化识别和自动检测算法的整个环形系统来实现全自动检测。该系统可以直接应用于检测靶分子的存在。

运动控制系统的实例将在附图中公开，并且在下面进行详细描述。

图13是示出了用于检测目标分子的存在的运动控制系统的示意图。运动控制系统由用于磁性推进的官能化微型机器人的磁场发生器1310和用于操控其运动的控制器箱1320构成。在实施方案中，控制器箱(也称为控制器)包含放大器和电源，该放大器和电源向线圈提供持续电流，从而产生操控微型机器人的磁场。控制器箱将信号发送到磁场发生器和运动控制器，以同时操控微型机器人。磁场发生器可以产生旋转磁场。各种电磁线圈系统都可以直接用作磁场发生器。例如，如图14所示，包括外部线圈1410和四个相同平面线圈1420的小盒样5通道装置在下面也称为magdisk。两对平面线圈正交布置以形成具有x轴和y轴磁场矢量的磁场。围绕它们的外部线圈负责z轴的磁矢量。平面线圈中使用的软磁铁芯将增加可达到的最大场强。所得的magdisk可以产生旋转、振荡和梯度磁场，其可以以5dof(3r+2t)实现磁性微型机器人的运动控制，其定位精度达到亚细胞水平。

控制器箱1320包括硬件系统和软件系统。硬件包括执行来自软件的指令集的一系列控制器硬件1321和配备有用于安装软件的传感器卡的计算机1322。用户可以通过用户界面(例如显示器、键盘和鼠标)来修改所需磁场的参数(方向角、倾斜角、频率和场强)。在实施方案中，方向角、倾斜角、频率和场强是可修改的，以控制微型机器人的运动方向和速度。例如，magdisk的硬件系统由5个伺服放大器、2个电源(36v，9.7a)和1个数模转换器(dac)组成。放大器用于将传感器卡产生的电压信号转换为用于磁场发生器的电流信号。例如，magdisk中使用的伺服放大器是maxonmotor409510，其可以提供5a的连续电流和15a的峰值电流，并且负责1个电磁线圈，使得每个线圈中的电流可以独立控制。dac用作门路(gateway)，以将来自传感器卡的数字信号转换为模拟信号并且将它们递送至放大器。传感器卡通常配备在装有磁场控制程序的计算机中。例如，在magdisk的硬件中使用sensoray卡826以按照来自自主开发的基于labview的磁场控制程序的指令生成电压信号。

软件系统包括控制方案和相关执行程序。图15给出了基于核心计算机和一系列硬件的控制方案。计算机将磁场命令发送到控制器箱，其将驱动电流递送至磁场发生器(例如magdisk)。同时，计算机还向两个自由度的样品台的执行器发送位置和速度命令，其将执行驱动信号以使性能最佳的微型机器人运动到最大强度的磁场发生器区域。磁场发生器将按照程序施加预期的磁场来推进微型机器人。微型机器人的运动状态可以通过配备有荧光照相机的倒置荧光显微镜观察，其将通过一系列荧光图像反馈到计算机，最终确定所递送的命令的执行结果。在实施方案中，安装在显微镜上的成像传感器(例如照相机)捕获显微镜的当前图像，然后将其传输到计算机。该过程通过图像将微型机器人运动状态反馈至计算机。然后，可以使用图像处理来提取运动控制器中使用的微型机器人的当前位置。成像反馈用于两个方面。首先，成像反馈用于评价用于荧光观察和初始优化识别的最佳微型机器人。其次，成像反馈用于控制磁场发生器用以追踪轨迹。

相关的执行程序包括两个方面。一个方面是如图16所示的基于自动识别程序的算法。通过减去平均背景来获得和评价官能化微型机器人的荧光强度。确定测试样本中的微型机器人的子集为有效的微型机器人。有效的微型机器人是初始荧光强度高于预定阈值的微型机器人。在用磁场推进微型机器人之前，可以测量试样中微型机器人的初始荧光。

第二个方面是基于如图17所示的算法的用于自动化的自动追踪程序。微型机器人的期望轨迹(也称为参考轨迹)可以取决于代表期望位置和速度的qd(t)和dot(qd(t))函数。这些函数可以由控制器发送并且以以下形式执行。

其中ki(i＝1、2)是通过离散时间仿真以实际控制频率调整的正控制增益，并且sat(a,b)是饱和函数，其定义为：

同时，扩张状态观察器(eso)向真实运动状态提供反馈，用于校准控制运动，其符合以下等式。eso不仅估算了微型机器人的运动状态，还评估了广义干扰以进行补偿。最终轨迹追踪的精度为约3微米。

机动样本平台1323连接到运动控制系统，用于初始最佳识别和随后的自动检测。如图18所示，机动样品平台包括支架(1810)和附带有控制器和电源的两个机动平移台(1820)。两个平移台正交且重叠放置，其可以分别提供x轴和y轴运动，这可以通过手动或自动操作实现。这样的布置将通过控制器系统以手动或自动模式实现官能化微型机器人的xy平面运动。

当上述公开的部件集成在一起时，所形成的整个系统可以利用倒置荧光显微镜或荧光多重读取器检测细菌毒素在实际样本中的存在。例如，图18给出了用于使用配备有倒置荧光显微镜的检测系统检测临床粪便样品中的艰难梭菌毒素靶标的示例性方法的流程图。首先，进行寡糖官能化微型机器人的制备(1910)。粪便样品的预处理包括将它们溶解或/和稀释(1920)。接下来，在倒置荧光显微镜上在绿光激发下激发官能化微型机器人(1930)。首先使用自动识别程序来搜索测试样本中荧光高于预定阈值的最佳荧光微型机器人(1940)。之后，使用自动控制方案来控制检测到的微型机器人以追踪设计轨迹(1950)。自动识别算法每秒钟重新运行一次，并且记录每分钟内成功检测的次数(1960)。最后，通过在加入试样时观察微机器人在一定时间间隔内的荧光猝灭并且算出在一定时间间隔内第一分钟至最后一分钟的成功检测次数的减少，可以检测试样(例如预处理的粪便上清液)中靶分子(例如艰难梭菌毒素)的存在(1970)。检测测试样本中靶标毒素的存在可以包括基于由微型机器人的运动引起的荧光猝灭来检测靶标毒素的浓度。基于荧光猝灭来检测测试流体中靶标毒素的存在可以包括提供具有荧光传感探针的官能化微型机器人，以允许微型机器人在传感探针和靶标毒素之间形成复合物。根据所公开的检测过程，检测系统以及相关的识别和检测方法可以用于感测各种流体甚至临床样品中的细菌毒素。例如，图20示例性地示出了在手动操作模式下使用所公开的检测系统与倒置荧光显微镜的组合在pbs和正常粪便上清液中的追踪荧光轨迹。例如，可以在连续运动约20分钟的情况下清晰地追踪寡糖官能化微型机器人的运动轨迹。在寡糖官能化微型机器人上未观察到荧光猝灭，这表明pbs和正常粪便上清液中不存在艰难梭菌毒素。当测试感染艰难梭菌的患者的粪便上清液时，图20示出了使用相同模式的荧光追踪轨迹。寡糖官能化微型机器人的运动轨迹急剧减少，连续运动约20分钟时几乎无法追踪。此外，长时间运动后观察到明显的荧光猝灭，表明感染艰难梭菌的患者的粪便上清液中存在艰难梭菌毒素。因此，检测系统可以在手动模式下快速地且选择性地从复杂样品中检测毒素。这样的检测能力可以通过按照预先设计的路径自动化运动以及使用观察相机进行实时记录来完成，从而大大减少了人力。例如，图21给出了使用所公开的检测系统结合倒置荧光显微镜和照相机，感染艰难梭菌的患者的粪便上清液中的自动追踪荧光轨迹。随着时间的推移，在感染艰难梭菌的患者的粪便上清液中可以观察到寡糖官能化微型机器人的明显荧光猝灭，展现出检测系统的良好和快速的感测能力。