一种测定饲料中β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯着色剂含量的方法与流程

本发明涉及一种测定饲料中β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯着色剂含量的方法，属于β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯着色剂含量检测技术领域。

背景技术：

我国《中华人民共和国农业部公告》第2625号中明确规定配合饲料中β-阿朴-8＇-β,β-胡萝卜素-4,4-二酮(斑蝥黄)的最高限量为80mg/kg。目前我国对饲料中β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯着色剂检测尚无国家标准和行业标准方法，造成饲料中着色剂的检测空白，增加了饲料产品质量安全风险和监管的不利。特别是在肉禽、蛋禽养殖过程中，养殖户和企业为了迎合消费者心理，追求外观色泽漂亮，肉鸡膘黄、脚黑，鸡蛋心红、亮，添加着色剂来改变色泽充当土鸡、土鸡蛋来追求高回报已为常态。着色剂在禽肉、禽蛋中大量蓄积、残留，增加了消费者的健康危害风险。

β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯又叫阿朴胡萝卜素酸乙酯或阿朴酯，是类胡萝卜素中一种含氧的阿朴胡萝卜素类化合物。在食品工业中主要应用于食用油、人造奶油、果酱、果冻及饮品类产品的着色。目前在对饲料中β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯着色剂的检测中，由于样品中脂类和蛋白对结果的干扰，以及β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯着色剂本身不稳定的因素，使得饲料中β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯着色剂检测存在准确性差、灵敏度低、分析速度慢等问题。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是：提供一种灵敏度高、准确性好、分析速度快的测定饲料中β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯着色剂含量的方法，通过合理的样品提取和净化条件，以解决现有技术存在的样品中脂类和蛋白对检测结果的干扰，以及待测物β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯着色剂不稳定的问题。

本发明的技术方案是：一种测定饲料中β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯着色剂含量的方法，包括：

(1)预处理

称取待测饲料样品，加入水、饱和氯化钠、0.05％乙酸溶液、混合提取液涡旋混合后离心，吸取上层萃取液；

用混合提取液重复萃取，所述混合提取液为甲醇：乙酸乙酯：正己烷的混合溶液；

合并萃取液，加入无水乙醇，混匀；在氮气下吹干；

用甲基叔丁基醚+乙腈溶液溶解残渣，过滤得供试样品溶液；

(2)液相色谱仪分析

将所述供试样品溶液上液相色谱仪进行分析，测定β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯着色剂的峰面积；

(3)计算饲料中β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯着色剂的含量

利用多组已知质量浓度的β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯溶液测定β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯峰面积，以β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯质量浓度为横坐标，相应峰面积为纵坐标进行线性回归，建立β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯线性回归方程；

根据前述待测饲料样品的β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯峰面积，利用β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯线性回归方程计算待测饲料中β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯着色剂的质量浓度，再计算待测饲料中β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯着色剂的含量。

优选的，所述β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯线性回归方程为：

y＝37985x-8487.3

式中：y为β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯峰面积，x为待测饲料中β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯着色剂的质量浓度。

优选的，饲料中β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯着色剂含量的计算公式为：

式中，w为待测饲料中β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯着色剂的含量，x为待测供试样品中β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯着色剂的质量浓度，v为溶解残余物的甲基叔丁基醚+乙腈溶液的体积，m为饲料样品的质量。

优选的，所述甲基叔丁基醚：乙腈溶液中甲基叔丁基醚：乙腈的体积比例为1：9。

优选的，所述混合提取液中甲醇：乙酸乙酯：正己烷的体积比例为1：1：1。

优选的，饲料中β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯着色剂含量的检测范围为0.2～50mg/kg。

本发明的有益效果是：本发明方法以《饲料添加剂安全使用规范》中着色剂项下的着色剂β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯为研究对象，待测饲料样品在水、饱和氯化钠、0.05％乙酸溶液混合下，溶解包裹在β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯表面的淀粉，再用甲醇+乙酸乙酯+正己烷混合提取液液液萃取，上层溶液浓缩复溶后，超高效液相色谱法测定，结果表明方法具有简单、快速、准确、灵敏的特点，适用于饲料中β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯着色剂含量检测分析。

本发明有利于饲料中β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯着色剂含量检测标准的建立提供大量的基础数据，逐步完善对饲料质量安全风险监测依据，对β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯使用进行质量安全性进行评，掌握β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯在饲料生产中的损耗，指导饲料企业、养殖场科学合理的使用着色剂，即确保不发生重大家禽畜产品质量安全事件，又在满足消费者色泽需求的情况下，降低生产成本。

附图说明

图1为β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯标准样品液相色谱图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

实施例1：饲料中β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯着色剂含量的测定方法，

测定饲料中β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯着色剂含量的方法包括以下内容：

1、预处理

称取预混合饲料0.5g，浓缩饲料1.0g，配合试样2.0g(精确到到0.01g)于50ml离心管中，分别加入水4.0ml,饱和氯化钠溶液2.0ml，0.05％乙酸溶液(4.0ml,摇匀，加入甲醇+乙酸乙酯+正己烷(体积比例1：1：1)混合提取液10.0ml，涡旋2min，5000r/min离心5分钟，用滴管吸取上层溶液于另一个离心管。

再次加入10.0ml甲醇+乙酸乙酯+正己烷(体积比例1：1：1)混合提取液重复提取2次；合并3次上层溶液于同一离心管中，加入2.0ml无水乙醇，混匀。

于40℃氮气下吹干，用甲基叔丁基醚+乙腈(体积比例1：9)溶液5.0ml溶解残渣，过0.22μm微孔滤膜，得供试样品溶液备用。

2、液相色谱仪分析

将供试样品溶液上液相色谱仪进行分析，测定得到β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯峰面积。

3、计算饲料中β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯色素的残留量

利用多组已知质量浓度的β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯溶液测定β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯峰面积，以β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯质量浓度为横坐标，相应峰面积为纵坐标进行线性回归，建立β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯线性回归方程。

β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯线性回归方程的具体建立方法为：

(1)制备标准溶液

将β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯置于棕色容量瓶中，加入0.1g焦性没食子酸增加稳定性，用三氯甲烷溶解定容，摇匀，配置成浓度为500μg/ml的储备液，置于-20℃冰箱中保存。有效期为3个月。

(2)制备各种质量浓度的测试溶液

取适量β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯储备液，用甲基叔丁基醚+乙腈(两者体积比例1：9)溶液稀释成浓度1.25、2.5、5.0、10.0、20.0μg/ml的β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯测试溶液。

(3)进样分析

用超高效液相色谱仪对前述已知质量浓度的多组测试溶液进行测试，检测结果如图1所示，计算相应的β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯峰面积(见表1)。

表1不同质量浓度的β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯对应的峰面积

线性考察以各组分质量浓度(c)为横坐标,相应峰面积(a)为纵坐标，进行线性回归。β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯回归方程y＝37985x-8487.3，r²＝0.99984，可知β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯在1.25～20.0μg/ml范围内线性关系良好。

根据前述待测饲料样品的β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯峰面积，利用β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯线性回归方程计算待测饲料中β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯着色剂的质量浓度，再计算待测饲料中β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯着色剂的含量(结果见表2)。

饲料中β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯着色剂含量的计算公式为：

式中，w为待测饲料中β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯着色剂的含量，x为待测供试样品中β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯着色剂的质量浓度，v为溶解残余物的甲基叔丁基醚+乙腈溶液的体积，m为饲料样品的质量。

表2饲料样品测定结果

注：“/”表示低于检出限，未检出。

实施例2：重复性、准确度、灵敏度验证

(1)重复性验证

取一供试样品溶液，重复进样6次，测定β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯的峰面积，计算得出β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯峰面积的rsd(相对标准偏差)为0.4％。可知采用本发明方法的重复性较好。

(2)准确度验证

在饲料空白样品中添加β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯，制成β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯添加量为2.5μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg、40μg/kg的阳性添加样，每个添加量平行制备3份，按实施例1中预处理方法制备供试品溶液，上机测定，每个样品测定1次。测定结果见表3。

表3β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯回收率测定结果

由表1可知，β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯回收率为72.0％～82.7％，由低到高添加量的平均回收率依次为82.7％、72.4％、72.0％、72.6％、74.4％，由低到高添加量的rsd(相对标准偏差)依次为0.2％、0.3％、0.6％、0.6％、0.2％。根据前述数据，可以得出采用本发明方法的回收率(准确度)较好，方法达到了严格的定量准确性和重复性。

(3)灵敏度验证

在饲料空白样品中添加斑蝥黄，测定检测限，依据色谱峰信噪比s/n>3为方法检测限。该方法饲料中β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯的检测限为0.2mg/kg，可知本发明方法的灵敏度较好。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。