本发明涉一种土壤中五氯苯酚(pcp)标准样品及其制备方法，属于环境检测领域。
背景技术：
五氯酚钠是一种广谱杀虫剂，在我国广泛用于杀灭钉螺，但对鱼类、贝类等水产品有剧毒。五氯酚钠在酸性条件下可转化为五氯苯酚(pcp)。研究表明，五氯苯酚(pcp)作为一种环境荷尔蒙，对人体有毒副作用，可造成中枢神经系统、肝、肾损伤及内分泌乱。美国环境保护署(epa)已经将五氯苯酚(pcp)列为可疑致癌物质并限制使用。我国农业部农牧发下文通知，禁止在水生食品动物生产中使用五氯酚钠。然而近年来发现在虾蟹养殖中仍有非法使用此类药物。五氯苯酚也曾作为除草剂、防腐剂和防虫剂而大量使用，近年虽已禁止生产和使用，但环境中仍有一定残留，其环境毒性效应仍然长期存在。
现在，土壤中的五氯苯酚污染问题已引起相当的重视，因此对土壤中的五氯苯酚检测和治理具有重要意义。但是目前土壤中的五氯苯酚(pcp)却没有较好的检测方法及相关的标准，一个重要原因是土壤中五氯苯酚(pcp)标准样品的制备没有解决。本发明研究的一种土壤中五氯苯酚(pcp)标准样品用以检测土壤中的五氯苯酚，在控制环境安全，乃至食品安全中具有重要的化学和环境学意义。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种土壤中五氯苯酚(pcp)标准样品及其制备方法。本发明将一定比例的腐殖质与土样混合后浸泡在乙醇介质中，同时将五氯苯酚溶解于乙醇后与土样混合浸泡，使得五氯苯酚在土壤渗透性好，有助于五氯苯酚(pcp)均匀分布在土壤中。本发明首次制备了土壤中五氯苯酚标准样品，可用于实验室间土壤中五氯苯酚(pcp)检测数据的比对、检测方法的准确性验证、检测仪器的校准及测试结果的质量控制和考核等。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现：一种土壤中五氯苯酚(pcp)标准样品的制备方法，其特征是，包括以下步骤：
(1)空白土样的制备：
a、腐殖质制备：取植物落叶喷洒腐熟剂及水分，充分混合后置于恒温恒湿箱中进行腐熟，腐熟后烘干、磨粉、过0.1-0.5mm筛后备用；
b、空白土样制备：将从环境中采集的土壤除去2mm以上杂物(砂砾和植物残体)，风干碾碎后过0.1-0.5mm筛后备用，得到空白土壤；然后与a步骤的腐殖质按重量比4-6:1复配后得到空白土样，备用；
(2)五氯苯酚的乙醇标准溶液制备：将五氯苯酚(纯品)用乙醇溶解，制备五氯苯酚的乙醇标准溶液；
(3)标准样品制备：准确称取经步骤(1)制备好的空白土样放入真空搅拌机中，再分别准确量取五氯苯酚的乙醇标准溶液和乙醇加入到含土样的真空干燥机中，经充分浸泡30-60min后，开启搅拌器和加热器，搅拌转速设置在100-150r/min，温度设置在40-100℃，一边升温一边搅拌混合直至物料半干状态后，降低搅拌转速至90-110r/min，待物料干至粉末状态时，将搅拌转速降至30-70r/min，搅拌20-50min后通入60-70℃热氮气，在热氮气的保护下继续搅拌20-60min，充分干燥后分装在密封玻璃瓶中即可制得土壤中五氯苯酚(pcp)标准样品。
优选的，步骤(1)中采用0.25目筛。
优选的，步骤(1)中恒温恒湿箱中温度55℃、湿度85％，堆积时间为10-30天后腐熟。
优选的，步骤(1)腐殖质与空白土壤混合的重量比例为1:5。
优选的，步骤(2)中五氯苯酚的乙醇溶液浓度为1mg/ml-10000mg/ml。
优选的，步骤(3)中空白土样与乙醇的重量体积比为1:1.2-2.5，乙醇为色谱纯。
优选的，步骤(3)中真空干燥机的加热温度为40-80℃，搅拌转速随工序推进而改变，具体为开始时搅拌转速设置在130-150r/min，物料半干状态后，降低搅拌转速至90-110r/min，物料干至粉末状态时，将搅拌转速降至40-60r/min。
优选的，步骤(3)充分干燥后分装前，采用co60辐照灭活。
优选的，步骤(3)土壤中五氯苯酚(pcp)标准样品的五氯苯酚含量0.1-100mg/kg。
除非另有说明，本发明所采用的百分数均为重量百分数。
上述制备方法得到的标准样品与日常检测过程中的样品的基材组分接近，降低基体效应，该标准样品的使用有利于提高土壤中五氯苯酚(pcp)分析中标准样品与测试样品的基材匹配程度，从而使得对土壤中五氯苯酚(pcp)分析更符合实际应用的状态，并且使检测更加准确。同时本发明制备的土壤中五氯苯酚(pcp)标准样品均匀性、稳定性高，可用于实验室间土壤中五氯苯酚(pcp)检测数据的比对、检测方法的准确性验证、检测仪器的校准及测试结果的质量控制和考核等。
相对于现有技术，本发明具有以下显著优点：
1、结合溶剂浸泡和真空混合的制样方法进行土壤与五氯苯酚的混合。由于土壤含大量氧化硅、碳酸钙等无机化合物，这使得五氯苯酚在土壤中分散效果差，很难做到五氯苯酚(pcp)在土壤中的均匀分布。本发明将一定比例的腐殖质与土样混合后浸泡在乙醇介质中，同时将五氯苯酚溶解于乙醇后与土样混合浸泡，使得五氯苯酚在土壤渗透性好，有助于五氯苯酚(pcp)均匀分布在土壤中。加入腐殖质能使土样中有机物含量增加从而使五氯苯酚与土样混合后更稳定，同时还能使制取的样品与实际土壤的基体接近。
2、空白土壤的制备时无需经高温灼烧，投料前测试空白土样中是否含五氯苯酚，若含有五氯苯酚则投料时将这部分含量扣除即可。
3、采用易挥发的乙醇作为溶剂，用真空干燥机边混合边进行将乙醇蒸发，整个操作简单、快速、五氯苯酚不损失。
4、五氯苯酚(pcp)含有量易被自由基破坏的酚羟基结构，本发明的干燥工序后期采用通入热氮气保护的方法可以有效保护五氯苯酚(pcp)不被自由基破坏其结构。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步地说明，但本发明的保护范围并不限于此。
实施例1
本实施例以制备总重量6000g，五氯苯酚含量1.5mg/kg的土壤样品为例。
(1)空白土样的制备：
a、腐殖质制备：将从环境采集的植物落叶1000g洗净后喷洒15克腐熟剂(河南南华千牧生物科技生产的em菌秸秆腐熟剂)及2000克自来水，充分混合后置于恒温恒湿箱中(温度为55℃，湿度为85％)堆积10-30天进行腐熟，腐熟后烘干、磨粉、过0.25mm筛后备用；
b、空白土样制备：将从环境采集的土壤倒在盘中，趁半干状态把土块压碎，除去植物残根等杂物，铺成薄层并经常翻动，风干后的土样，用有机玻璃(或木棒)碾碎后过2mm塑料(尼龙)筛，除去2mm以上的砂砾和植物残体(若砂砾量多时应计算其占土样的百分比)。留下的样品进一步磨细过0.25mm孔径的塑料(尼龙)筛，充分拌匀后备用；
(2)准确称目标物质五氯苯酚(pcp)纯度物质10mg，用100ml的乙醇溶解、定容、定值后备用。
(3)分别准确称取经步骤(1)制备好的空白土壤5000g和腐殖质1000g放入真空搅拌机中，再移液枪准确吸取步骤(2)制备的五氯苯酚的乙醇标准溶液90ml加入到含土样的真空干燥机中，之后用烧杯量取8000ml乙醇溶液一并加入到真空干燥机中，经充分浸泡45min后，开启搅拌器和加热器，搅拌转速设置在140r/min，温度设置在70℃，一边升温一边搅拌混合直至物料半干状态后，降低搅拌转速至100r/min，待物料干至粉末状态时，将搅拌转速降至50r/min，搅拌50min后通入适量的65℃热氮气，在热氮气的保护下继续搅拌50min，充分干燥后取出物料，将物料用co60辐照灭活后分装在密封玻璃瓶中即可制得土壤中五氯苯酚标准样品。
一、均匀性测试
对上述方法制得的土壤中五氯苯酚(pcp)标准样品进行均匀性测试。
测试方法：从样品总体中随机抽取15个样品(样品总量不少于500瓶次)，每个样品在重复条件下测试2次，重复测试应分别单独取样。采用气相色谱-质谱联用法(gc-ms)测定土壤中五氯苯酚(pcp)的含量，为减少测量中定向变化的影响，样品的所有重复性测试应遵从随机次序进行。
按照国家标准hj703-2014气相色谱-质谱联用法为参考方法，经内部优化后的具体测试条件和测试步骤如下：准确称取(2.0±0.001)g样品，加入60mlkoh(1mol/l)，在70℃下水浴中超声1h，在90℃的恒温箱中保持15h，取出冷却。加入50μltgc内标溶液(10ppm)和2.5ml乙酸酐。摇匀5min后，常温振荡萃取30min。摇匀5min后，再加入5ml正己烷，常温振荡萃取30min。静置，取上清液用gc-ms分析。
数据统计分析方法：采用单因子方差分析法进行数据统计处理，进行样品均匀性评估，相关计算公式如下：
总测定次数：
总测试平均值：
组间差方和：
组内差方和：
组间自由度：γ1＝m-1
组内自由度：γ2＝n-m
统计量f：
根据自由度(γ1，γ2)及给定的显著性水平α(取α＝0.05)，由f分布表查得临界的fα值，再与公式算得的f值进行比较，若算得f值＜fα值，表明样品内样品间无显著性差异。依据上述实施例制作出的土壤中五氯苯酚(pcp)含量的均匀性测试和方差分析结果见表1。
表1五氯苯酚(pcp)均匀性验证及其引入的不确定度
由以上检验结果可知，本批次土壤样品中五氯苯酚(pcp)含量的统计计算f值＜f0.05(14,15)的检验临界值，说明该标准样品在瓶间和瓶内不存在显著性差异，本批次含有五氯苯酚(pcp)土壤材料样品均匀性良好。
二、样品稳定性测试：
测试方法：在样品分装完成后的当月、2个月、3个月、5个月、8个月、13个月、15个月、19个月对样品的稳定性进行监测。每个时间点分别从库存样品中随机抽取5瓶样品测试，以抽取样品的总平均值作为该时间点特性量值稳定性检验结果，稳定性检验采用气相色谱-串联质谱联用法(gc-ms)测定土壤中的五氯苯酚(pcp)。
稳定性评估基本模型可表示为公式
y＝β0+β1x
式中：
β1、β0---回归系数；
x---时间；
y---标准样品候选物的特性值。
对于稳定的标准样品，β1的期望值为零。x与y之间是否存在线性关系可以通过t检验法检验。t检验法有关检验公式如下：
假定有n对x，y的观测值(xi，yi)，每个模拟直线上的yi可用公式表达：
yi＝β0+β1xi
斜率：
截距的估计值：β0＝y-β1x；
通过误差分析可以计算β0和β1标准偏差
β1的标准偏差：
直线上每点的标准偏差：
基于β1的标准偏差，可用t-检验进行以下判断：本批次标准样品共监控8次，即n＝8查表有t(0.95,6)＝2.45。斜率显著性检验见下表2。
表2土壤中五氯苯酚(pcp)稳定性检验
综上检验可知|β1|<t(0.95,n-2)·s(β1)，则表明斜率不显著，没有观察到不稳定性。说明该样品在19个月实验期间内无显著性差异，具有良好的稳定性。
实施例2
本实施例以制备总重量3000g，含量5mg/kg的样品为例。
(1)空白土样的制备：
a、腐殖质制备：将从环境采集的植物落叶500g洗净后喷洒7.5克腐熟剂(河南南华千牧生物科技生产的em菌秸秆腐熟剂)及1000克自来水，充分混合后置于恒温恒湿箱中(温度为55℃，湿度为85％)堆积10-30天进行腐熟，腐熟后烘干、磨粉、过0.25mm筛后备用；
b、空白土样制备：将从环境采集的土样将采回的土样倒在盘中，趁半干状态把土块压碎，除去植物残根等杂物，铺成薄层并经常翻动，风干后的土样，用有机玻璃(或木棒)碾碎后过2mm塑料(尼龙)筛，除去2mm以上的砂砾和植物残体(若砂砾量多时应计算其占土样的百分比)。留下的样品进一步磨细过0.25mm孔径的塑料(尼龙)筛，充分拌匀后备用；
(2)准确称目标物质五氯苯酚(纯品)20mg，用100ml的乙醇溶解、定容、定值后备用。
(3)分别准确称取经步骤(1)制备好的空白土样2500g和腐殖质500g放入真空搅拌机中，再移液枪准确吸取步骤(2)制备的五氯苯酚的乙醇标准溶液75ml加入到含土样的真空干燥机中，之后用烧杯量取4000ml乙醇溶液一并加入到真空干燥机中，经充分浸泡60min后，开启搅拌器和加热器，搅拌转速设置在130r/min，温度设置在60℃，一边升温一边搅拌混合直至物料半干状态后，降低搅拌转速至105r/min，待物料干至粉末状态时，将搅拌转速降至45r/min，搅拌35min后通入适量的热氮气，在热氮气的保护下继续搅拌60min，充分干燥后取出物料，将物料用co60辐照灭活后分装在密封玻璃瓶中即可制得土壤中五氯苯酚(pcp)标准样品。
其制备工艺与实施例1类似，测试方法也相同，在此不再赘述。
通过样品的均匀性和19个月的稳定性实验表明，采用本发明所述配方及制备方法，得到的含有五氯苯酚(pcp)的标准样品具有良好的均匀性和稳定性。该标准样品填补土壤中五氯苯酚分析用标准样品空白，具有创新性，基础性和良好的市场应用前景。
该标准样品经济南海关技术中心等多家用户使用，证实：该标准样品均匀性、稳定性好，在实际分析测试土壤中五氯苯酚(pcp)时，该标准样品与样品基材的匹配度高，检测结果的准确性和可靠性好，适用于实验室间土壤中五氯苯酚(pcp)的检测工作的质量评价、实验室认可和能力验证等。
本发明提供的土壤中五氯苯酚(pcp)标准样品，成分可设计性强，标准样品均匀性高、稳定性好；目前国内还没有土壤中五氯苯酚(pcp)标准样品，本发明提供的样品填补了国内该项五氯苯酚(pcp)标准样品的空白。