一种中药土鳖虫的鉴定试剂盒及其鉴定方法与流程

本发明涉及的是中药材鉴定技术领域，尤其涉及的是一种中药土鳖虫的鉴定试剂盒及其鉴定方法。

背景技术：

中药土鳖虫为鳖蠊科昆虫地鳖(eupolyphagasinensiswalker)或翼地鳖(polyphagaplancyibolivar)的雌虫干燥体，此虫生活在土地里，故名土鳖虫或地鳖虫。中药土鳖虫包括地鳖或翼地鳖，地鳖呈扁平卵形前端较窄，后端较宽，背部紫褐色，具光泽，无翅，前胸背板较发达，盖住头部，腹背板9节，呈覆瓦状排列，腹面红棕色，头部较小，有丝状触角1对，常脱落，胸部有足3对，具细毛和刺，腹部有横环节，质松脆，易碎，气腥臭，味微咸。冀地鳖背部黑棕色，通常在边缘带有淡黄褐色斑块及黑色小点。中药土鳖虫粉末呈灰棕色，体壁碎片深棕色或黄色，表面有不规则纹理，其上着生短粗或细长刚毛，常可见刚毛脱落后的圆形毛窝，直径5～32μm；刚毛棕黄色或黄色，先端锐尖或钝圆，长12～270μm，直径10～32μm，有的具纵直纹理，横纹肌纤维无色或淡黄色，常碎断，有细密横纹，平直或呈微波状，明带较暗带为宽。

中药土鳖虫中的成分主要包括蛋白质、挥发油、脂肪酸、氨基酸、甾醇及多种微量元素。另含各种脂肪醛和芳香醛及二氯苯和二甲基二硫醚等其他中药少见的成分。将捕捞的土鳖虫用沸水烫死，晒干或烘干后即可入药，具有较高的药用价值，能够破瘀血、续筋骨，是治疗筋骨折伤，瘀血经闭,症瘕痞块的常用药。

目前，中药土鳖虫的鉴别方法主要包括形态鉴别和理化鉴别方法，形态鉴别很直观，但误差较大，需要依赖经验丰富的鉴别人员才能做出准确判断。理化鉴别方法主要为液相色谱法或薄层色谱法，通过鉴别其中的特征成分，达到鉴别目的，如中国药典2015版公开了薄层色谱法鉴别土鳖虫中药材的方法，步骤包括：取土鳖虫粉末，加甲醇，超声处理后，取滤液蒸干，残渣加甲醇溶解，作为供试品，另取土鳖虫对照药材，同法制成对照药材溶液，照薄层色谱法试验，吸取两种溶液点于同一硅胶g薄层板上，以甲苯-二氯甲烷-丙酮(5：5：0.5)位展开剂，展开，取出晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；喷以香草醛硫酸试液，在105℃加热至斑点显色清晰，显相同颜色的斑点。虽然理化鉴别方法相比较形态鉴别更准确，但操作较复杂，需要依赖仪器设备较多，鉴定时间长。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种中药土鳖虫的鉴定试剂盒及其鉴定方法，以解决现有鉴定方法准确性低，操作复杂，对仪器依赖性较大等技术问题。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一种中药土鳖虫的鉴定试剂盒，包括样品溶剂、对照品溶液、展开剂、显色剂和检测试剂条，所述检测试剂条由上至下依次包括上载板、硅胶层、中载板、吸水层和下载板，所述上载板沿长轴方向依次设有展开剂槽、点样槽和观察窗，所述展开剂槽与硅胶层的一端连通，所述点样槽距离展开剂槽4-6mm，所述点样槽底部设有连通硅胶层的点样针，所述观察窗用于观察样品的色谱情况，观察窗上设有一透明隔膜，用于将硅胶层与空气隔绝；所述中载板上设有若干连通硅胶层和吸水层的透水孔，中载板上设有抽拉隔膜，所述抽拉隔膜覆盖中载板的透水孔，用于阻止吸水层吸取硅胶层的水分，所述抽拉隔膜包括延伸至中载板外的抽拉段，以方便将抽拉隔膜抽出，打开吸水层的吸水通道；所述吸水层内填充有氧化钙，用于吸收硅胶层的水分并放热。

作为本发明进一步的优化方案，所述上、中、下载板为玻璃板或pvc板。

作为本发明进一步的优化方案，所述硅胶层的材料为硅胶g。

作为本发明进一步的优化方案，所述点样槽设有若干个，包括至少1个标准品点样槽和至少1个供试品点样槽，各点样槽内点样针的孔容相等，优选地，各点样槽的点样针的孔容大小为0.5-5μl。

作为本发明进一步的优化方案，所述观察窗内的硅胶层远离展开剂槽的一端设有终止线，所述终止线内包被有无水硫酸铜。

作为本发明进一步的优化方案，所述样品溶剂为体积比为50％的甲醇溶液。

作为本发明进一步的优化方案，所述对照品溶液的制备方法包括：取若干标准品，加入样品溶剂制成每1ml样品溶剂含0.5mg标准品的混合溶液，所述标准品包括精氨酸、甘氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸标准品。

作为本发明进一步的优化方案，所述展开剂为体积百分比为5：5：0.5的甲苯-二氯甲烷-丙酮溶液或体积百分比为3：1：1的正丁醇-冰醋酸-水溶液，所述显色剂为香草醛硫酸试液或茚三酮溶液。

本发明还提供了一种中药土鳖虫的鉴定方法，包括以下步骤：

步骤s1、供试品溶液的制备：每1g待检测土鳖虫粉末中，加入样品溶剂25ml后，进行超声处理，滤过，滤液蒸干，残渣加样品溶剂5ml使溶解，作为供试品溶液；

步骤s2、点样：将供试品溶液加入供试品点样槽中，将对照品溶液加入标准品点样槽中，各溶液在点样槽内停留3-6秒，弃去点样槽内的剩余溶液；

步骤s3、薄层扩展：将展开剂加入展开剂槽中，静置展开，待终止线变蓝时，弃去展开剂槽中剩余的展开剂；

步骤s4、干燥显色：撕开观察窗的透明隔膜，喷以显色剂在硅胶层表面，同时抽去抽拉隔膜，此时，吸水层内的氧化钙会吸收硅胶层内的水份，同时放热，干燥硅胶层的同时使硅胶层能够迅速显色，获得供试品溶液和对照品溶液色谱；

步骤s5、结果判断：若供试品溶液在与对照品溶液色谱相应的位置上，具有相同颜色的斑点，则说明该供试品为品质合格的中药土鳖虫，反之，则不合格。

本发明基于中国药典公开的薄层色谱鉴定原理，提供了一种中药土鳖虫的鉴定试剂盒及其鉴定方法，该发明相比较现有技术，操作简便，整个鉴定过程通过检测试剂条在室内常规条件下操作即可，无需紫外或加热等设备的辅助，检测试纸条可以同时完成干燥和加热过程。此外，点样槽的设计，相比较传统薄层色谱过程中用毛细管人工点样，计量把握更精确，对操作员的经验要求较低，获得的薄层色谱斑点清晰规整。

附图说明

图1为检测试纸条整体结构示意图；

图2为检测试纸条长轴方向的剖面结构示意图；

图中：1-上载板、2-硅胶层、3-中载板、4-吸水层、5-下载板、11-展开剂槽、12-点样槽、13-点样针、14-观察窗、15、透明隔膜、21-终止线、31-透水孔、32-抽拉隔膜。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

本实施例提供了一种中药土鳖虫的鉴定试剂盒，所述鉴定试剂盒包括样品溶剂、对照品溶液、展开剂、显色剂和检测试纸条，其中：所述样品溶剂为体积比为50％的甲醇溶液；对照品溶液为预先配置好的经过处理的土鳖虫药材、或土鳖虫药材的代表性氨基酸的混合溶液，所述展开剂为体积百分比为5：5：0.5的甲苯-二氯甲烷-丙酮溶液，配合使用香草醛硫酸试液作为显色剂，所述展开剂也可以选用体积百分比为3：1：1的正丁醇-冰醋酸-水溶液，配合使用茚三酮溶液作为显色剂。

所述检测试纸条的结构如图1-2所示，该检测试纸条整体呈长条形，由上至下包括五层结构，该五层结构由上至下依次为上载板1、硅胶层2、中载板3、吸水层4和下载板5，所述上、中、下载板1、3、5可选用玻璃板或pvc等惰性材料板，所述硅胶层2为常规薄层色谱用的硅胶g材料制成，下面结合附图对本发明的检测试纸条做详细阐述。

如图1-2所示，所述上载板1沿长轴方向依次设有展开剂槽11、点样槽12和观察窗14，其中：

所述展开剂槽11的底端与硅胶层2的一端短边连接，且展开剂槽11的槽长度不小于硅胶层2的短边长度，保证展开剂槽11内的展开剂能够浸没硅胶层2的一短边。

所述点样槽12垂直试纸条长轴呈直线排布，且距离展开剂槽11为4-6mm，以确保点样位置与展开剂之间距离合适，符合薄层色谱的需要；所述点样槽12设有若干个，包括至少1个标准品点样槽12和至少1个供试品点样槽12，各点样槽12内设有点样针13，点样针13与硅胶层2连通；各点样针13的孔容相等，优选为0.5-5μl，以确保点样量为最佳；各点样针13位于同一直线上，保证各供试品溶液或对照品溶液都处于相同点样起点，使色谱结果斑点整齐一致。

所述观察窗14与硅胶层2连通，用于观察样品的色谱情况，是色谱结果的显示区。所述观察窗14上设有一透明隔膜15，用于将硅胶层2与空气隔绝。在所述观察窗14区域的硅胶层2上，其远离展开剂槽11的一端设有终止线21，该终止线21内包被有无水硫酸铜，根据无水硫酸铜常规为白色，遇水变蓝的特性，将其包被在终止线21上，当展开剂沿着硅胶层2的一端扩展至终止线21时，终止线21会变蓝，以此判断扩展剂的扩展中点，确保色谱结果仅在观察窗14区域内显示而不越线。

所述中载板3上设有若干连通硅胶层2和吸水层4的透水孔31，中载板3上设有抽拉隔膜32，所述抽拉隔膜32覆盖中载板3的透水孔31，用于阻止吸水层4吸收硅胶层2的水分，所述抽拉隔膜32还包括延伸至中载板3甚至整个试纸条外的抽拉段，以方便使用时，将抽拉隔膜32抽出，打开吸水层4的吸水通道。所述吸水层4内填充有氧化钙，当抽拉隔膜32被抽出后，吸水通道打开，氧化钙会吸收硅胶层2内的水分，促进硅胶层2迅速干燥，同时，氧化钙吸水放热，为硅胶层2提供热量，促进显色剂显色。

本实施例还提供了一种利用上述中药土鳖虫鉴定试剂盒进行鉴定的方法，包括以下步骤：

步骤s1、供试品溶液和对照品溶液的制备：

每1g待检测土鳖虫粉末中，加入样品溶剂25ml后，进行超声处理，滤过，滤液蒸干，残渣加样品溶剂5ml使溶解，作为供试品溶液；

试剂盒中对照品溶液是预先制备好的，例如，若以标准土鳖虫药材作为对照品，则按照上文供试品溶液的制备方法，以标准土鳖虫药材作为处理对象制备获得对照品溶液；若以土鳖虫药材的代表性氨基酸作为对照品的话，则将这些代表性氨基酸的标准品用试剂盒中的样品溶剂溶解，制成每1ml样品溶剂含0.5mg代表性氨基酸的标准品。根据文献记载(水彩红、曹红，土鳖虫药材质量标准的提高，中国医药指南，2014年4月第12卷第12期)，土鳖虫药材的代表性氨基酸可选用精氨酸、甘氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸，本实施例中的供试品溶液为精氨酸、甘氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸标准品的混合溶液。

步骤s2、点样

将供试品溶液加入供试品点样槽12中，将对照品溶液加入标准品点样槽12中，加入时各槽加入量可以不同，但需要保持停留时间尽可能一致，以确保点样量相当，供试品溶液和标准品溶液的色谱图更加规整。当供试品/标准品溶液加入点样槽12后，点样槽12内的溶液会通过点样针13渗入硅胶层2，被硅胶层2吸收。待点样槽12内溶液停留3-6秒时，迅速用吸水纸将点样槽12内的溶液吸干，可防止点样过量。关于点样槽12内溶液的停留时间，跟点样针13的孔容有关，孔容越大，点样槽12内溶液的停留时间应控制越短，反之，停留时间越长。

步骤s3、薄层扩展

将展开剂加入展开槽内，静置展开，通过观察窗14观察，待终止线21内的氧化钙与水接触变蓝时，说明扩展剂已经扩展到了终止线21的位置，此时，将多余的展开剂倒掉，并用吸水纸擦干展开剂槽11，终止扩展。

步骤s4、干燥显色

撕开观察窗14的透明隔膜15，喷以显色剂在硅胶层2表面，同时抽去抽拉隔膜32，此时，吸水层4内的氧化钙会吸收硅胶层2内的水分，同时，氧化钙吸水放热，加热硅胶层2促进干燥，显色剂在加热条件下发生显色反应，观察窗14内开始显现斑点。

步骤s5、结果判断

通过观察窗14观察斑点显现情况，若供试品溶液在与对照品溶液色谱相应的位置上，具有相同颜色的斑点，则说明该供试品为品质合格的中药土鳖虫，反之，则不合格。

本发明是基于薄层色谱法鉴定中药土鳖虫的原理，开发的一种中药土鳖虫鉴定试剂盒和鉴定方法，该试剂盒和方法相比较现有技术操作更简单，显色过程无需特别的干燥或加热设备即可完成，且点样量把握更精准，对操作员的经验要求较低，获得的薄层色谱斑点清晰规整。

以上为本发明一种详细的实施方式和具体的操作过程，是以本发明技术方案为前提下进行实施，但本发明的保护范围不限于上述的实施例。