缺氧诱导因子-2α作为作用靶点在帕金森病预防/治疗中的应用的制作方法
本发明属于神经生物学细胞领域，尤其涉及一种缺氧诱导因子-2α作为作用靶点在帕金森病预防/治疗中的应用。
背景技术：
帕金森病(parkinson’sdisease,pd)是一种多发于中老年的中枢神经系统退变性疾病，以运动不能、肌僵直、静止性震颤及姿势反射障碍为特征性表现，其病理学特征是中脑黑质致密带多巴胺(dopamine,da)能神经元脱失。目前pd铁沉积的研究主要集中在da能神经元，而实际上脑内多种胶质细胞在铁稳态调节中也发挥着重要作用，尤其是星形胶质细胞约占中枢神经系统(centralnervoussystem,cns)细胞总数的90％，可吸收，储存和释放铁，对脑铁运输和脑铁含量进行精确的调控，在脑内铁代谢调节中发挥重要作用。
缺氧诱导因子(hypoxia-induciblefactor,hif)是铁稳态的重要因子，存在一簇有功能的核定位信号，能够特异性定位于细胞核内。hifs由α亚基和β亚基组成具有转录活性的异源二聚体。其中α亚基是hifs的调节亚基。哺乳动物一共存在三种hif-α亚基，分别是hif-1α、hif-2α和hif-3α，其中hif-1α和hif-2α是研究较多和较深入的。hif-1α和hif-2α有很高的同源性，但二者的靶基因具有特异性，靶基因的特异性决定了其参与的调节功能不同。另外，hifs的分布也具有组织特异性，hif-1α在人与小鼠组织中广泛表达，hif-2α主要分布在胶质细胞、内皮细胞、肝细胞、心肌细胞及ii型肺泡细胞中。其中hif-1α和hif-2α是研究较多和较深入的，尤以在小肠铁代谢的调节,但在脑内的研究较少。在脑内，星形胶质细胞和hif的研究主要集中在脑卒中，hif调节vegf；或星形胶质细胞作为血脑屏障的主要构成，通过hif调节血脑屏障的通透性等，而在星形胶质细胞中，hif铁代谢的调节作用未见相关报道。
目前，研究星形胶质细胞和da能神经元的相互作用，主要研究集中在星形胶质细胞对da能神经元的保护作用，如bdnf，gdnf的神经保护作用，sod的抗氧化应激作用等，但关于星形胶质细胞铁代谢的机制研究较少，未见有报道星形胶质细胞铁代谢的调节机制及具体作用靶点，既没有星形胶质细胞作为神经元的支持细胞在pd神经元铁沉积中的作用，也无法确定神经元中过多的铁的来源和星形胶质细胞铁代谢的调节机制。在脑铁代谢中，星形胶质细胞对神经元的影响，铁沉积的铁来源等仍是目前亟需探讨的关键问题。
因此，如何应用pd的细胞模型，阐明星形胶质细胞铁代谢的调节机制，探讨星形胶质细胞与da能神经元铁代谢方式的异同，从而研究pd人脑内高铁尤其是黑质区铁沉积的铁来源，脑内高铁分布区域不同的原因，cns中胶质细胞对神经元间铁转运的影响和作用，以期寻找预防/治疗pd的靶点显得尤为重要。
技术实现要素：
本发明提出了一种hif-2α作为作用靶点在pd预防/治疗中的应用，该方案研究寻找到星形胶质细胞铁代谢的作用靶点hif-2α，在细胞层面寻找到预防/治疗pd的作用靶点，为pd铁沉积中中脑神经元铁的来源、星形胶质细胞的铁转运作用等亟需解决的科学问题提供了新的研究思路和实验证据。
为了达到上述目的，本发明提供一种缺氧诱导因子-2α作为作用靶点在帕金森病的预防/治疗中的应用。
作为优选，包括以下步骤：
应用6-ohda分别处理原代培养的中脑星形胶质细胞和原代培养的中脑腹侧神经元，分别检测提取的总蛋白中的hif-1α和hif-2α的蛋白表达，并分别与未利用6-ohda处理组中的hif-1α和hif-2α的蛋白表达进行比较，检测得到6-ohda激活星形胶质细胞中的hif-1α和hif-2α，而没有激活中脑腹侧神经元细胞中的hif-1α和hif-2α，确定6-ohda制备的帕金森病细胞模型中，6-ohda激活原代培养的中脑星形胶质细胞hif-1α和hif-2α；
使用hif-1α特异性抑制剂bay87-2243作用于原代培养的中脑星形胶质细胞后，与6-ohda共同作用，观察星形胶质细胞hif-1α蛋白表达的变化以及抑制hif-1α激活后对星形胶质细胞中dmt1(铁转入蛋白二价金属离子转运蛋白)和fpn1(铁转出蛋白)的蛋白表达的变化；
使用hif-2α特异性抑制剂hif-2α转录抑制剂作用于原代培养的中脑星形胶质细胞后，与6-ohda共同作用，观察星形胶质细胞中hif-2α蛋白表达的变化以及抑制hif-2α激活后对星形胶质细胞中dmt1和fpn1蛋白表达的变化；
基于原代培养的中脑星形胶质细胞和原代培养的中脑腹侧神经元中上述蛋白表达的变化，筛选得到pd预防/治疗中的作用靶点为缺氧诱导因子2α。
作为优选，原代培养的星形胶质细胞中hif-2α的激活能够引起dmt1和fpn1蛋白表达的上调，星形胶质细胞中hif-2α的抑制亦能够抑制dmt1和fpn1蛋白表达的上调。
作为优选，原代培养的星形胶质细胞中hif-1α抑制剂抑制hif-1α的蛋白表达，但未抑制6-ohda引起的原代培养的星形胶质细胞dmt1和fpn1蛋白表达的上调。
作为优选，利用10μm6-ohda处理分别以1.5×105/ml的密度接种于预先铺有多聚赖氨酸六孔板中的原代培养的星形胶质细胞和原代培养的中脑腹侧神经元24h后分别提取总蛋白；
结合抑制剂使用说明书及时间筛选实验，利用10μmhif-1α特异性抑制剂bay87-2243或hif-2α特异性抑制剂hif-2αtranslationinhibitor预处理48h或24h后，加入10μm6-ohda共同作用24h后,提取总蛋白。
作为优选，总蛋白的提取与定量方法包括以下步骤：
将细胞用6-ohda或hif-1α或hif-2α特异性抑制剂处理后，吸尽培养液，用预冷的pbs洗涤后每孔加入100μl的ripa细胞裂解液，并冰上裂解0.5h，得到裂解物；
将裂解物收集后于4℃、12000rpm离心20min，将上清液转移到新ep管中；用bca蛋白定量试剂盒检测提取蛋白浓度，将蛋白按每份30μg分装，于95℃水浴加热5min使蛋白变性，-80℃冰箱冻存。
作为优选，星形胶质细胞的培养方式包括：从试验动物中提取分离原代中脑星形胶质细胞，重悬沉淀，筛选后，用胰酶消化、并用星形胶质细胞完全培养液终止消化，然后加入星形胶质细胞完全培养液进行差速粘附处理，调整细胞浓度后接种于预先用多聚赖氨酸处理的六孔板中，稳定24-48h后用于实验；
中脑腹侧神经元细胞的培养方式包括：从试验动物中提取分离原代中脑腹侧神经元细胞，接种于预先用多聚赖氨酸处理的六孔板中，置37℃，5％co2培养箱中，5天后用于实验。
作为优选，星形胶质细胞完全培养液由dmem/f-12(1:1)基本培养液200ml、10％胎牛血清、100u/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素构成。
作为优选，中脑腹侧接种培养液由dmem/f-12(1:1)基本培养液200ml、10％胎牛血清、100u/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素构成；中脑腹侧神经元完全培养液由dmem/f-12(1:1)基本培养液200ml、2％b27、100u/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素构成。
作为优选，所述帕金森病的病理学特征是中脑黑质致密带多巴胺能神经元脱失，帕金森病铁沉积主要集中在多巴胺能神经元，多巴胺能神经元铁沉积致其变性死亡，导致帕金森病的发生。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：
1、本发明利用原代培养的中脑星形胶质细胞和原代培养的vm神经元的pd细胞模型，阐明了星形胶质细胞和神经元铁代谢方式的不同，在神经元中，6-ohda作用在原代培养的vm神经元，铁调节蛋白(ironregulatoryprotein,irp1)被激活，使dmt1上调、fpn1下调，铁转入加快，转出减慢，造成神经元铁的沉积，即在vm神经元中irp1起主要的铁代谢调节作用。而6-ohda作用在原代培养的中脑星形胶质细胞，irp1的蛋白表达没有变化，hif-2α被激活，使dmt1、fpn1上调，铁转入加快，铁转出加快，使星形胶质细胞转铁加快。即在原代培养的中脑星形胶质细胞中，hif-2α起主要的铁代谢调节作用。
2、本发明通过经典的pd细胞模型，有效的用于pd铁代谢尤其是铁转运的研究中，既明确了星形胶质细胞的铁代谢的调节机制，阐明了星形胶质细胞所起到的“铁泵”的作用，即铁由星形胶质细胞dmt1转入、fpn1转出，且这一过程由hif-2α调节。又阐明了星形胶质细胞在pd铁沉积中的作用，即6-ohda激活星形胶质细胞hif-2α，使dmt1和fpn1的蛋白表达增加，铁转入和转出细胞加快，转运给神经元过多的铁，是pd神经元铁沉积铁的来源。
3、本发明的关键和重点在于本发明为pd铁沉积寻找到了神经细胞高铁的来源，是由星形胶质细胞铁转运的加快造成的，而促进星形胶质细胞铁转运加快的核心要素是hif-2α。从而不仅为防治pd铁沉积提供了新的作用靶点hif-2α，而且本专利研究也为神经细胞的高铁来源星形胶质细胞的铁转运机制提供了全新的研究思路和实验证据。对于防治pd的药物研发具有潜在的不可估量的社会和经济价值。
4、本发明在研究星形胶质细胞铁转入时，给予外源性铁30min，且实时扫描，观察动态变化发现，超过30min，铁会改变细胞形态和功能；研究星形胶质细胞铁转出时，需先给予外源性铁30min，若时间过长，胞内铁的实时变化会有变化，可能与自身生理的修复机制有关；再使用dfo作用30min，实时扫描观察动态变化，发现荧光强度逐渐变强。
附图说明
图1为本发明实施例所提供的10μmol/l6-ohda处理原代培养的中脑星形胶质细胞24h，hif-1α和hif-2α蛋白表达变化；
图2为本发明实施例所提供的10μmol/l6-ohda处理原代培养的vm神经元24hhif-1α和hif-2α的蛋白表达变化；
图3为本发明实施例所提供的10μmol/lbay87-2243预处理48h后，10μmol/l6-ohda处理原代培养的中脑星形胶质细胞24hhif-1α蛋白表达变化；
图4为本发明实施例所提供的10μmol/lbay87-2243预处理48h后，10μmol/l6-ohda处理原代培养的中脑星形胶质细胞24hdmt1蛋白表达变化；
图5为本发明实施例所提供的10μmol/lbay87-2243预处理48h后，10μmol/l6-ohda处理原代培养的中脑星形胶质细胞24hfpn1蛋白表达变化；
图6中(a)为本发明实施例所提供的10μmol/lhif-2α抑制剂预处理24h后，10μmol/l6-ohda处理原代培养的中脑星形胶质细胞24hhif-2α蛋白表达变化；(b)为本发明实施例所提供的10μmol/lhif-2α抑制剂预处理24h后，10μmol/l6-ohda处理原代培养的中脑星形胶质细胞24hdmt1蛋白表达变化；(c)为本发明实施例所提供的10μmol/lhif-2α抑制剂预处理24h后，10μmol/l6-ohda处理原代培养的中脑星形胶质细胞24hfpn1蛋白表达变化；
图7为本发明实施例所提供的原代培养的中脑星形胶质细胞细胞铁转入(a)和转出(b)示意图。
具体实施方式
为了更清楚详细地介绍本发明实施例所提供的缺氧诱导因子-2α作为作用靶点在帕金森病的预防/治疗中的应用，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1星形胶质细胞原代培养
1.1实验动物
实验动物选用新生24hwistar乳鼠(由青岛市药检所动物中心提供)用于星形胶质细胞原代培养。
1.2实验试剂
dmem/f-12(1:1)：gibco公司产品；
胎牛血清(fbsgold)：gibco公司产品，eu级；
多聚赖氨酸，硼酸，四硼酸钠：sigma公司产品；
青霉素-链霉素溶液(100x)，胰蛋白酶(trypsin)：江苏海门碧云天生物技术研究所产品。
1.3实验仪器
超净工作台：苏州净化设备有限公司；
co2孵箱：美国thermofisherscientific产品；
普通离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司；
温箱及烤箱：德国memmerf产品；
-20℃和4℃冰箱：青岛海尔产品；
-80℃超低温冰箱：美国thermofisherscientific产品；
高压消毒锅：德国varioklav产品；
十万分之一电子天平：日本岛津产品(ael-40sm)；
解剖显微镜，倒置相差显微镜：日本olympus产品；
空气浴恒温摇床：哈尔滨东明医疗仪器厂。
1.4液体配制
dmem/f-12(1:1)基础培养液：
dmem/f12粉剂1包溶于1000ml双蒸水，加入2.438gnahco3，调节ph至7.2，0.2μm微孔滤膜过滤除菌，分装，4℃保存。
星形胶质细胞完全培养液：
dmem/f-12(1:1)基本培养液200ml，20％胎牛血清，100u/ml青霉素，0.1mg/ml链霉素，混匀后4℃保存。
5×硼酸盐缓冲液：
称取0.254g硼酸，0.476g四硼酸钠，溶于双蒸水，完全溶解后定容至100ml，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存。
多聚赖氨酸：
将多聚赖氨酸溶于除菌5×硼酸盐缓冲液中，储存液浓度为1mg/ml，-20℃分装保存。包被非玻璃制品时，以除菌1×硼酸盐缓冲液稀释至工作浓度(10μg/ml)。
1.5星形胶质细胞的培养与筛选
星形胶质细胞的培养和分离按文献操作，具体步骤如下：
培养板及培养瓶的处理
150cm2细胞培养瓶(corning)在细胞接种前，将多聚赖氨酸(10μg/ml)加入培养瓶中，使其完全盖过瓶底，37℃，5％co2孵箱中放置过夜，将剩余的多聚赖氨酸溶液吸掉，用高压灭菌双蒸水清洗三遍，超净工作台内紫外线照射0.5h，待用。
原代星形胶质细胞的获取，传代和接种培养：
将出生24h之内的wistar乳鼠浸泡于75％酒精中消毒。断颈取头，以眼科剪在乳鼠头部两侧沿耳上缘剪开，尽量减少破坏脑组织，以眼科镊剥取全脑，置于4℃预冷dmed/f12基础培养液的平皿中，之后全部操作在冰上完成，以减少细胞死亡。用角膜镊在解剖显微镜下去除小脑及嗅球部位，仔细剥离脑膜和血管后，置于新无菌dmed/f12基础培养液平皿中，以眼科剪将脑组织切碎，以灭菌pasteur滴管及口径为1mm的移液器枪头、口径为0.5mm的移液器枪头贯续轻轻吹打至组织块完全消散。经200目细胞筛过滤除去未吹散组织块，将滤液移至离心管中，1000rpm，离心5min，弃上清液，用含20％胎牛血清及双抗的星形胶质细胞完全培养液中重悬沉淀物。按约5只脑/瓶(20ml)的密度将细胞悬液接种到多聚赖氨酸处理过的150cm2细胞培养瓶中，置37℃，5％co2孵箱中，先将培养瓶上面朝下倒置，差速贴壁1h后转瓶正置。24h后半量换液一次,以后每三天换液一次。
细胞培养7-14天见底层细胞融合生长，长成致密单层细胞后即可用于星形胶质细胞的筛选。将细胞培养瓶置于空气浴恒温摇床，37℃，240rpm剧烈震摇16-18h，去上清液，以无血清dmem/f12基础培养液漂洗底层细胞一次，加入0.25％胰酶消化细胞37℃1-5min后，用星形胶质细胞完全培养液终止消化，细胞悬液1000rpm离心5min弃上清含酶液，细胞重复洗涤一次后，加入星形胶质细胞完全培养液行差速粘附处理30min，重新混悬，调整细胞密度，以约5×104/cm2传代，传2代后，将细胞接种于多聚赖氨酸处理过的6孔板，稳定24-48h后可用于实验。
实施例2腹侧中脑(ventralmesencephalon,vm)神经元的原代培养
2.1实验动物
实验动物选用孕14天wistar孕鼠(由青岛市药检所动物中心提供)，置于室温20℃，12：12小时昼夜循环光照条件下生活，自由取食、饮水。
2.2实验试剂
dmem/f-12(1:1)：gibco公司产品；
b27：gibco公司产品；
胎牛血清(fbsgold)：gibco公司产品，eu级；
多聚赖氨酸，硼酸，四硼酸钠：sigma公司产品；
青霉素-链霉素溶液(100x)，胰蛋白酶(trypsin)：江苏海门碧云天生物技术研究所产品。
2.3实验仪器
超净工作台：苏州净化设备有限公司；
co2孵箱：美国thermofisherscientific产品；
普通离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司；
温箱及烤箱：德国memmerf产品；
-20℃和4℃冰箱：青岛海尔产品；
-80℃超低温冰箱：美国thermofisherscientific产品；
高压消毒锅：德国varioklav产品；
十万分之一电子天平：日本岛津产品(ael-40sm)；
解剖显微镜，倒置相差显微镜：日本olympus产品；
2.4液体配制
dmem/f-12(1:1)基础培养液：
dmem/f12粉剂1包溶于1000ml双蒸水，加入2.438gnahco3，调节ph至7.2，0.2μm微孔滤膜过滤除菌，分装，4℃保存。
vm神经元接种培养液：
dmem/f-12(1:1)基本培养液200ml，10％胎牛血清，100u/ml青霉素，0.1mg/ml链霉素，混匀后4℃保存。
vm神经元完全培养液：
dmem/f-12(1:1)基本培养液200ml，2％b27，100u/ml青霉素，0.1mg/ml链霉素，混匀后4℃保存。
5×硼酸盐缓冲液：
称取0.254g硼酸，0.476g四硼酸钠，溶于双蒸水，完全溶解后定容至100ml，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存。
多聚赖氨酸(多聚赖氨酸)：
将多聚赖氨酸溶于除菌5×硼酸盐缓冲液中，储存液浓度为1mg/ml，-20℃分装保存。包被非玻璃制品时，以除菌1×硼酸盐缓冲液稀释至工作浓度(10μg/ml)。
2.5vm神经元的原代培养
于接种前1天，用10μg/ml或20μg/ml多聚赖氨酸处理transwell下室，37℃培养箱中过夜。将液体吸出，用无菌三蒸水清洗三遍后，放置超净台中晾干。孕14天wistar孕鼠用水合氯醛麻醉(400mg/kg，8％约lml/200mg)后，用75％酒精消毒腹部皮肤，沿腹中线剪开，充分暴露腹腔，将子宫(连成一串的胚囊)完整取出，.置于盛有预冷的d-hank’s液的玻璃皿中，剪破包膜将小胎鼠剥出，至新的d-hank’s液中，分离胚胎，在解剖显微镜下用纤维眼科弯镊去除端脑，取出中脑部分至新的d-hank’s液中，修剪剩下的脑组织块，去除脑膜，留出蝴蝶状的腹侧中脑，转移至新的d-hank’s液中，先用吸管将大块脑组织吹碎，然后用枪头轻轻吹打组织块至完全分离，形成单细胞悬液。将细胞悬液转移至大离心管中，放置离心机中1000rpm/min，离心5min。小心弃掉上清，加入适量接种液重悬，反复吹打至组织块完全消散。取10μl细胞悬液，稀释10倍后，用台盼蓝染色，在倒置显微镜下进行细胞计数，着色细胞为死细胞，加入适量接种液调整细胞浓度至1x106/ml接种到预先用多聚赖氨酸处理过的6孔板。置37℃，5％co2培养箱中孵育18h后，更换为含有2％b27的培养液，之后每隔三天换液一次，5天后可用于实验。
实施例3免疫印迹检测hif-1α和hif-2α激活情况以及dmt1和fpn1的蛋白表达
3.1实验试剂
6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-ohda)，抗坏血酸：sigma公司产品。
hif-2αtranslationinhibitor：millipore公司产品
bay87-2243：selleck公司产品，hif-1α特异性抑制剂
丙稀酰胺，苯甲基磺酰胺(pmsf)：genview公司产品。
过硫酸铵(aps)，tween-20(吐温20)，十二烷基硫酸钠(sds，电泳级)，nonidetp40，pepstatin，抑蛋白酶肽(aprotinin)，亮抑制肽(leupeptin)，脱氧胆酸钠(nadeoxycholate)，rabbitanti-β-actin抗体，hrp标记的goatanti-rabbitigg：sigma公司产品。
n',n'-亚甲双丙烯酰胺：bebco公司产品。
氨基乙酸(甘氨酸，glycine，电泳级)，三羟基甲基氨基甲烷(tris)，tris·base，tris·hcl，乙二胺四乙酸(edta)：solarbio公司产品。
pdvf膜，ecl化学发光试剂盒：millipore公司产品。
ripa裂解液(中)，bca蛋白定量试剂盒，彩色预染蛋白质分子量标准，n,n,n’,n’-四甲基乙二胺(temed)：江苏海门碧云天生物技术研究所产品。
一抗：dmt1、fpn1抗体为adi公司产品，hif-1α抗体为sigma公司产品，hif-2α的抗体为novusbiologicals公司产品，β-actin抗体购自北京博奥森公司。
二抗：hrp标记的goatanti-rabbitigg购自santacruz公司。
3.2常用仪器
电泳槽mini-ve、电转仪(湿转)trans-blot、电泳仪power-pac200：bio-rad公司，美国。
超纯水机：millipore公司产品，美国。
分光光度计、台式低温高速离心机(5417r)：eppendorf公司，德国。
uvp凝胶成像系统，美国。
3.3所用药物的配制
抗坏血酸溶液：
溶于0.9％生理盐水中，储存液浓度为200μg/ml。
6-ohda：
取0.2056mg溶于抗坏血酸溶液中，储存液为1mm，使用时以无血清培养液稀释为工作液浓度。
hif-2α转录抑制剂(hif-2αtranslationinhibitor,cas882268-69-1)：
取0.5746mg溶于2mldmso中，储存液为1mm，使用时以无血清培养液稀释为工作液浓度。hif-2α转录抑制剂为hif-2α特异性抑制剂。
bay87-2243：
取1mg加入1.9028ml乙醇，37℃水浴溶解，储存液为1mm，使用时以无血清培养液稀释为工作液浓度。bay87-2243为hif-1α特异性抑制剂。
3.4所用抗体
一抗：rabbitanti-dmt1和rabbitanti-fpn1滴度为1:800，rabbitanti-hif-1α和rabbitanti-hif-2α滴度为1:1000。
β-actin抗体滴度为1:10000。
二抗：hrp标记的goatanti-rabbitigg，滴度为1:10000。
3.5常用液体的配制
pmsf：
将1.74mg溶解于1ml异丙醇中，储存液的浓度为100mmol/l，保存于-20℃。
细胞裂解液：
50mmol/ltrisph7.5，1％nonidet40，150mmol/lnacl,0.5％脱氧胆酸钠(避光)，1mmol/ledta，10mmol/lpmsf,ph值7.5，过滤后于4℃避光保存。临用时取987μl加入10μl100mm的pmsf，1μlpepstatin(1μg/ml)，1μlaprotinin(1μg/ml)，1μlleupeptin(1μg/ml)。
30％丙烯酰胺混合液(100ml)：
29g丙烯酰胺和1gn,n’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为60ml的超纯水中，加热至37℃使之溶解，补水至终体积100ml，ph<7.0，过滤后4℃避光保存。
10％aps：
0.1gaps加1ml超纯水，4℃保存，现用现配。
10％sds：
10gsds溶于80ml超纯水，加热溶解后定容至100ml，室温保存。
1.5mtris·cl(ph8.8)：
称取18.171gtris溶于90ml超纯水，用浓hcl调节ph值至8.8，定容至100ml。
0.5mtris·cl(ph6.8)：
称取6.057gtris溶于90ml超纯水，用浓hcl调节ph值至6.8，定容至100ml。
10×电泳缓冲液：
分别称取tris30g，甘氨酸144g，sds10g，超纯水定容至1000ml。
10×转膜缓冲液：
tris30g，甘氨酸144g，超纯水定容至1000ml。
1×转膜缓冲液：
分别称取10×转膜缓冲液100ml，甲醇200ml，超纯水700ml，调节ph值至8.3。
10×tbst溶液：
分别称取tris24.2g，nacl80g，sds0.375g，1.0mhcl38ml，tween-2010ml，超纯水定容至1000ml。
封闭液：
用1×tbst配制10％脱脂奶粉。
bay87-2243(8mg/ml)：
使用时用无血清无双抗dmem/f12基础培养液稀释为10μm工作液浓度。
6-ohda：
使用时用无血清无双抗dmem/f12或dmem高糖基础培养液稀释为10μm工作浓度。
hif-2α转录抑制剂(hif-2αtranslationinhibitor)：
使用时用无血清无双抗dmem/f12基础培养液稀释为10μm工作浓度。
3.6细胞接种与药物处理
星形胶质细胞接种与药物处理
星形胶质细胞以1.5×105/ml的密度接种于预先铺有多聚赖氨酸六孔板中，为检测6-ohda对hif-1α、hif-2α的激活情况及相应dmt1和fpn1的蛋白表达情况，对细胞进行分组及药物处理，10μm6-ohda处理24h后收集细胞提取总蛋白。
为检测抑制hif-2α激活后对星形胶质细胞dmt1和fpn1蛋白表达的影响，以10μmhif-2αtranslationinhibitor预处理24h后，再加入10μm6-ohda共同作用24h后提取总蛋白。
为检测抑制hif-1α激活后对星形胶质细胞dmt1和fpn1蛋白表达的影响，以10μmbay87-2243预处理48h后，再加入10μm6-ohda共同作用24h后提取总蛋白。
westernblots检测6-ohda对于hif-1α、hif-2α的激活和抑制情况及相应dmt1和fpn1的蛋白表达情况。
vm神经元接种与药物处理
为检测6-ohda对vm神经元hif-1α、hif-2α的激活情况，对细胞进行分组及药物处理，10μm6-ohda处理24h后收集细胞提取总蛋白。
3.7总蛋白的提取和定量
细胞药物处理后，吸尽培养液，用预冷的pbs洗三次，每孔加入100μl细胞裂解液：ripa裂解液(强)，冰上裂解0.5h。
裂解物收集后4℃，12000rpm离心20min，将上清液转移到新的eppendorf管中。
用bca蛋白定量试剂盒检测提取蛋白浓度，将蛋白按每份30μg分装，并用0.01mpbs补至相同的体积，并加入4×loadingbuffer混匀，95℃以上水浴5min使蛋白变性，-80℃冰箱冻存。
3.8十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺(sds-page)凝胶电泳及转膜
8％分离胶(10ml)：
30％丙烯酰胺混合液2.16ml，3mol/tris-hcl2ml(ph8.8)，10％sds80μl，10％aps80μl，temed4.8μl，ddh2o3.68ml，混匀，向胶模内小心注入分离胶，留2cm左右的空间准备灌注积层胶，顶层覆盖无水乙醇隔离空气去除气泡。室温静置约0.5h至分离胶完全凝固。
5％浓缩胶(5ml)：
30％丙烯酰胺混合液500μl，0.5mtris(ph6.8)380μl，10％sds30μl，10％aps30μl，temed3μl，ddh2o2.1ml。现用现配，混匀后注入分离胶上层，勿产生气泡，并轻轻插入梳子。
将蛋白上样后，浓缩胶恒压80v，样品前沿开始进入分离胶后，恒压120v继续电泳至彩色预染蛋白质分子量标准分离完全。
将分离好的蛋白质从凝胶转移至pvdf膜，恒流300a，2h。
转膜后，浸泡于10％脱脂牛奶-tbst封闭液在摇床上震摇2h，以封闭非特异性结合位点。
用5％的脱脂奶稀释相应一抗：hif-1α1:1000,hif-2α1:1000,dmt11:800,fpn11:800,β-actin1:10000，4℃摇床孵育过夜。1×tbst缓冲液漂洗10min×3次。
加二抗(goatanti-rabbitigg，1:10000)室温震摇1h，1×tbst缓冲液漂洗10min×3次。
显色：将ecl化学发光试剂的a液和b液等体积混合，以0.125ml/cm2的量加于pvdf膜的蛋白面，室温孵育1min，去除a、b混合液。
uvp凝胶成像系统观察，拍摄图片。
条带的强弱用visionworksls图像采集和分析软件进行密度分析，实验结果以目的蛋白与内参照蛋白β-actin条带平均od值比值表示目的蛋白的表达水平。
实施例4钙黄绿素负载检测原代培养星形胶质细胞、vm神经元铁转入、转出功能
4.1实验试剂
calcein-am：molecularprobes公司产品；
6-羟基多巴胺(6-ohda)，抗坏血酸，去铁胺(dfo)：sigma公司产品；
hif-2αtranslationinhibitor：millipore公司产品
4.2实验仪器
激光共聚焦扫描显微镜：olympus公司(ix-81)，日本。
4.3液体配制
抗坏血酸溶液：
溶于0.9％生理盐水中，储存液浓度为200μg/ml。
6-ohda：
取0.2056mg溶于抗坏血酸溶液中，储存液为1mm，使用时以无血清培养液稀释为工作液浓度。
hif-2αtranslationinhibitor：
取0.5746mg溶于2mldmso中，储存液为1mm，使用时以无血清培养液x稀释为10μm工作浓度。
hepes平衡盐溶液(hbs)：20mmhepes，溶于150mmnacl，ph＝6.8。
calcein-am：
将1mgcalcein-am(mw:994.87)溶于1mldmso中，储存液浓度为1mm,
-20℃分装保存，使用时以hbs稀释为0.5μm的工作浓度。
硫酸亚铁溶液：
称取2.7802mg硫酸亚铁溶于10ml含77.4972mg的维生素c的hbs内(摩尔比为1:44)，终浓度为1mm，现用现配。
dfo：
称取65.68mgdfo溶于10mlhbs内，终浓度为1mm，现用现配。
hif-2αtranslationinhibitor：
使用时用无血清无双抗dmem/f12基础培养液稀释为10μm工作浓度。
4.4星形胶质细胞接种与药物处理
原代培养星形胶质细胞种植于24孔板中，孔中放置多聚赖氨酸处理过的盖玻片，种植密度为5×104/孔，星型胶质细胞培养48h后，吸出培养液，37℃预热dmem/f12基础培养液轻柔漂洗一遍，分组处理细胞，每组6个孔，置于37℃、5％co2培养箱中培养继续培养24h，吸出培养液，37℃预热hbs漂洗1次，加入钙黄绿素(0.5μm)于37℃孵箱中负载0.5h，然后用hbs冲洗三次，进行检测。
4.5铁转入、转出实验
calcein-am是一种膜通透性的非荧光性的分子，在细胞内被胞浆酯酶裂解为钙黄绿素后，为膜非通透性的胞浆染料及金属敏感性的荧光探针，由荧光素、甲醛和亚氨乙酸缩合而成，不受溶液ph值的影响，稳定性强。钙黄绿素对二价金属离子都有较高的亲和力，能够与细胞内的多种二价金属离子结合后转化成非荧光物质，导致荧光的淬灭，本实验体系中去除mg2+、ca2+等其他二价金属离子，仅用fe2+溶液进行灌流，保证细胞内钙黄绿素是因与fe2+结合引起荧光改变，通过测定荧光强度的降低程度来估计细胞内可螯合铁的水平。钙黄绿素的荧光强度与细胞内自由铁的含量成反比，当细胞内铁水平增高时与calcein结合，荧光淬灭、强度降低，反之则升高。故钙黄绿素结合激光共聚焦技术可动态监测细胞内自由铁的水平。
将上述实验中24孔板内接种了细胞的盖玻片放到特制的灌流槽中。在蠕动泵的作用下，灌流的液体可以恒定速度和温度进入灌流槽，而不影响盖玻片上细胞。灌流槽放置olympusix81型激光共聚焦显微镜下，在20×物镜下，以x-y-z模式扫描。激发光波长选用488nm，发射光波长选用525nm。首先以1mm的硫酸亚铁溶液进行灌流，设置时间序列扫描为间隔3min扫描一次，每次扫描时间3.5sec，共扫描10次。然后将灌流液更换为37℃预热hbs漂洗2min，最后更换为1mmdfo，扫描设置同前。实验结果用fluoview5.0软件进行分析。在每个视野中选择不重叠的4个区域，共选择25-30个单细胞进行荧光强度分析，每一处理组共进行6次单独的实验。
实施例5统计学处理
实验结果以均数±标准
结果说明
1.6-ohda处理的星形胶质细胞激活hif-1α和hif-2α
应用免疫印迹技术，观察10μmol/l6-ohda处理的星形胶质细胞hif-1α和hif-2α的蛋白表达的变化。如图1所示，10μmol/l6-ohda处理24小时，星形胶质细胞中的hif-1α蛋白表达量与正常对照组相比显著增加，约为正常对照组的2.2倍，差异有统计学意(p<0.01)。hif-2α蛋白表达量与正常对照组相比增加，约为正常对照组的1.5倍，差异有统计学意义(p<0.05)。该结果提示，6-ohda激活了星形胶质细胞中的hif-1α和hif-2α。
2.6-ohda处理vm神经元未激活hif-1α和hif-2α
为进一步确定6-ohda是否激活神经元中的hifs,加入10μmol/l6-ohda处理vm神经元24小时，观察hif-1α和hif-2α的蛋白变化情况。如图2所示，10μmol/l6-ohda处理24小时，vm神经元hif-1α的蛋白表达量与正常对照组相比均无明显变化(p>0.05)。hif-2α的蛋白表达量与正常对照组相比均无明显变化(p>0.05)。该结果提示，6-ohda未激活神经元细胞中的hif-1α和hif-2α。
3.hif-1α抑制剂bay87-2243作用于原代星形胶质细胞可以明显抑制6-ohda对于hif-1α的激活
bay87-2243是一种有效的选择性hif-1α抑制剂。10μmol/lbay87-2243预处理原代星形胶质细胞48h后，加入10μmol/l6-ohda共同作用细胞24h。bay87-2243组与正常对照组相比，hif-1α的蛋白表达量降低，差异有统计学意义(p<0.05)。6-ohda和bay87-2243共孵育组与6-ohda组相比，hif-1α的蛋白表达降低，差异有统计学意义(p<0.05)，如图3所示。结果提示：在星形胶质细胞中，bay87-2243不仅抑制了hif-1α的表达，同时也抑制了6-ohda对hif-1α的激活。
4.hif-1α不参与6-ohda对原代培养星形胶质细胞内dmt1的表达调控
为进一步验证星形胶质细胞中hif-1α是否参与调控了6-ohda对dmt1的上调，我们应用westernblots技术，观察星形胶质细胞中hif-1α被抑制后dmt1的蛋白表达变化。本实验结果显示10μmol/l6-ohda处理24h,星形胶质细胞中的dmt1的表达量与正常对照组相比显著上调，差异有统计学意义(p<0.01)。10μmol/lbay87-2243处理星形胶质细胞72小时，dmt1的表达量与正常对照组相比并没有明显变化。10μmol/lbay87-2243预处理原代星形胶质细胞48h后，加入10μmol/l6-ohda共同作用24h，bay87-2243和6-ohda共孵育组与6-ohda组相比，无显著变化，但与正常对照组相比，dmt1的表达明显上调，差异有统计学意义(p<0.05),如图4所示。结果提示：星形胶质细胞中bay87-2243并未抑制住6-ohda引起的dmt1的上调，hif-1α不参与调控6-ohda对dmt1的上调。
5.hif-1α不参与6-ohda对原代培养星形胶质细胞内fpn1的表达调控
为进一步验证星形胶质细胞中hif-1α是否也参与调控了6-ohda对fpn1的上调，我们应用westernblots技术，观察星形胶质细胞中hif-1α被抑制后fpn1蛋白表达变化。本实验结果显示10μmol/l6-ohda处理24h,星形胶质细胞中的fpn1的表达量与正常对照组相比显著上调，差异有统计学意义(p<0.05)。10μmol/lbay87-2243处理星形胶质细胞72小时，dmt1的表达量与正常对照组相比并没有明显变化。10μmol/lbay87-2243预处理原代星形胶质细胞48h后，加入10μmol/l6-ohda共同作用24h，bay87-2243和6-ohda共孵育组与6-ohda组相比，fpn1的蛋白表达无显著变化，但与正常对照组相比，fpn1的表达明显上调，差异有统计学意义(p<0.05)，如图5所示。结果提示：星形胶质细胞中bay87-2243并未抑制住6-ohda引起的fpn1的上调，hif-1α不参与调控6-ohda对fpn1的上调。
6.hif-2α抑制剂hif-2α抑制剂作用于原代星形胶质细胞可以明显抑制6-ohda对于hif-2α的激活
hif-2α抑制剂是特异性作用于hif-2α亚基的一种有效的选择性hif-2α抑制剂。10μmol/lhif-2α抑制剂预处理原代星形胶质细胞24h后，加入10μmol/l6-ohda共同作用24h，hif-2α抑制剂组与正常对照组，hif-2α蛋白表达量降低，差异有统计学意义(p<0.05)。6-ohda和hif-2α抑制剂共孵育组与6-ohda组相比，hif-2α的蛋白表达量明显下降，差异有统计学意义(p<0.01)，如图6a所示。该结果提示：在星形胶质细胞中，hif-2α抑制剂不仅抑制了hif-2α的表达，同时也抑制了6-ohda对hif-2α的激活。
7.hif-2α参与6-ohda对原代培养星形胶质细胞内dmt1的表达调控
为阐明hif-2α是否参与调控了星形胶质细胞激活dmt1的表达，我们应用westernblots技术，观察hif-2α抑制剂作用的星形胶质细胞中dmt1的蛋白表达变化。10μmol/lhif-2α抑制剂预处理原代星形胶质细胞24h后，加入10μmol/l6-ohda共同作用细胞24h，hif-2α抑制剂组与正常对照组相比，dmt1的蛋白表达表达明显下降，差异明显有统计学意义(p<0.01)。6-ohda和hif-2α抑制剂共孵育组与6-ohda组相比，dmt1的蛋白表达下降，差异有统计学意义(p<0.05)，如图6b所示。该结果提示：在星形胶质细胞中，hif-2α参与调控了6-ohda激活dmt1的表达。
8.hif-2α参与6-ohda对原代培养星形胶质细胞内fpn1的表达调控
为阐明在星形胶质细胞中hif-2α是否参与调控了6-ohda对fpn1表达的影响，我们应用westernblots技术，观察hif-2α抑制剂作用的星形胶质细胞中fpn1的蛋白表达变化。10μmol/lhif-2α抑制剂预处理原代星形胶质细胞24h后，加入10μmol/l6-ohda共同作用细胞24h，hif-2α抑制剂组与正常对照组相比，fpn1的蛋白表达量降低，差异明显统计学意义(p<0.05)。6-ohda和hif-2α抑制剂共孵育组与6-ohda组相比，fpn1的表达明显降低，差异有统计学意义(p<0.01)，如图6c所示。结果提示：hif-2α参与调控了6-ohda对fpn1表达的上调。
9.hif-2α参与6-ohda对星形胶质细胞铁转运的调控
calcein(钙黄绿素)可以与铁结合使其转换成非荧光物质而使其荧光熄灭，研究中常把钙黄绿素作为铁的指示剂，用于估测细胞内可螯合铁的水平及进行各种铁代谢的研究，包括铁的吸收和释放。本实验应用荧光染料calcein结合共聚焦显微镜动态观察了10μmhif-2α抑制剂预处理24h后10μm6-ohda共同孵育24h，处理后原代培养星形胶质细胞铁转入功能变化。6-ohda处理24h后，首先以1mm硫酸亚铁灌流原代培养星形胶质细胞，如图7a所示，随fe2so4灌流时问延长，钙黄绿素的荧光强度不断减弱，6-ohda处理组荧光减弱较对照组明显(p<0.05)；单独应用hif-2α抑制剂对细胞摄铁功能没有明显影响；但hif-2α预处理组，细胞摄铁能力较6-ohda组较弱(p<0.05)。结果提示：6-0hda处理后，原代培养星形胶质细胞铁转入功能增强，hif-2α抑制剂可减弱此效果。
dfo(去铁草酰胺)为强有力的膜非通透性铁离子螯合剂，当灌流液更换为1mmdfo时，随细胞内的铁被转出至细胞外，细胞内的荧光强度逐渐增强。如图7b所示，6-ohda处理组在dfo灌注条件下，细胞内荧光增强较对照组明显(p<0.05)，单独应用hif-2α抑制剂对细胞摄铁功能没有明显影响；但hif-2α预处理组，细胞铁转出较6-ohda组较少(p<0.05)。结果提示：6-ohda处理后，原代培养星形胶质细胞铁转出功能增强，hif-2α抑制剂可减弱此效果。
以上结果说明，hif-2α参与6-ohda对星形胶质细胞铁转运的调控。
基于本发明上述研究实验，阐明了星形胶质细胞和神经元铁代谢方式的不同，同时证实了在星形胶质细胞内，是hif-2α,而非hif-1α，调节6-ohda对dmt1和fpn1的激活，从而影响铁转运。这一结果与相关的小肠转铁研究的结论一致，也进一步论证了星形胶质细胞在转铁功能上与小肠的极高相似度。星形胶质细胞就像外周的小肠上皮细胞，除了供自身利用外，通过dmt1摄取铁、fpn1释放铁，供神经元、少突胶质细胞和小胶质细胞利用，在铁跨血脑屏障的转运及脑铁稳态的维持中起着至关重要的作用。凡干扰星形胶质细胞铁摄取和转运的影响因素，均可引起脑铁平衡的紊乱，造成pd的发生。星形胶质细胞铁代谢的异常参与改变da能神经元铁代谢的机制，使其铁代谢功能紊乱，造成神经元铁沉积，引起da能神经元变性死亡，导致pd。而在这一过程中，hif-2α发挥调节作用，即星形胶质细胞铁代谢的作用靶点为hif-2α。本专利研究不仅为防治pd铁沉积提供了新的作用靶点hif-2α，而且也为神经细胞的高铁来源星形胶质细胞的铁转运机制提供了全新的研究思路和实验证据。对于防治pd的药物研发具有潜在的不可估量的社会和经济价值。
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