本发明涉及一种效应标志物在检测多氯联苯毒性的应用及检测方法，属于毒理学化学物毒性评价
技术领域：
：，特别涉及斑马鱼幼鱼背主动脉直径作为效应标志物在检测pcb126心血管毒性的应用及检测方法。
背景技术：
：：多氯联苯(polychlorinatedbiphenyls，pcbs)是一类共由209种同系物组成的人工合成氯代芳香烃化合物家族，由联苯苯环的氢原子被1-10个氯所取代而形成。由于其具有良好的稳定性、绝缘性和耐热性，pcbs不仅曾被广泛应用于变压器、电容器、阻燃剂、热载体等各个行业，而且还是很多的工业树脂、橡胶、塑料、涂料等当中的添加剂。但因其具有半挥发性、难降解性、高亲脂性、高生物蓄积性以及很强的毒性作用，早在2001年，就被列入12种持久性有机污染物加以控制。尽管各国相继限制并停止了对于pcbs的生产和使用。然而，目前世界各地的环境介质和生物样本中都检测到了pcbs的存在。稳定的理化性质使得pcbs难以在环境介质中降解。3,3’,4,4’,5-五氯联苯(pcb126)的结构是类二噁英样的共面分子，是在人体、各种生物样本和环境介质中广泛大量检出的最具代表性，毒性最强的一类pcb。现有用于评价pcb126暴露的生物学效应的靶标技术多为以传统啮齿类哺乳动物(小鼠、大鼠等)和体外细胞模型中进行的实验。其主要评价指标为致癌、致畸、内分泌干扰效应、氧化应激等；主要机制为芳烃受体(ahr)的诱导激活，受实验模型(生命周期长、耗时、价格昂贵)和实验技术(通量小、需求初始样本量大、灵敏度低)的固有限制无法在pcb126急性暴露的条件下快速、准确，可靠和敏感地进行危险度评价。因此，亟待在此基础上建立开发新的快速、准确、可靠和敏感评价靶标，对pcb126急性暴露的心血管潜在风险进行早期风险评估和健康预警，为保护环境，监测评价和相关技术标准的制定提供参考依据。技术实现要素：为了克服现有技术的不足，本发明目的是提供斑马鱼幼鱼背主动脉直径作为效应标志物在检测pcb126心血管毒性的应用，可以稳健、可靠和敏感的评价环境水平pcb126急性暴露的生物学效应，有助于表征环境水平低剂量的pcb126暴露所致的心血管毒性。本发明的另一目的是提供斑马鱼幼鱼背主动脉直径的检测方法，该方法快速、准确、可靠且敏感。为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：本发明提供斑马鱼幼鱼的背主动脉直径作为效应标志物在检测pcb126心血管毒性的应用。进一步地，所述斑马鱼幼鱼背主动脉直径是斑马鱼鱼卵于受精2小时内进行pcb126染毒处理，培养后固定体位进行图像采集，进行测量所得。进一步地，所述斑马鱼幼鱼为血管内皮细胞标记绿色荧光的转基因斑马鱼幼鱼；所述培养于26.5℃，14h光照/10h黑暗循环的光照恒温培养箱中进行培养；培养至72hpf；所述斑马鱼幼鱼固定体位前进行成像前处理，包括对未孵化的胚胎去除绒毛膜、麻醉斑马鱼幼鱼的步骤；所述固定体位为将培养板中的斑马鱼幼鱼调整为腹侧朝向同一方向，双眼重合；所述图像采集使用高内涵成像系统进行层扫，获取斑马鱼幼鱼血管荧光图；所述测量为使用photoshop软件测量背主动脉的血管直径，使用excel记录相应原始数据，后使用软件graphpadprism进行统计分析。更进一步地，所述培养至72hpf还包括每隔24小时更新染毒液，并从24hpf额外添加ptu(n-苯基硫脲)以抑制色素生成的步骤。所述固定体位使用琼脂糖凝固包被固定；所述使用高内涵成像系统进行层扫，选择488nm激发通道，10倍物镜下采用共聚焦模式进行；所述使用软件graphpadprism8.0统计分析，还包括采用非线性回归中的四参数剂量反应曲线模型拟合剂量-反应曲线。本发明提供一种测量斑马鱼幼鱼背主动脉直径评估pcb126心血管毒性的方法，包括以下步骤：1)pcb126暴露与鱼卵培养：斑马鱼鱼卵于受精2小时内进行pcb126染毒处理后进行培养；2)成像前处理：包括对未孵化的胚胎去除绒毛膜、麻醉斑马鱼幼鱼、固定体位的步骤；3)图像采集：使用高内涵成像系统进行层扫，获取斑马鱼幼鱼血管荧光图；4)测量：使用photoshop软件测量背主动脉的血管直径，使用excel记录相应原始数据；5)统计分析：使用软件graphpadprism进行统计分析，并拟合剂量-反应曲线。进一步地，步骤1)中，所述斑马鱼幼鱼为血管内皮细胞标记绿色荧光的转基因斑马鱼幼鱼；所述培养于26.5℃，14h光照/10h黑暗循环的光照恒温培养箱中进行培养；培养至72hpf。更进一步地，步骤1)中，所述培养至72hpf还包括每隔24小时更新染毒液，并从24hpf额外加添加ptu(n-苯基硫脲)以抑制色素生成的步骤。进一步地，步骤2)中，所述麻醉为使用0.03％三卡因麻醉斑马鱼幼鱼；所述固定体位为将培养板中的斑马鱼幼鱼调整为腹侧朝向同一方向，双眼重合。更进一步地，步骤2)中，所述固定体位使用琼脂糖包被的培养板，使用定位模具待琼脂糖凝固制得。进一步地，步骤3)中，所述使用高内涵成像系统进行层扫，选择488nm激发通道，10倍物镜下采用共聚焦模式进行。进一步地，步骤4)中，所述使用photoshop软件测量背主动脉的血管直径为使用标尺工具。更进一步地，步骤4)中，所述使用photoshop软件测量背主动脉的血管直径具体步骤如下：a.使用photoshop的标尺工具，启用测量记录窗口；b.测每一个体节处的da直径；c.测量完成后导出测量记录到excel表中，求均值。进一步地，步骤5)中，所述使用软件graphpadprism进行统计分析，并拟合剂量-反应曲线具体步骤如下：a.打开graphpadprism8.0软件，新建“xy”类型的数据集及统计图“newtable&graph”；b.导入前述excel表数据，对x轴坐标数据即染毒剂量水平的进行对数转换；c.对该转换完成后的新数据集，拟合四参数剂量-反应曲线模型；d.得到相应的剂量-反应曲线具体参数(ec50，r2)和统计图形。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本技术发明将斑马鱼幼鱼背主动脉(da)直径作为评价pcb126急性暴露的敏感指标，可以稳健、可靠和敏感的评价环境水平pcb126急性暴露的生物学效应，有助于表征环境水平低剂量的pcb126暴露所致的心血管毒性，为环境监测评价保护和相关技术标准的制定提供技术方法和参考依据，保护人民健康，促进社会经济发展。附图说明图1为96孔板的插入定位模具；图2为对比试验例中获得的血管表型数据的统计图；图中：a为背主动脉直径(dadiameter)；b为总主静脉面积(ccvarea)；c为肠下静脉丛血管覆盖卵黄囊的面积(sivvascularizedyolkarea)；d为肠下静脉丛的血管面积(sivarea)；e为心包面积(pericardiumarea)；f为siv出芽数(sivsprouting)；g为siv孔洞数(latticeofsiv)；h为体节间血管的异常出芽数(isvaberrantsprouting)；数据使用均数±标准误表示，n＝20-25，与对照组相比：*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001；图3为对比试验例中的剂量-反应曲线；图中：a为背主动脉直径(dadiameter)；b为体节间血管的异常出芽数(isvaberrantsprouting)；c为siv出芽数(sivsprouting)；d为siv孔洞数(latticeofsiv)；e为心包面积(pericardiumarea)；数据使用均数±标准误表示，n＝20-25。具体实施方式本发明利用高内涵成像系统对暴露于pcb126的转基因(血管内皮细胞标记绿色荧光)斑马鱼幼鱼(72hpf)进行快速的血管荧光图像采集，结合photoshop、graphpadprism软件来测定图像背主动脉直径和统计分析数据。使用该方法得到的da直径参数指标可以稳健、可靠而又敏感地评价pcb126急性暴露致斑马鱼幼鱼心血管毒性。photoshop和graphpadprism软件可用其他具有相同或相似功能的图像处理软件或统计分析绘图软件代替，以达到同等的效果。本发明背主动脉直径测定和统计分析方法如下：一、pcb126暴露与鱼卵培养：将tg(kdrl:egfp)转基因斑马鱼鱼卵于受精2小时内根据剂量设计进行pcb126染毒处理，于26.5℃，14h光照/10h黑暗循环的光照恒温培养箱中培养至72hpf。每隔24小时更新染毒液，并从24hpf开始额外加添加ptu(n-苯基硫脲)以抑制色素生成。二、制备琼脂糖包被的96孔微孔板：使用多通道移液枪将65μl2.5％热琼脂糖填充到玻底96孔板中。插入定位模具(3d打印定制，如图1)，待琼脂糖凝固(室温下至少15分钟)，小心地取下定位模具。三、成像前处理：1.去膜：使用尖镊在体视镜下对未孵化的胚胎去除绒毛膜；2.麻醉：使用0.03％三卡因麻醉斑马鱼幼鱼；3.固定与定向：将胚胎转移到琼脂糖包被的96孔板中，每孔一条。在体视镜下使用弯镊调整幼鱼体位，使其腹侧朝左，双眼重合。四、图像数据采集：使用高内涵成像系统，选择488nm激发通道，10倍物镜下采用共聚焦模式进行层扫，获取斑马鱼幼鱼血管荧光图。五、图像分析：使用adobephotoshop软件的标尺工具测量背主动脉的血管直径，使用excel记录相应原始数据。a.使用photoshop打开所获取的斑马鱼血管荧光图，选择软件工具栏里的标尺工具，并在菜单栏的窗口中启用测量记录窗口，然后放大图像至能分辨清背主动脉的边界的适宜程度；b.从约第四体节开始测定da的直径，测定da直径的标尺线必须垂直于两侧血管壁，每一体节测定一次直径，每测一个体节处da的直径就点击一下测量记录，直到测量到da与尾动脉(ca)交界处(约为卵黄囊的最下缘)，完成该个体的da直径测定；c.导出测量记录到excel表中，求得这些da直径的算术均值作为此斑马鱼幼鱼个体72hpf的da直径。另外也可以进行“设置测量比例”，具体方法如下：1.先使用标尺测得图中比例尺500μm对应的像素值为415pxs；2.再依次点开菜单栏图像-分析-设置测量比例-自定；3.将像素长度值“415”输入“测量比例”项下“像素长度”的空格栏中；将实际长度值“500”输入“逻辑长度”的空格栏中；将实际长度值的单位“μm”输入“逻辑单位”的空格栏中，点击确定完成；此后勾选上标尺工具选项里的“设置测量比例”，标尺工具测定的都是实际长度。六、统计分析使用统计软件graphpadprism8.0对获得的不同剂量组的da直径进行统计分析，并采用非线性回归中的四参数剂量反应曲线模型拟合剂量-反应曲线，描绘pcb126狭窄da管径的ec50，描述此标靶作为评价pcb126急性暴露生物标志物所具有的极高敏感性，并同时兼备的稳健性和准确性。a.打开graphpadprism8.0软件，新建“xy”类型的数据集及统计图“newtable&graph”；b.在datatable数据集导入前述整理好的excel表数据，点击工具栏里的“analyze”-“transform”-“ok”，在新打开的“parameters:transform”对话框里选择“transformxvalueusingx＝log(x)”-“ok”，从而完成对x轴坐标数据即染毒剂量水平的对数转换；c.选择该转换完成后生成的新数据集，点击工具栏里的“analyze”-“xyanalyze”-“nonlinearregression(curvefit)”-“ok”，在新打开的“parameters:nonlinearregression”对话框里选择“dose-response-inhibition-“log(inhibitor)vs.normalizedresponse-variableslope”-“ok”；d.软件将计算得到相应的剂量-反应曲线的具体参数，如ec50,r2(在results中的nonlinfitoftransformofdata查看)和统计图(在graphs中查看)。现结合附图与具体实施例对本发明作进一步说明。实施例斑马鱼幼鱼背主动脉直径测定和统计分析：一、pcb126暴露与鱼卵培养：将tg(kdrl:egfp)转基因斑马鱼鱼卵于受精2小时内根据进行pcb126染毒处理，染毒剂量根据文献报导和本实验室前期研究基础设计为：0，0.0003，0.3，3，30，100，300μg/l,于26.5℃，14h光照/10h黑暗循环的光照恒温培养箱中培养至72hpf。每隔24小时更新染毒液，并从24hpf开始额外加添加ptu(n-苯基硫脲)以抑制色素生成。二、制备琼脂糖包被的96孔微孔板：使用多通道移液枪将适量的2.5％热琼脂糖填充到玻底96孔板中。插入3d打印定制的定位模具(如图1所示)，待琼脂糖凝固(室温下至少15分钟)，小心地取下定位模具。三、成像前处理：1)去膜：使用尖镊在体视镜下对未孵化的胚胎去出绒毛膜；2)麻醉：使用0.03％三卡因麻醉斑马鱼幼鱼；3)固定与定向：将胚胎转移到琼脂糖包被的96孔板中，每孔一条。在体视镜下使用弯镊调整幼鱼体位，使其腹侧朝左，双眼重合。四、图像数据采集：使用高内涵成像系统(operettacls,prikinelmer,usa)，选择488nm激发通道和明场通道，在10倍物镜下采用共聚焦模式进行层扫，分别获取斑马鱼幼鱼血管荧光图和明场图片。五、图像分析与数据获取a.使用photoshop打开所获取的斑马鱼血管荧光图，选择软件工具栏里的标尺工具，并在菜单栏的窗口中启用测量记录窗口，然后放大图像至能分辨清背主动脉的边界的适宜程度；b.从约第四体节开始测定da的直径，测定da直径的标尺线必须垂直于两侧血管壁，每一体节测定一次直径，每测一个体节处da的直径就点击一下测量记录，直到测量到da与尾动脉(ca)交界处(约为卵黄囊的最下缘)，完成该个体的da直径测定；c.导出测量记录到excel表中，求得这些da直径的算术均值作为此斑马鱼幼鱼个体72hpf的da直径。六、统计分析使用统计软件graphpadprism8.0对获得的不同剂量组的da直径进行统计分析，并采用非线性回归中的四参数剂量反应曲线模型拟合剂量-反应曲线，描绘pcb126狭窄da管径的ec50，描述此标靶作为评价pcb126急性暴露生物标志物所具有的极高敏感性，并同时兼备的稳健性和准确性。a.打开graphpadprism8.0软件，新建“xy”类型的数据集及统计图“newtable&graph”；b.在datatable数据集导入前述整理好的excel表数据，点击工具栏里的“analyze”-“transform”-“ok”，在新打开的“parameters:transform”对话框里选择“transformxvalueusingx＝log(x)”-“ok”，从而完成对x轴坐标数据即染毒剂量水平的对数转换；c.选择该转换完成后生成的新数据集，点击工具栏里的“analyze”-“xyanalyze”-“nonlinearregression(curvefit)”-“ok”，在新打开的“parameters:nonlinearregression”对话框里选择“dose-response-inhibition”-“log(inhibitor)vs.normalizedresponse-variableslope”–“ok”；d.软件将计算得到相应的剂量-反应曲线的具体参数，如ec50,r2(在results中的nonlinfitoftransformofdata查看)和统计图(在graphs中查看)。对比试验例实验步骤与实施例相同，在photoshop中测量da直径外，加测以下指标：总主静脉面积(ccvarea)、肠下静脉丛的血管面积(sivarea)和其覆盖卵黄囊的面积(sivvascularizedyolkarea)、心包面积(pericardiumarea)、siv出芽数(sivsprouting)、siv孔洞数(latticeofsiv)、体节间血管的异常出芽数(isvaberrantsprouting)。测量方法：使用套索工具对总主静脉的外缘描边以获得总主静脉面积(ccvarea)；使用套索工具对肠下静脉的外缘和内孔进行描边以获得肠下静脉丛的血管面积(sivarea)和其覆盖卵黄囊(sivvascularizedyolkarea)的面积；使用套索工具对明场图片的心包外缘描边以获得心包面积(pericardiumarea)；使用计数工具对siv形成的孔洞数和其下缘的血管出芽数分别计数，以获得siv出芽数(sivsprouting)和siv孔洞数(latticeofsiv)；使用计数工具对体节间血管的异常血管出芽数进行计数，以获得体节间血管的异常出芽数(isvaberrantsprouting)。为比较所获得8种的血管表型毒性指标对应响应pcb126急性暴露的敏感性，首先使用spss中的单因素方差分析(anova)中的线性趋势检验(lineartrendtest)来表征剂量-反应关系是否存在，结果见表1，可知dadiameter，心包面积(pericardiumarea)，体节间血管的异常出芽数(isvaberrantsprouting)，siv出芽数(sivsprouting)，siv孔洞数(latticeofsiv)这5个指标p＜0.05得以筛出，存在较良好的剂量-反应关系，可以进一步表征其敏感性。表1线性趋势检验对于低剂量的敏感性表征我们通过采用美国环保署(usepa)开发的bmds(bmd软件)来计算这5个指标的bmd(基准反应剂量)和bmdl(bmd95％置信区间的下限)，结果见表2，可知bmds只有对于dadiameter的响应数据可以拟合出viable的bmd及bmdl值(p＝0.32＞0.1)，此时的aic(赤池信息量原则)值最小，且bmd和bmdl值最低。可知这5个指标中dadiameter的敏感度最高。表2bmd和bmdl的估值最后并使用统计软件graphpadprism8.0对获得的血管表型数据进行统计图的绘制，见图2(a-h)；采用非线性回归中的四参数剂量反应曲线模型拟合剂量-反应曲线，描绘所建模曲线的拟合程度r2和各指标作用的ec50(半数效应浓度)，见图3(a-e)。可知dadiameter的r2高达0.931，拟合度好，数据的稳健性和准确度高。综上所述，我们描述了dadiameter标靶作为评价pcb126急性暴露生物标志物技术所具有的极高敏感性，并同时兼备的稳健性和准确性。本发明并不局限于上述实施方式，如果对本发明的各种改动或变型不脱离本发明的精神和范围，倘若这些改动和变型属于本发明的权利要求和等同技术范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变动。当前第1页1 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