一种沉香曲的质量控制方法与流程

本发明属于中药制剂控制领域，具体涉及一种沉香曲的质量控制方法。
背景技术：
：沉香曲为中药复方制剂，源于卫生部药品标准中药成方制剂第17册，由沉香、木香、柴胡、厚朴(姜制)、豆蔻、砂仁、郁金、防风、葛根、乌药、枳壳(麸炒)、陈皮、桔梗、槟榔、麦芽(炒)、谷芽(炒)、前胡、青皮(麸炒)、白芷、檀香、降香、羌活、藿香和甘草等24味药物组成。具有疏表化滞、舒肝和胃的功效，可用于表邪未尽、肝胃气滞、胸闷脘胀、胁肋作痛、吞酸呕吐等症的治疗。该质量标准仅对沉香曲的性状和水分进行了控制，未对处方中的任何药物进行定性鉴别或定量测定研究，无法确保产品质量和有效性。为确保临床疗效，保证产品质量。许红莉等人报道了一种高效液相色谱法测定沉香曲中羌活醇、异欧前胡素、木香烃内酯和去氢木香内酯的含量(中南药学2014年2月第12卷第2期，第161-165页)，通过这些活性物质的含量来对沉香曲的质量进行评价，不过该方法仅仅对部分活性物质进行了鉴定，仍然无法从整体上对沉香曲的质量进行准确的判断。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是提供了一种沉香曲的质量控制方法，该质量控制方法能对沉香曲的进行更加科学准确的鉴别，从而能更有效地控制沉香曲的质量。为解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：一种沉香曲的质量控制方法，包括以下步骤：(1)将待测沉香曲配制成待测液，注入高效液相色谱仪中进行高效液相色谱检测，得到待测物的高效液相色谱图；(2)将得到的高效液相色谱图与沉香曲的指纹图谱进行比较，确定待测样品图谱与所述的指纹图谱的相似度，根据相似度的值来判定待测样品质量是否合格；所述的沉香曲的指纹图谱包含20个特征峰，并且具有如下特征峰：2号峰：相对保留时间范围为0.508～0.512；3号峰：相对保留时间范围为0.582～0.585；6号峰：相对保留时间范围为0.708～0.714；7号峰：相对保留时间范围为0.768～0.773；10号峰：相对保留时间范围为1；11号峰：相对保留时间范围为1.057～1.059；12号峰：相对保留时间范围为1.149～1.153；13号峰：相对保留时间为1.793～1.815；15号峰：相对保留时间范围为1.905～1.929；18号峰：相对保留时间范围为2.196～2.198；19号峰：相对保留时间范围为2.205～2.235。作为进一步优选，所述的沉香曲的指纹图谱如图1所示。作为优选，步骤(1)中，所述待测液的配制方法如下：取沉香曲粉末2g，精密称定，精密加入甲醇10ml，称重，加热回流1h，冷却称重，用甲醇补足减轻的重量，混匀，静置，取上清液，经0.22μm微孔滤膜滤过，得到所述待测液。作为优选，步骤(1)中，高效液相色谱检测的条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.1％甲酸溶液为流动相a，乙腈为流动相b，进行梯度洗脱；流速：1.0ml/min，柱温为35℃，检测波长为252nm，进样量为5μl。作为优选，步骤(2)中，采用相似度软件进行处理，确定待测样品图谱与所述的指纹图谱的相似度，若相似度在0.8以上，判定产品质量合格。其中，所述的相似度软件可以为“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”2012版软件进行分析。除了指纹图谱之外，本发明还通过其他的手段辅助判断沉香曲的质量，作为优选，该方法还包括以下步骤：根据高效液相色谱图计算沉香四醇和升麻素苷的含量，然后将该含量与标准值进行比较，当含量高于标准值时，判断产品质量合格。作为优选，具体的标准如下：以沉香四醇(c17h18o6)计，沉香曲每1g在0.020mg以上，以升麻素苷(c22h28o11)计，沉香曲每1g在0.048mg以上时，判定产品质量合格。此外，在测定高效液相色谱之前，先进行初步判断；所述的初步判断为显微鉴别和/或薄层鉴别。作为优选，所述的显微鉴别方法如下：取待测沉香曲，研碎，置显微镜下观察，若含有广藿香、谷芽、麦芽、槟榔四味药材粉末的显微特征，则初步判断产品质量合格。作为优选，所述的薄层鉴别方法如下：(a)取待测沉香曲粉末，精密称定，精密加入甲醇，混匀，静置，取上清液，经0.22μm微孔滤膜滤过，得到待测样品；(b)将待测样品和对照品在薄层板上进行点板，然后在展开剂中进行展开，展开结束后，根据待测样品与对照品的斑点位置，判断产品质量是否合格。作为优选，所述的对照品为葛根、枳壳、木香和广藿香。同现有技术相比，本发明的有益效果体现在：(1)本发明的指纹图谱对沉香曲的关键组分能够实现较好的分离和标识，避免其他组分的干扰，具有较高的灵敏度。(2)本发明还通过其他的手段，对沉香曲的能够进行辅助鉴别，对沉香曲的质量能够进行全面的判断。附图说明图1为本发明得到的沉香曲的指纹图谱；图2为本发明实施例4得到是10批供试品的色谱图；图3为本发明实施例7采用不同提取溶剂得到的色谱图，其中，图3(a)的提取溶剂为30％甲醇，图3(a)的提取溶剂为50％甲醇，图3(c)的提取溶剂从上到下依次为70％甲醇，100％甲醇和纯水。图4为本发明实施例8采用不同提取方法得到的色谱图，其中，图4(a)的方法为静置，图4(b)的方法为超声，图4(c)的方法为回流提取。图5为本发明实施例9采用不同提取时间得到的色谱图，其中，图5(a)提取时间为0.5h，图5(b)提取时间为1.0h，图5(c)提取时间为2.0h。图6为本发明实施例10采用不同色谱柱得到的色谱图，其中，图6(a)采用的是zorbaxsb-c18色谱柱，图6(b)采用的是eclipseplus-c18色谱柱，图6(c)采用的是extend-c18色谱柱。图7为本发明实施例11采用不同色谱柱得到的色谱图，其中，图7(a)为210nm，图7(b)为230nm，图7(c)为252nm，图7(d)为280nm，图7(e)为300nm；图8为本发明实施例12采用不同色谱柱得到的色谱图，其中，图8(a)为25℃，图8(b)为35℃，图8(c)为40℃；图9为本发明实施例13采用不同色谱柱得到的色谱图，其中，图9(a)为0.8ml/min，图9(b)为1.0ml/min，图9(c)为1.2ml/min。具体实施方式实施例1显微鉴别取待测样品适量，研碎，置显微镜下观察，非腺毛1～6细胞，平直或先端弯曲，长约至590μm，壁具疣状突起，有的胞腔含黄棕色物(广藿香)。稃片表皮细胞淡黄色，回行弯曲，壁较厚，微木化，孔沟明显(谷芽)。稃片外表皮细胞黄色，长细胞与栓质细胞及硅质细胞相间排列，长细胞长56～184μm，直径8～19μm，壁较厚，深波状弯曲，有纹孔；栓质细胞弯月形，内含棕色物；硅质细胞较小，扁圆形。表皮上易见刺毛或毛痂，有时可见气孔(麦芽)。内胚乳细胞白色，多角形，壁厚，纹孔大，含油滴及糊粉粒(槟榔)。实施例2薄层鉴别(1)取本品适量，研碎，取约4.2g，加甲醇10ml，超声处理30分钟(功率100w，频率37khz)，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。取葛根对照药材0.2g，枳壳对照药材0.2g，同法分别制成对照药材溶液。另取葛根素和柚皮苷对照品，加甲醇分别制成每1ml含0.5mg的溶液，分别作为对照品溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取上述五种溶液各4μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(7:2.5:0.25)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与葛根对照药材色谱和葛根素对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；喷以3％三氯化铝乙醇溶液，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与枳壳对照药材色谱和柚皮苷对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。(2)取本品适量，研碎，取约4.2g，加甲醇10ml，超声处理30分钟(功率100w,频率37khz)，滤过，取滤液作为供试品溶液。取木香对照药材0.2g，广藿香对照药材0.3g，同法分别制成对照药材溶液。另取去氢木香内酯和百秋李醇对照品，加甲醇分别制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取上述四种溶液各5μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以环己烷-甲酸乙酯-甲酸(15:5:1)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色淸晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。实施例3含量测定以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相a，0.1％甲酸溶液为流动相b，进行梯度洗脱；检测波长为252nm。理论板数按沉香四醇峰计算应不低于6000。取沉香四醇对照品、升麻素苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含沉香四醇47μg，升麻素苷23.5μg的混合溶液，即得对照品溶液。取沉香曲适量，研碎，过三号筛，取约2g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入甲醇10ml，称定重量，水浴回流1小时(70℃)，放冷，再称定重量，用提取溶剂补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液，滤过，即得供试品溶液。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定。所述(3)含量测定的成分限定为：本品含沉香以沉香四醇(c17h18o6)计，沉香曲每1g不得少于0.020mg，含防风以升麻素苷(c22h28o11)计，沉香曲每1g不得少于0.048mg。实施例4指纹图谱的建立一、供试品及对照品溶液的制备取沉香曲粉末2g，精密称定，精密加入甲醇10ml，称重，加热回流1h，冷却称重，用甲醇补足减轻的重量，混匀，静置，取上清液，经0.22μm微孔滤膜滤过，即得。分别取沉香四醇、去甲基异波尔定、升麻素苷、葛根素、柚皮苷、异欧前胡素、新橙皮苷对照品，用甲醇溶解分别配成1.0mg/ml的对照品储备液，橙皮苷配成饱和溶液。再将以上单标配成100ug/ml混标，并在4℃下避光保存备用。二、色谱条件色谱柱：agilentzorbaxsb-c18(250mm×4.6mm,5μm)洗脱程序：a(0.1％甲酸水)-b(乙腈)t/min流动相a(％)流动相b(％)09553～895→905→108～2390→8010→2023～3880→7920→2138～4279→7521→2542～5275→5825→4252～7458→3042→7074～7830→2070→8078～7920→080→10079～840100流速：1.0ml/min柱温：35℃检测波长：252nm进样量：5μl三、沉香曲指纹图谱的建立3.1色谱图的测定取10批沉香曲，按第一条方法分别制备供试品溶液，按第二条方法色谱分析，得到的色谱如图2所示。在10批供试品溶液液相图谱中，柚皮苷色谱峰分离度较好，峰面积较大且稳定，保留时间合适，故确定10号柚皮苷色谱峰为参照峰。3.2共有峰标定将10批沉香曲溶液hplc图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”2012版进行色谱峰匹配，经处理后共标定20个共有峰。其保留时间如表1和表2所示，指纹图谱结果见图1。表110批沉香曲考察(保留时间)表210批沉香曲考察(相对保留时间)3.3特定峰的指认以高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱分析，并通过对照品比对，共指认11个共有峰，分别为去甲基异波尔定、葛根素、升麻素苷、沉香四醇、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷b、木香烃内酯、异欧前胡素，质谱信息详见下表。表3沉香曲质谱鉴定信息3.4相似度评价利用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”2012版软件进行分析，10批沉香曲供试品色谱图中特征共有峰的相对保留时间的rsd均小于1％，色谱图相似度均＞0.930，表明批次间差异较小，制备工艺稳定，方法准确可靠，相似度评价结果见表4。表4.10批沉香曲指纹图谱相似度评价实施例5精密度实验取沉香曲粉末2.0g，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，精密吸取同一份供试品溶液5μl，依照上述色谱条件连续进样6次，结果见表5至表9。结果表明本法共有峰的相对保留时间rsd均不大于0.5％，相对峰面积rsd均不大于5.0％，精密度良好。表5精密度考察(峰面积)表6精密度考察(相对峰面积)表7精密度考察(保留时间)表8精密度考察(相对保留时间)表9精密度相似度评价实施例6重复性实验取同一批样品6份，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液5μl，依照上述色谱条件进样，结果见表10～表14。结果表明本法共有峰的相对保留时间rsd均不大于0.5％，相对峰面积rsd均不大于5.0％，表明所用方法重复性良好。表10重复性考察(峰面积)表11重复性考察(相对峰面积)表12重复性考察(保留时间)表13重复性考察(相对保留时间)表14重复性相似度评价实施例7稳定性实验取沉香曲粉末2.0g，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液5μl，分别在0h、2h、4h、8h、12h、24h进样，结果见表15至表19。以柚皮苷的保留时间和峰面积为参照，计算各共有峰相对保留时间的rsd均小于0.5％，相对峰面积的rsd均小于5％，表明样品溶液在24h内稳定。表15稳定性考察(峰面积)表16稳定性考察(相对峰面积)表17稳定性考察(保留时间)表18稳定性考察(相对保留时间)表19稳定性相似度评价实施例7采用了不同的极性提取溶剂30％甲醇，50％甲醇，70％甲醇，100％甲醇，纯水对沉香曲样品进行提取。结果如图3所示。经过实验对比，发现五种提取溶剂对应的色谱图中峰的数量和峰面积差异明显，且在纯甲醇为提取溶剂时，峰型及分离度较好，且峰的信息量较多。因此，最终选择纯甲醇为提取溶剂。实施例8采用了不同的提取方式，主要包括静置，超声，回流。通过这三种提取方式对沉香曲样品进行提取方式的考察。结果如图4所示。经过实验对比，静置提取的色谱图中峰面积最低，超声提取的色谱图的峰面积较高，而在回流提取方式下，峰面积，峰型及分离度较好，且峰的信息量较多。因此最终选择回流为沉香曲指纹图谱的提取。实施例9采用了不同的时间进行考察，0.5h，1.0h，2.0h对沉香曲样品进行提取。结果如图5所示。经过实验对比，回流时间对实验影响不大，但在1h提取时间下各色谱峰信息较多且分离度较好，综合考虑后选择1h为提取时间。实施例10色谱柱的考察其它色谱条件不变，采用zorbaxsb-c18色谱柱，eclipseplus-c18色谱柱，extend-c18。分别考察3根色谱柱的耐用性，3根色谱柱的填料、柱长等信息见表20。各自对应的色谱图见图6。结果表明该方法耐用性良好。表20各个柱子的参数实施例11本实验考察了检测波长的影响，考察的波长分别设为210nm、230nm、252nm、280nm、300nm，结果见图7。在252nm下基线平稳，峰型及分离度较好，且峰的信息量较多，因此选择252nm作为沉香曲指纹图谱的检测波长。实施例12考察的柱温分别设为25℃，35℃，40℃，结果见图8。在35℃下基线平稳，峰型及分离度较好，且峰的信息量较多，因此选择35℃作为沉香曲指纹图谱的柱温。实施例13流速的考察考察的流速分别设为0.8ml/min，1.0ml/min，1.2ml/min，结果见图9。在1.0ml/min下基线平稳，峰型及分离度较好，且峰的信息量较多，因此选择1.0ml/min作为沉香曲指纹图谱的流速。当前第1页12