一种蓟马GC-MS快速鉴定的方法与流程

本发明属于蓟马鉴定技术领域，尤其是属于一种蓟马gc-ms快速鉴定的方法技术领域。

背景技术：

蓟马(thysanoptera:thripidae)是一大类昆虫，世界已知约6000种，中国有566种。世界范围内有几百种蓟马是蔬菜、水果和观赏植物的重要害虫，它们具有较高的繁殖能力和抗药性。其中有些是蔬菜和观赏植物上的主要害虫，另一些如西花蓟马，frankliniellaoccidentalis(pergande)，是主要入侵害虫之一。除形态学分类外，分子方法主要用于蓟马鉴定方式。

最近的研究表明，昆虫的表皮碳氢化合物(chcs)被用于物种和亚种的化学分类。传统上，溶剂液体样品是提取和分析昆虫chcs的常用方法。但是对于蓟马幼虫的鉴定，仍存在技术问题，即使分类学家也不能准确进行幼虫的分类。在多数情况下需将其饲养至成虫，再根据成虫形态特征进行种类鉴定，或者需要借助分子生物学技术。此外，在入侵害虫的检疫检测过程中，当昆虫由于数量少，难以满足分子鉴定或是溶剂提取获得足够的碳氢化合物量来进行鉴定。近年来，固体进样技术可以快速、简单地提取和分析单头昆虫甚至昆虫体附属物或昆虫碎片的chc，非常适合于蓟马、蚜虫、等微小昆虫的chc分析。直接进样技术提取昆虫表皮碳氢化合物为昆虫鉴定提供了一种新的的简单、快速的方法，只需一个昆虫样品，甚至是昆虫残肢，无需溶剂溶解。

西花蓟马原产于北美，是许多蔬菜和观赏作物上的重要入侵害虫之一。自2003年在中国北京发现以来，分布于中国东南、西南和华东地区。到目前为止，这种昆虫只在从云南运来的鲜切花中检测到，而在广东省的蔬菜和观赏植物中没有检测到。花蓟马frankliniellaintonsa、黄胸蓟马thripshawaiiensis(morgan)、棕榈蓟马thripspalmi、中华简管蓟马haplothripschinensispriesner和榕管蓟马gynaikothripsficorum(marchal)是广东省蔬菜和观赏植物上常见的几种蓟马。花蓟马属和蓟马属的蓟马成虫在形态上不易鉴别，幼虫更难鉴别。因此，一种快速简便的蓟马鉴定方法对于西花蓟马的检疫监测非常重要。

技术实现要素：

本发明正是清楚认识到上述问题缺陷，提供一种蓟马gc-ms快速鉴定的方法。本发明的方法快速有效，简单便捷，可为蓟马的快速检疫尤其是成虫/幼虫检疫提供技术支持。

本发明采用如下技术方案实现。

一种蓟马gc-ms快速鉴定的方法，本发明的方法包括以下步骤：将蓟马成虫/幼虫置于昆虫表皮碳氢化合物热吸附进样装置之前，使用正构烷烃c21-c40标准品进样，获得正构烷烃标准品中各烷烃色谱峰，使用以正构烷烃保留时间为标准。

进一步为，本发明的方法包括以下步骤：计算供试样品所含表皮碳氢化合物的科瓦茨保留指数kovǎtsindice，ki：

根据以下公式计算蓟马供试样品的表皮碳氢化合物各组分的ki值：ki＝100n+100×[tr(x)－tr(n)]/[tr(n+1)－tr(n)]

“n”和“n+1”表示待鉴定样品某色谱峰的前面和后面正构烷烃的碳原子数，“tr(n)”和“tr(n+1)”为待测样品某色谱峰的前面与后面相邻正烷烃色谱峰的保留时间；“tr(x)”表示待测样品某色谱峰的保留时间。

进一步为，本发明的方法包括以下步骤：应用气相色谱与质谱联用技术，将由气相色谱分离得到的各组分通过质谱仪进行鉴定，组分的鉴定根据各组分的质谱图所得的碎片峰与分子离子峰信息，首先推断各组分分子量，再按照分子裂分的一般规律及质谱解析程序，做初步分析之后，再与epa/nzhmas、spectraldata标准谱图对照确定每个组分的结构式。

进一步为，本发明的方法包括以下步骤：应用气相色谱仪分析蓟马表皮碳氢化合物，根据所得到的每一种试虫的总离子流色谱图，分别对每一组分峰的面积积分，得到一组相应的各组分峰的面积。

进一步为，本发明的方法包括以下步骤：根据各组分的峰面积，按比例求出其组分的相对含量，以此作为试虫表皮碳氢化合物混合物中各组分的定量指标。

进一步为，本发明的方法包括以下步骤：采用主成分分析法(pca)对蓟马各个表皮碳氢化合物转换后的峰面积数据进行多元模式识别分析.

进一步为，本发明的方法包括以下步骤：利用正交线性变换，将原始变量转化为一组新的主成分变量，然后用判别分析(da)筛选出具有显著判别能力的变量。

进一步为，本发明的方法包括以下步骤：将标准设置之前包括样品制备步骤：取不同种蓟马多头成虫/若虫/幼虫于冰箱冷冻0.5h备用，取1头成虫/幼虫分别置于昆虫表皮碳氢化合物热吸附进样装置中备用；蓟马成虫/幼虫进行gc-ms图谱分析。

进一步为，本发明的方法包括以下步骤：将装有试虫的进样装置，置于进样口温度280℃，在不分流进样模式下解析5min。

进一步为，本发明的方法包括以下步骤：所述的gc-ms图谱分析参数为：色谱柱为hp-5mss:5％二甲基联苯-95％二甲基聚硅氧烷，30m×0.2mm，0.25-μm膜；炉温的程序为：起始温度80℃保持1min，以5℃/min升到200℃，保留2min，然后再以10℃/min升至280℃，保留10min；载气采用氮气，柱压为9.32psi。

本发明的有益效果为，本发明根据昆虫表皮碳氢化合物存在的种特异性，利用固体直接进样结合气象色谱质谱联用(gc-ms)技术，对西花蓟马及与其形态相近的几种常见蓟马成虫/若虫/幼虫的表皮碳氢化合物图谱进行研究，提出蓟马的gc-ms快速鉴定的方法。本发明的方法快速有效，可为海关检疫的快速通关提供必要的技术支持。

下面结合附图和具体实施方式本发明做进一步解释。

附图说明

图1六种蓟马成虫的表皮碳化合物总离子流图。(a，b:西花蓟马荷兰和北京种群，c:花蓟马，d:棕榈蓟马，e:黄胸蓟马，f:中华简管蓟马，g:榕管蓟马)；

图2六种蓟马成虫表皮碳氢化合物相对含量的判别分析图。

图3三种蓟马若虫的表皮碳化合物总离子流图。(a，b:西花蓟马荷兰和北京种群，c:棕榈蓟马，d:黄胸蓟马)。

图4三种蓟马若虫表皮碳氢化合物相对含量的判别分析图。

具体实施方式

以下为本发明的具体实施方式，仅为解释本发明的技术内容和真实有效提供必要的试验证据，不为限制本发明的保护而存在。

样品制备

取不同种蓟马多头成虫与若虫于冰箱冷冻0.5h备用，取1头成虫或若虫分别置于昆虫表皮碳氢化合物热吸附进样装置中备用。

蓟马成虫若虫进行gc-ms图谱分析。

gc-ms分析的仪器为安捷伦公司生产的气相色谱质谱联用仪7890a-5975c。

将装有试虫的进样装置，置于进样口温度280℃，在不分流进样模式下解析5min。

色谱柱为hp-5mss(5％二甲基联苯-95％二甲基聚硅氧烷，30m×0.2mm，0.25-μm膜)。

炉温的程序为：起始温度80℃保持1min，以5℃/min升到200℃，保留2min，然后再以10℃/min升至280℃，保留10min。

载气采用高纯度氮气，柱压为9.32psi。

数据分析

在样品进样前，先进样80ng正构烷烃c21-c40标准品(西格玛，美国)gc-ms。获得正构烷烃标准品中各烷烃色谱峰，以正构烷烃保留时间为标准，计算供试样品所含表皮碳氢化合物的科瓦茨保留指数(kovǎtsindice，ki)。

根据以下公式计算蓟马供试样品的表皮碳氢化合物各组分的ki值：ki＝100n+100×[tr(x)－tr(n)]/[tr(n+1)－tr(n)]

“n”和“n+1”表示待鉴定样品某色谱峰的前面和后面正构烷烃的碳原子数，“tr(n)”和“tr(n+1)”为待测样品某色谱峰的前面与后面相邻正烷烃色谱峰的保留时间；“tr(x)”表示待测样品某色谱峰的保留时间。

应用气相色谱与质谱联用技术，将由气相色谱分离得到的各组分通过质谱仪进行鉴定，组分的鉴定根据各组分的质谱图所得的碎片峰与分子离子峰信息，首先推断各组分分子量，再按照分子裂分的一般规律及质谱解析程序，做初步分析之后，再与epa/nzhmas、spectraldata标准谱图对照确定每个组分的结构式。

应用气相色谱仪分析蓟马表皮碳氢化合物，根据所得到的每一种试虫的总离子流色谱图，分别对每一组分峰的面积积分，得到一组相应的各组分峰的面积(在实验条件恒定时，峰面积或峰高与组分的含量成正比)。

根据各组分的峰面积，按比例求出其组分的相对含量，以此作为试虫表皮碳氢化合物混合物中各组分的定量指标。

采用主成分分析法(pca)对蓟马各个表皮碳氢化合物转换后的峰面积数据进行多元模式识别分析。

利用正交线性变换，将原始变量转化为一组新的主成分变量，然后用判别分析(da)筛选出具有显著判别能力的变量。

所有统计分析均采用statistica10.0(statsoft，inc.)。

试验一：西花蓟马不同地理种群表皮碳氢化合物差异分析

表1西花蓟马不同地理种群表皮碳氢化合物

对西花蓟马北京种群和荷兰种群成虫及若虫分别进行表皮碳氢化合物gc-ms分析，检测到北京种群成虫表皮有9种碳氢化合物，若虫有8种碳氢化合物，荷兰种群成虫表皮有10种碳氢化合物，若虫有9种碳氢化合物，均为直链或支链饱和烷烃(表1)。其中9、14-二甲基三十烷，是荷兰种群成若虫独有而北京种群没有的化合物。西花蓟马不同地理种群间成虫的gc-ms分析图谱相似性高达90.00％。

试验二：六种常见蓟马成虫的表皮碳氢化合物种类与分析

表2六种常见蓟马成虫的表皮碳氢化合物种类

通过对西花蓟马、花蓟马、黄胸蓟马、棕榈蓟马、榕管蓟马、中华简管蓟马6种常见蓟马成虫表皮碳氢化合物的gc-ms分析，获得了6种蓟马成虫的表皮碳化合物总离子流图(图1)，共得到15种碳氢化合物，分别为正二十五烷、9-甲基二十五烷、3-甲基二十五烷、正二十六烷、正二十七烷、9、11、13-三甲基二十七烷、7-甲基二十七烷、5-甲基二十七烷、3-甲基二十七烷、正二十九烷、11、13、15-三甲基二十九烷、7-甲基二十九烷、9、14-二甲基三十烷、5-甲基三十烷、3-甲基三十烷，是直链或支链饱和烷烃(表2)。

将6种蓟马成虫15种碳氢化合物的峰面积进行对数转化，再进行主成分。得到四个主要成分。这四个主成分的总方差分别为34.2％、28.6％、15.9％和8.5％，共解释原始方差的87.23％。

将上述4个主成分的因子得分进行判别分析，分析表明6种蓟马表皮碳氢化合物具有显著差异(walks'λ<0.0001，近似f＝244.3553，p<0.001)，并且在判别分析中获得4个特征根，通过卡方检验表明4个特征根均具有极显著的统计学意义，其中根1可解释变异的48.4％，根2可解释总变异的31.3％，4个特征根解释总变异的100％。交互验证法对每种蓟马成虫进行回判，正确率均为100％。判别分析的散点图表明，西花蓟马、花蓟马、黄胸蓟马、棕榈蓟马、榕管蓟马、中华简管蓟马成虫之间存在明显的分离(图2)。统计结果表明：根1能明显区分榕区分榕管蓟马、中华简管蓟马和花蓟马(p<0.001)。根2能明显区分棕榈蓟马、西花蓟马和黄胸蓟马(p<0.001)。

试验三：三种常见蓟马幼虫的表皮碳氢化合物种类与分析

表3三种常见蓟马成虫的表皮碳氢化合物种类

通过对西花蓟马、棕榈蓟马、黄胸蓟马3种常见蓟马幼虫表皮碳氢化合物的gc-ms分析，获得了3种蓟马幼虫的表皮碳化合物总离子流图(图3)，共得到11种碳氢化合物，分别为正二十五烷、9-甲基二十五烷、3-甲基二十五烷、正二十六烷、正二十七烷、9、11、13-三甲基二十七烷、9-甲基二十七烷、5-甲基二十七烷、3-甲基二十七烷、正二十九烷、11、13、15-三甲基二十九烷，是直链或支链饱和烷烃(表3)。

将3种蓟马幼虫11种碳氢化合物的峰面积进行对数转化，再进行主成分。得到两个主要成分。这两个主成分的总方差分别为47.2％和42.5％，共解释原始方差的89.61％。

将上述2个主成分的因子得分进行判别分析，分析表明3种蓟马表皮碳氢化合物具有显著差异(walks'λ<0.0001，近似f＝386.9106，p<0.001)，并且在判别分析中获得2个特征根，通过卡方检验表明2个特征根均具有极显著的统计学意义，其中根1可解释变异的77.4％，根2可解释总变异的22.5％，2个特征根解释总变异的99.9％。交互验证法对每种蓟马成虫进行回判，正确率均为100％。判别分析的散点图表明，西花蓟马、棕榈蓟马、黄胸蓟马幼虫之间存在明显的分离(图4)。统计结果表明：根1能明显区分榕区分西花蓟马和黄胸蓟马(p<0.001)。根2能明显区分棕榈蓟马和黄胸蓟马(p<0.001)。

以上所述的仅是本发明的部分具体实施例(由于本发明的技术方案包含参数，故实施例不能穷举，本发明所记载的保护范围以本发明的参数和其他技术要点为准)，方案中公知的具体内容或常识在此未作过多描述。应当指出，上述实施例不以任何方式限制本发明，对于本领域的技术人员来说，凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。