一种测定溶液中γ-PGA浓度的亚甲基蓝比色法的制作方法

本发明提供一种测定溶液中γ-pga浓度的亚甲基蓝比色法，属于生物技术领域的一种分光光度法检测方法，可在应用于测定未知γ-pga含量的溶液样品，特别是在γ-pga的高产菌株筛选与发酵过程中的监控和富含pga的固体底物的检测。

背景技术：

聚谷氨酸(γ-pga)主要是由芽孢杆菌发酵产生的一种胞外水溶性天然高分子氨基酸聚合物，由d-谷氨酸(d-glu)或l-谷氨酸(l-glu)通过α－氨基和γ－羧基通之间的酰胺键连接而成的多肽分子，而微生物合成的γ-pga通常由5000个左右的谷氨酸单体组成，其相对分子质量在100-1000kd之间。

由于γ-pga分子结构上存在活泼的官能团羧基(-cooh)，无毒性、可食用性、吸附性、二聚体性、生物相容性和非免疫原性等生物性能，使其成为低温保护剂、苦味缓解剂、缓释材料、药物载体、外科粘结剂、可生物降解纤维、热塑性、高吸水性水凝胶等多种工业应用中的重要生物材料，因此，γ-pga在农业，化妆品，医疗，环保、食品和废水净化工业等各个领域具有非常良好的应用前景与开发利用价值。

目前已有多种方法用于测定γ-pga含量，如干重分析、凝胶渗透色谱测定(gpc)，高效液相色谱(hplc)测定，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)，比浊测定法，紫外分光光度法和比色法等；曾伟等人建立紫外分光光度法检测γ-pga含量的快速方法，即在216nm测定γ-pga含量；由于发酵过程中γ-pga会被水解生成低分子量的γ-pga和谷氨酸，而且谷氨酸(215nm)和γ-pga(216nm)的最大吸光值的波长相差不大，所以很难用分光分度法精确确定同一瓶发酵液中的γ-pga和谷氨酸的含量；而刘鹏丽等人建立比色法快速测定发酵液中γ－聚谷氨酸含量，结果表明亚甲基蓝与具有聚阴离子性质的γ-pga发生反应之后在664nm处的吸光度大小与γ-pga浓度成正比；但是，由于亚甲基蓝的最大吸收波长也在664nm，通过测定664nm下的吸光度，可能是由未反应的亚甲基蓝引起，或者是由γ-pga与亚甲基蓝络合物引起的，因此，无法通过单波长检测来确定未知溶液中γ-pga的含量。

亚甲基蓝(methyleneblue)是一种芳香杂环化合物，常被用作化学指示剂、生物染色剂、染料和药物等；γ-pga是阴离子生物聚合物，分子侧链上具有活泼的羧基(-cooh)，可以促进阳离子碱性染色剂的化学吸附；2010年poonammishrachatterjee等人第一次用0.04g/l的亚甲基蓝培养基筛选产γ-pga的高产菌株；2017年，fumihikoogata等人研究了阳离子碱性染料亚甲基蓝与γ-pga的吸附性能，结果表明，γ-pga吸附剂可作为一种高效的亚甲基蓝染料吸附剂，在环境及相关领域有潜在的应用前景；2019年，刘鹏丽等人建立发酵液中γ－聚谷氨酸(γ-pga)含量快速测定的比色检测方法，但通过测定664nm下的吸光度，可能是由未反应的亚甲基蓝引起，或者是由γ-pga与亚甲基蓝络合物引起的，因此，通过单波长检测来确定未知溶液中γ-pga的含量存在不确定性。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种测定溶液中γ-pga浓度的亚甲基蓝比色法，解决了紫外分光光度法测定γ-pga浓度时的谷氨酸干扰问题，还完善了亚甲基蓝比色法测定未知溶液中γ-pga浓度，同时解决了亚甲基蓝比色法测定γ-pga浓度时的亚甲基蓝干扰问题，方便快捷，准确可靠，可用于未知溶液中γ-pga浓度的测定。

为了实现以上目的，本发明采用的技术方案为：一种测定溶液中γ-pga浓度的亚甲基蓝比色法，采取以下步骤：(1)制备亚甲基蓝与γ-pga水溶液；(2)亚甲基蓝与γ-pga水溶液混合反应；(3)亚甲基蓝与γ-pga混合溶液在200到800nm下全波长扫描；(4)判断全波长扫描光谱类型；(5)根据标准曲线计算γ-pga浓度。

优选的，步骤(2)中，γ-pga水溶液与4μg/ml亚甲基蓝溶液在ph＝6.5下反应时间为3h。

优选的，步骤(3)的具体操作，打开电脑桌面工作站软件uvprobe，打开uv-2700，仪器自检完，选择“光谱扫描”模式，点击软件上方的“m”按钮，设置参数，波长范围为200nm～800nm，输出参数为吸光值，将两个空白样品放入样品仓，点击“自动调零”，调零后将待测样品放入样品仓，点击“开始”进行测试，运行结束后，保存光谱图、数据打印表和峰值检测表。

优选的，步骤(4)中，根据已测试样品的光谱图的最大吸收波长判断全波长扫描光谱类型，若最大吸收波长在664nm，即为浓度在0～3.5μg/ml的γ-pga与4μg/ml亚甲基蓝溶液的全波长扫描光谱图；若最大吸收波长在596nm，即为浓度在10～100μg/ml的γ-pga与4μg/ml亚甲基蓝溶液的全波长扫描光谱图；若最大吸收波长在288.5nm，即为浓度在100～600μg/ml的γ-pga与4μg/ml亚甲基蓝溶液的全波长扫描光谱图。

可以根据在25℃下，含有未知浓度的γ-pga溶液与4μg/ml亚甲基蓝溶液在ph＝6.5下反应时间为3h，然后用uv-2700检测待测液在200nm～800nm全波长扫描，通过光谱图和最大波长和最大吸收值判断γ-pga浓度范围，再根据γ-pga标准曲线计算γ-pga浓度。

γ-pga浓度在0～7μg/ml之间时，与4μg/ml亚甲基蓝反应3h，在664nm处吸光度随γ-pga浓度升高而减少；当γ-pga浓度在7～800μg/ml之间时，与4μg/ml亚甲基蓝反应3h，在664nm处吸光度随γ-pga升高而升高。

在微生物合成的γ-pga通常由5000个左右的谷氨酸单体组成，γ-pga的最大吸光值的波长在216nm，而谷氨酸的最大吸光值的波长在215nm，两者的最大吸光值的波长相差不大，因此很难用紫外分光光度法精确确定同一瓶发酵液中的γ-pga和谷氨酸的含量；此外，由于亚甲基蓝的最大吸收波长也在664nm，通过测定664nm下的吸光度，可能是由未反应的亚甲基蓝引起，或者是由γ-pga与亚甲基蓝络合物引起的，因此，无法通过单波长检测来确定未知溶液中γ-pga的含量；本发明与现有技术相比，不仅解决了紫外分光光度法测定γ-pga浓度时的谷氨酸干扰问题，还完善了亚甲基蓝比色法测定未知溶液中γ-pga浓度，同时解决了亚甲基蓝比色法测定γ-pga浓度时的亚甲基蓝干扰问题，新亚甲基蓝比色法操作简单，方便快捷，准确可靠，可用于未知溶液中γ-pga浓度的测定。

附图说明：

图1a是0～7μg/mlγ-pga与4μg/ml亚甲基蓝溶液在25℃，ph＝6.5下反应3h后的200nm～800nm的紫外可见分光光谱图，从上到下γ-pga浓度分别是0μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、1.5μg/ml、2μg/ml、2.5μg/ml、3μg/ml、3.5μg/ml、4μg/ml、5μg/ml、6μg/ml和7μg/ml，图1b是以γ-pga浓度(μg/ml)为横坐标，γ-pga与亚甲基蓝混合液在664nm下吸光度为纵坐标，吸光值与γ-pga浓度(μg/ml)标准曲线的线性回归方程为：a＝-0.1321c(μg/ml)+0.7235，相关系数r2＝0.9748，线性关系良好，线性范围0.5～3μg/ml。

图2a是7～100μg/mlγ-pga与4μg/ml亚甲基蓝溶液在25℃，ph＝6.5下反应3h后的200nm～800nm的紫外可见分光光谱图，从下到上γ-pga浓度分别是7μg/ml、8μg/ml、9μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、100μg/ml，图2b是以γ-pga浓度(μg/ml)为横坐标，γ-pga与亚甲基蓝混合液在664nm下吸光度为纵坐标，吸光值与γ-pga浓度(μg/ml)标准曲线的线性回归方程为：a＝0.0012c(μg/ml)+0.1927，相关系数r2＝0.9793，线性关系良好，线性范围7～100μg/ml。

图3a是100～800μg/mlγ-pga与4μg/ml亚甲基蓝溶液在25℃，ph＝6.5下反应3h后的200nm～800nm的紫外可见分光光谱图，从下到上γ-pga浓度分别是100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml、600μg/ml、700μg/ml、800μg/ml，图3b是以γ-pga浓度(μg/ml)为横坐标，γ-pga与亚甲基蓝混合液在664nm下吸光度为纵坐标，吸光值与γ-pga浓度(μg/ml)标准曲线的线性回归方程为：a＝0.0005c(μg/ml)+0.2266，相关系数r2＝0.9896，线性关系良好，线性范围100～800μg/ml。

图4是不同浓度的γ-pga与4μg/ml亚甲基蓝溶液在25℃，ph＝6.5下反应3h后，在664nm下吸光值变化图，γ-pga浓度范围在0～7μg/ml时，与4μg/ml亚甲基蓝溶液在664nm处的吸光度大小与γ-pga浓度成反比；γ-pga浓度范围在7～800μg/ml时，与4μg/ml亚甲基蓝溶液在664nm处的吸光度大小与γ-pga浓度成正比。

具体实施方式

为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图对本发明进行详细描述，本部分的描述仅是示范性和解释性，不应对本发明的保护范围有任何的限制作用。

为了验证办发明一种测定溶液中γ-pga浓度的亚甲基蓝比色法的可行性，进行了如下实施例1-28

实施例1-28所用的试剂为1g/l的γ-pga标准溶液、1g/l的亚甲基蓝标准溶液和纯水，各个实施例的用量如下表：

实施例1-28的具体操作步骤如下：

第一步，25℃下，分别精密量取对应量的1g/l的γ-pga标准溶液到试管中，然后加入对应量的超纯水，震荡混匀，调节ph＝6.5，然后分别加入40μl浓度为1g/l的亚甲基蓝标准溶液，震荡混匀，反应时间3h。

打开电脑桌面工作站软件uvprobe，打开uv-2700，仪器自检完，选择“光谱扫描”模式，点击软件上方的“m”按钮，设置参数，波长范围为200nm～800nm，输出参数为吸光值；将两个空白样品放入样品仓，点击“自动调零”；调零后将待测样品放入样品仓，点击“开始”进行测试，运行结束后，保存光谱图、数据打印表和峰值检测表，并根据光谱图、数据打印表和峰值检测表绘制出图1-图4，通过附图1-4可以得出，实施例1-28的结果刚好验证了本申请一种测定溶液中γ-pga浓度的亚甲基蓝比色法是可行的，解决了紫外分光光度法测定γ-pga浓度时的谷氨酸干扰问题，还完善了亚甲基蓝比色法测定未知溶液中γ-pga浓度，同时解决了亚甲基蓝比色法测定γ-pga浓度时的亚甲基蓝干扰问题，方便快捷，准确可靠，可用于未知溶液中γ-pga浓度的测定。

需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，由于文字表达的有限性，而客观上存在无限的具体结构，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进、润饰或变化，也可以将上述技术特征以适当的方式进行组合；这些改进润饰、变化或组合，或未经改进将发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均应视为本发明的保护范围。