一种用于动物源性食品中209种多氯联苯同系物的HRGC-HRMS检测方法

本发明属于食品相关产品检测技术领域，具体涉及一种用于动物源性食品中209种多氯联苯同系物的hrgc-hrms检测方法。

背景技术：

多氯联苯(polychlorinatedbiphenyls，简称pcbs)是一类卤代芳香族化合物，根据氯原子在苯环上取代的位置和数目，共有209种同系物，以编号命名为pcb1-pcb209。pcbs的化学性质极稳定，曾在工业上被大量生产。据估计，全世界已生产和应用中的pcbs超过100万吨。pcbs在使用过程中通过泄漏、流失、废弃、蒸发、燃烧、堆放、掩埋及废水处理等过程进入环境中，从而对水源、大气和土壤造成污染并通过食物链的生物富集作用污染生物。pcbs能对人体和动物中枢及周围神经系统、生殖系统及免疫系统等造成致命损伤。作为一种具有致癌、致畸、致突变效应的全球性污染物，pcbs是最早被列入《关于持久性有机污染物的斯德哥尔摩公约》的一类持久性有机污染物(persistentorganicpollutants，简称pops)。

我国现行的检测食品中多氯联苯的标准有美国环保署《method1668,2010，revisioncchlorinatedbiphenylcongenersinwater,soil,sediment,biosolids,andtissuebyhrgc-hrms》、《gb5009.205-2013食品安全国家标准食品中二噁英及其类似物毒性当量的测定》以及《gb5009.190-2014食品安全国家标准食品中指示性多氯联苯含量的测定》，然而上述标准的前处理净化方法繁琐，耗时长，且难以获得复杂样品中pcbs同系物的详细信息。因此急需一种高效全面的针对动物源性食品的检测方法。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种用于动物源性食品中209种多氯联苯同系物的hrgc-hrms检测方法，采用高分辨气相色谱-高分辨质谱结合同位素稀释法进行定量分析。该方法前处理快速、安全，基质干扰少，采用高分辨气相色谱/双聚焦磁式质谱联用仪hrgc/hrms检测，能准确的获得动物源性食品中209种多氯联苯同系物的含量及分布模式信息。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种用于动物源性食品中209种多氯联苯同系物的hrgc-hrms检测方法，包括以下步骤：

所述动物源性食品包括非油脂类样品和油脂类样品，所述非油脂类样品源于肉类及其加工产品，或奶粉、奶酪或液体奶，或鱼、虾、蟹或软体类动物及其加工产品、或蛋类及其加工产品；所述油脂类样品源于黄油、植物油或可食用动物油；

所述肉类包括猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅、兔、狗、猫、驴；所述蛋类包括鸡蛋、鸭蛋、鹅蛋、鸽蛋、鹌鹑蛋或蛇蛋。

(1)待测物制备：对于非油脂类样品，称取干燥后的非油脂类样品，加入¹³c标记的提取内标，使用有机溶剂提取，得提取液，将提取液浓缩，得浓缩液a；提取完的样品去除有机溶剂后，干燥至恒重；

对于为油脂类样品，加入¹³c标记的提取内标后直接用有机溶剂溶解后进行浓缩，得浓缩液a；

其中，所述干燥后的非油脂类样品或油脂类样品与有机溶剂的比例关系为1～10g：100～300ml；

(2)粗脂肪去除与含量测定：向步骤(1)得到的浓缩液a中加入浓硫酸，震荡酸化去除大部分脂肪，得酸化后的浓缩液a；

所述非油脂类样品的干重与浓硫酸的质量比为1:0.4～2；所述油脂类样品的质量与浓硫酸的质量比为1:1～3；震荡的速度为100～200r/min，震荡时间为0.5～4h，优选为1～4h；

具体的，所述肉类样品及其加工产品的干重与浓硫酸的质量比为1:0.8～2，奶粉、奶酪或液体奶的干重与浓硫酸的质量比为1:0.4～1.5，所述黄油、植物油或可食用动物油的质量与浓硫酸的质量比为1:1～3，所述鱼、虾、蟹或软体类及其加工产品的干重与浓硫酸的质量比为1:0.4～1.8，所述蛋类及其加工产品的干重与浓硫酸的质量比为1:0.5～1.8；

对于非油脂类样品，将步骤(1)中干燥至恒重的样品称重，得提取后的样品重量；样品的粗脂肪质量为样品在提取前后的质量差；

对于油脂类样品，样品的粗脂肪质量即为提取前的样品质量；

(3)多层硅胶柱净化：向步骤(2)中酸化后的浓缩液a中加入中性硅胶，充分震荡搅拌至不挂壁，将搅拌均匀的硅胶全部转移至多层硅胶柱，用正己烷洗脱，浓缩，得浓缩液b；其中，所述酸化后的提取液a与中性硅胶的比例关系为1～2ml：2～6g。

所述多层硅胶柱从下至上依次按照玻璃棉、无水硫酸钠、中性硅胶、碱性硅胶、中性硅胶、酸性硅胶、中性硅胶、硝酸银硅胶、中性硅胶和无水硫酸钠的顺序干法装填；其中，从下至上所述玻璃棉、无水硫酸钠、中性硅胶、碱性硅胶、中性硅胶、酸性硅胶、中性硅胶、硝酸银硅胶、中性硅胶与无水硫酸钠的比例关系为0.5～2cm：0.5～3g：0.5～3g：2～6g：0.5～3g：4～12g：0.5～3g：2～6g：0.5～3g：0.5～2g；

(4)碱性氧化铝柱净化；将步骤(3)得到的浓缩液b过碱性氧化铝柱，采用正己烷和二氯甲烷的混合溶液洗脱，将洗脱液浓缩后氮气吹至近干，得多氯联苯浓缩液c；

其中，所述碱性氧化铝柱从下至上按照玻璃棉、无水硫化钠、碱性氧化铝和无水硫酸钠的顺序干法装填；从下至上所述玻璃棉、无水硫酸钠、碱性氧化铝与无水硫酸钠的比例关系为0.5～2cm：0.5～3g：5～15g：0.5～3g；

(5)上机检测：将步骤(4)得到的浓缩液c加入¹³c标记的回收率内标复溶，采用高分辨气相色谱/双聚焦磁式质谱联用仪hrgc/hrms检测，获得动物源性食品中209种多氯联苯同系物的含量及分布模式信息。

基于上述技术方案，优选的，步骤(1)中，对于非油脂类样品，干燥后的非油脂类样品的制备方法为：将非油脂类含水样品匀质化后进行冷冻干燥或无水硫酸钠干燥。

基于上述技术方案，优选的，步骤(1)中，对于蛋类样品，亦可用烘烤至蛋白蛋黄完全凝固，之后去壳匀质化，使用冷冻干燥或无水硫酸钠干燥；

所述蛋类样品烘烤加热的温度为85～110℃，加热时间为45～90min；烘烤可采用烘箱、红外干燥器或烤箱。

基于上述技术方案，优选的，步骤(1)中，提取采用的有机溶剂为正己烷、环己烷、二氯甲烷、甲苯、丙酮、石油醚中的一种或多种的组合；提取时采用索氏提取器提取或加速溶剂萃取仪提取。

基于上述技术方案，优选的，步骤(1)中，所述有机溶剂与浓缩液a的体积比为100～300：1～2；所述有机溶剂为正己烷和二氯甲烷的混合溶液，所述正己烷与二氯甲烷的体积比为98:2～1:1。

基于上述技术方案，优选的，步骤(3)中，所述酸性硅胶是酸的质量百分含量为20～50％酸性硅胶，所述碱性硅胶是碱的质量百分含量为1～30％碱性硅胶，所述硝酸银硅胶是硝酸银的质量百分含量为5～20％硝酸银硅胶，所述中性硅胶使用前先在400～650℃加热活化2～6h；所述多层硅胶柱在装填完成后采用正己烷预冲洗；过多层硅胶柱时，所述淋洗用的正己烷体积为100～300ml。

基于上述技术方案，优选的，步骤(4)中，所述碱性氧化铝使用前先在500～650℃加热活化10～24h；所述碱性氧化铝柱在装填完成后采用正己烷预冲洗；将浓缩液b过碱性氧化铝柱时，采用正己烷和二氯甲烷的混合溶液洗涤，得多氯联苯的洗涤液；所述淋洗用的正己烷和二氯甲烷的混合溶液体积为80～150ml；所述正己烷和二氯甲烷的混合溶液中，正己烷与二氯甲烷的体积比为98:2～1:1。

基于上述技术方案，优选的，步骤(4)中，所述正己烷和二氯甲烷的混合溶液与洗脱液浓缩后液体的体积比为100～300：1～2。

基于上述技术方案，优选的，步骤(4)中，所述正己烷与浓缩液b的体积为100～300：1～2。

基于上述技术方案，优选的，所述洗脱液浓缩的方法可以为旋蒸浓缩，使用的仪器为旋转蒸发仪。

基于上述技术方案，优选的，步骤(5)中，所述氮气吹至近干的条件为：加热盘的温度为30～40℃，氮气吹至近干的时间为25～50min。

基于上述技术方案，优选的，步骤(5)中，检测所用的色谱柱为db-xlb柱，色谱程序升温如下：初始温度75℃，保持2min，以15℃/min升温至150℃，2.5℃/min升温至270℃，最后保持15min。

基于上述技术方案，优选的，步骤(5)中，对于who规定的12种有毒多氯联苯和环境中广泛存在的6种指示性多氯联苯，其定量内标为目标化合物的¹³c同位素标记化合物；对于除上述18中多氯联苯之外其他的多氯联苯同系物，其定量内标为上述18种多氯联苯中特征离子质量数最接近的多氯联苯的定量内标；当最接近的多氯联苯的定量内标的质量数相同时，其定量内标为保留时间最相近的多氯联苯的定量内标。

基于上述技术方案，优选的，步骤(5)中，对于who规定的12种有毒多氯联苯和环境中广泛存在的6种指示性多氯联苯，其计算动物源性食品中209种多氯联苯同系物的含量及分布模式过程中的响应因子rf按公式(1)计算：

式中：

s1n——校正标准溶液中目标物的第一个特征离子m1的峰面积；

s2n——校正标准溶液中目标物的第二个特征离子m2的峰面积；

cl——校正标准溶液中¹³c同位素标记定量内标化合物的浓度，单位为皮克每微升(pg/μl)；

s1l——校正标准溶液中¹³c同位素标记定量内标化合物第一个质量数m1离子的峰面积；

s2l——校正标准溶液中¹³c同位素标记定量内标化合物第二个质量数m2离子的峰面积；

cn——校正标准溶液中目标化合物的浓度，单位为皮克每微升(pg/μl)。

对于除上述18中多氯联苯之外其他多氯联苯同系物，其rf值为上述18种多氯联苯中特征离子质量数最相近的多氯联苯的rf值；当最接近的多氯联苯的rf值的质量数相同时，其rf值为保留时间最相近的多氯联苯的rf值。所述who规定的12种有毒多氯联苯和环境中广泛存在的6种指示性多氯联苯为本领域的公知常识。

使用本发明所述一种用于动物源性食品中209种多氯联苯同系物的hrgc-hrms检测方法的有益效果为：

(1)一次性检测的多氯联苯同系物种类多。该方法能同时检测的多氯联苯同系物包括12种有毒的二噁英类多氯联苯、6种指示性多氯联苯及其他多氯联苯同系物，共计209种；

(2)净化过程简单。本发明方法对净化过程进行了优化处理，仅保留多层硅胶柱和碱性氧化铝柱，舍弃其他柱上净化步骤，净化过程更简单，可以更为快速简便的检测动物源性食品中的多氯联苯。环境友好，节约试剂成本；

(3)基质干扰少，产品回收率高。与传统的低分辩质谱和电子捕获检测器(ecd)等方法相比，本发明采用同位素释高分辨色质联用方法检测，减少了基质干扰和假阳性结果，大大提高了方法检出限和定量结果的准确性。同时净化过程简化，很大程度上避免了操作过程中的损失，提高了产品的回收率；

(4)适用面广。本方法可以用于各种动物源性食品中多氯联苯的检测。

附图说明

图1是实施例1中四氯代pcbs的典型色谱图；

图2是实施例1中七氯代pcbs的典型色谱图。

具体实施方式

下面将结合具体的实施方式进一步说明本发明，但本发明要求保护的范围并不局限于下列实施方式。

实施例1鲳鱼鱼肉样品中多氯联苯同系物含量测定

(1)样品准备：取鲳鱼鱼肉匀浆后冷冻干燥。

(2)待测物制备：取2.000g冻干后的试样，用滤纸包包好，加入适量¹³c标记的同位素内标(p48-w-es及p48-m-es，同系物浓度为100ng/ml，加入量各5μl)，以260ml正己烷：二氯甲烷(1：1体积比)为溶剂索氏提取18～24h，回流速度控制在3～4次/h(约1秒1滴)。提取后，将提取液旋转蒸发浓缩至1～2ml，得浓缩液a；提取完的试验样品晾干挥发溶剂后放入干燥器中常温干燥至恒重。

(3)粗脂肪去除与含量测定：向浓缩液a中加入2ml浓硫酸，在摇床上以125r/min振荡1h酸化去除大部分脂肪；将步骤(2)中干燥至恒重的试验样品称重，得提取后的试验样品质量。试验样品在提取前后的质量差为样品中的粗脂肪质量。

(4)多层硅胶柱净化：从下至上按照1cm玻璃棉、2g无水硫酸钠、2g中性硅胶、5g碱性硅胶、2g中性硅胶、10g酸性硅胶、2g中性硅胶、5g硝酸银硅胶、2g中性硅胶和2g无水硫酸钠的顺序干法装填形成多层硅胶柱。其中，所述酸性硅胶为硫酸的质量百分含量为44％酸性硅胶，其制备方法为：将44g浓硫酸加入到56g硅胶中，搅拌，充分震荡均匀；所述碱性硅胶为氢氧化钠的质量百分含量为2％碱性硅胶，其制备方法为：将40ml50g/l氢氧化钠水溶液加入到98g硅胶中，搅拌，充分震荡均匀，再用旋转蒸发仪旋蒸去除水；所述硝酸银硅胶为硝酸银的质量百分含量为5～20％硝酸银硅胶，其制备方法为：将25ml400g/l硝酸银水溶液加入到90g硅胶中，搅拌，充分震荡均匀，再用旋转蒸发仪旋蒸去除水；所述中性硅胶使用前先在650℃加热活化4h。上样前预先用60ml正己烷淋洗多层硅胶柱。向步骤(3)中酸化后的浓缩液a中加入中性硅胶，充分震荡搅拌至不挂壁，采用干法上样过柱，并用1ml×3次正己烷洗涤烧瓶，并将每次的洗涤液都加到该柱中。用200ml正己烷淋洗，用烧瓶接收该部分流出液，旋转蒸发浓缩至1～2ml，得浓缩液b。

(5)碱性氧化铝柱净化；从下至上按照1cm玻璃棉、2g无水硫酸钠、10g碱性氧化铝和2g无水硫酸钠的顺序干法装柱，得碱性氧化铝柱。其中，所述碱性氧化铝使用前先在600℃加热活化24h。上样前预先用40ml正己烷淋洗氧化铝柱。当溶液流至与无水硫酸钠上层平面相平时，上浓缩液b，并用1ml×3次正己烷洗涤烧瓶，并将每次的洗涤液都加到该柱中。当混合溶液流至与无水硫酸钠上层平面相齐时加入40ml正己烷，淋洗去除杂质；当淋洗液流至与无水硫酸钠上层平面相齐时加入120ml95：5(体积比)的正己烷和二氯甲烷的混合溶液淋洗，用烧瓶接收该部分流出液，旋转蒸发浓缩至1～2ml后转移到200μl玻璃衬管中。用1ml×3次正己烷洗涤烧瓶，并将每次的洗涤液转移到玻璃衬管中。经氮气吹扫浓缩至近干，得多氯联苯浓缩液c；

(6)上机检测。将浓缩液c加入5μl¹³c标记的回收率内标(p48-rs，同系物浓度为100ng/ml)复溶，采用高分辨气相色谱/双聚焦磁式质谱联用仪hrgc/hrms检测，获得动物源性食品中209种多氯联苯同系物的含量及分布模式。

仪器(hrgc/hrms)分析条件

色谱条件：采用无分流进样；色谱柱：db-xlb毛细管柱；进样量：1μl；载气：he，流速为1ml/min；进样口温度：270℃；色谱程序升温如下：初始温度75℃，保持2min，以15℃/min升温至150℃，2.5℃/min升温至270℃，最后保持15min。质谱分析条件：ei+，sim，分辨率r≥10000；离子源温度：280℃；传输线温度：270℃；离子化电压为45ev，离子化电流为1ma，加速电压为5kv。

表1给出了目标物检测时用到的两个特征离子精确质量数、¹³c同位素标记pcbs的离子精确质量数、进样内标(pcb70，pcb111，pcb170)特征离子的精确质量数、各目标物的保留时间、检测限以及who-tef2005。

表1、pcbs的特征目标离子汇总表(按出峰顺序排列)、保留时间、检出限及毒性当量因子

注：粗体为dl-pcbs，下划线为指示性pcbs；

^a0.00003为pcb123的who-teq2005。

表2、鲳鱼鱼肉样品中209种多氯联苯同系物含量、同位素标记内标化合物的回收率及毒性当量

注：粗体为dl-pcbs，下划线为指示性pcbs；

^a根据保留时间和特征离子无法分开时，含量为未分开的同系物之和；

^b0.00054为pcb123的who-teq2005。

表3.鲳鱼鱼肉样品脂肪量及毒性当量

注：^a当dl-pcbs含量低于检测限时，毒性当量为lod×tef2005