一种虎杖指纹图谱质量控制体系的建立方法与流程

本发明涉及药材质量控制技术领域，尤其涉及一种虎杖指纹图谱质量控制体系的建立方法。

背景技术：

虎杖为蓼科植物虎杖polygonumcuspidatumsieb.etzucc.的干燥根茎和根，春、秋二季采挖，除去须根，洗净，趁鲜切短段或厚片，晒干。其植物资源丰富，分布于全国各地，主产于河北、西北、华东、华中、华南、西南等地区。虎杖为常用中药，具有祛风利湿，散瘀定痛、止咳化痰等功效。药理研究表明虎杖具有良好的抗菌作用，虎杖中大黄素、大黄素葡萄糖苷和白藜芦醇苷对金黄色葡萄球菌和肺炎双球菌有抑菌作用，虎杖水提液及大黄素具有良好的抗病毒作用其活性成分主要含有蒽醌类化合物，其中以游离型为主(含量约1.4％)，结合型的含量较低(约0.6％)。游离蒽醌衍生物主要有大黄素、大黄素甲醚、大黄酚等，结合型的主要有大黄素甲醚-8-葡萄糖苷等；茋类化合物白藜芦醇及其白藜芦醇苷；此外还含有黄酮类化合物、香豆素类化合物、综合性鞣酸等。

对于虎杖的质量研究报道较多，《中国药典》(2015年版)对虎杖药材的质量控制主要从性状、显微鉴别、薄层色谱鉴别以及虎杖苷和大黄素的含量进行规定。文献报道多采用hplc法测定虎杖中虎杖苷、白藜芦醇、大黄素、大黄素甲醚及总黄酮的含量，以及采用酚-硫酸比色法测定多糖的含量，亦有釆用hplc指纹图谱技术评价虎杖药材质量的报道。

参考图10，《中国药典》(2015年版)规定本品含大黄素(c15h10o5)不得少于0.60％，含虎杖苷(c20h22o8)不得少于0.15％。该范围较大，各批次间虎杖苷、大黄素的含量差异较大。这将为产品的质量稳定均一和临床安全有效性带来很大的隐患，需要更加严格控制药材的质量。

技术实现要素：

本发明的目的是为了解决现有技术中药材质量控制不稳定的缺点，而提出的一种虎杖指纹图谱质量控制体系的建立方法。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

设计一种虎杖指纹图谱质量控制体系的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一对照品溶液制备

准确称量2.00mg的对照品，分别置于10ml量瓶中，加入适量50％甲醇溶解，并以50％甲醇定容，得到质量浓度为200μg/ml的对照品贮备液，进样前将对照品贮备液用50％甲醇稀释10倍，对照品为虎杖苷(111575-200502)，大黄素(110756-200110)，大黄素甲醚110764-200608)，芦荟大黄素(110795-200605)；

步骤二供试品溶液制备

取虎杖药材粉碎过40目筛，取粉末约1g，精密称定，加入甲醇25ml，置圆底烧瓶中，称定重量，回流提取30分钟，冷却至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀滤过，取续滤液，即得；

步骤三化合物测定

通过hplc-tof/ms正负总离子流色谱图检测对照品溶液、供试品溶液，进行对比分析得出结果；

步骤四指纹图谱的测定

取多批虎杖药材作为样本进行指纹图谱研究，将多批药材的指纹图谱的aia数据文件导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2004a版相似度软件，以其中一批虎杖药材的指纹图谱为参照图谱，采用多样本平均数矢量综合作为共有模式矢量，时间宽度设定为0.10，多点校正后，确定主要的色谱特征峰，选取峰面积较大、出峰时间适中且稳定的峰作为参照峰，计算各色谱峰相对于其的峰面积比，若某一指纹图谱在某相对保留时间处无峰，相对峰面积为零，仍给相应的编号，以保证各色谱指纹图谱都有相同的色谱峰数；

步骤五聚类分析

将各色谱峰占总色谱峰的峰面积量化，得到原始数据矩阵，运用“spss软件”对其进行聚类分析，聚类分析将虎杖指纹图谱样品分为ⅰ类和ⅱ类；

步骤六指纹图谱建立

根据多批虎杖指纹图谱药材的聚类分析结果，从中选取归属于ⅰ类的多批药材的色谱图生成指纹图谱及对照指纹图谱，计算相似度；

步骤七色谱峰的指认

采用对照品结合液质联用法对虎杖指纹图谱中的主要特征峰进行指认。

优选的，步骤三中：

色谱条件为：色谱柱：orcac185μ250*4.6mm；检测波长：210nm；柱温：35℃。流速：1ml/min；流动相：a-乙腈，b-0.05％磷酸；洗脱方式：梯度洗脱0～25min，10％～25％a，25～40min，25％～40％a，40～50min，40％～60％a，50～58min，60％～100％a：58～65min，100％a；进样量：10μl；

质谱条件为：分流比设为1:4，tof-ms实验条件：正负离子分别进行全扫描(esi)，扫描质量范围50～1200da；干燥气的体积流量6l/min，干燥气温度180℃，雾化气压0.8bar，阳离子模式下，毛细管电压4500v，阴离子模式下的毛细管电压2600v，碎裂电压200vpp，选择甲酸钠溶液为内标矫正。

优选的，步骤七中：

对照品法：

制备芦丁、白藜芦醇苷、白藜芦醇、大黄酸及大黄素混合对照品溶液，按虎杖指纹图谱方法测定，进行比对；

hplc-q-tof法：

质谱条件：hplc条件如前所述，分流比设为1:4，tof-ms实验条件：正负离子分别进行全扫描(esi)，扫描质量范围50～1200da；干燥气的体积流量6l/min，干燥气温度180℃，雾化气压0.8bar，阳离子模式下，毛细管电压4500v，阴离子模式下的毛细管电压2600v，碎裂电压200vpp，选择甲酸钠溶液为内标矫正。

本发明提出的一种虎杖指纹图谱质量控制体系的建立方法，有益效果在于：本研究建立了虎杖hplc法指纹图谱的质量评价方法，通过对14批虎杖药材通过系统聚类分析和相似度评价，建立了虎杖药材指纹图谱的共有模式。本研究建立的虎杖药材指纹图谱方法稳定、可靠、重现性好，可为虎杖药材的质量评价提供依据。

附图说明

图1为本发明的精密度试验的hplc色谱图；

图2为本发明的稳定性试验的hplc色谱图；

图3为本发明的重复性试验的hplc色谱图；

图4为本发明的虎杖药材hplc指纹图谱；

图5为本发明的虎杖指纹图谱药材聚类分析图；

图6为本发明的虎杖指纹图谱药材hplc指纹图谱；

图7为本发明的生成的对照指纹图谱；

图8为本发明的虎杖指纹图谱药材与混合对照比对图谱；

图9为本发明的虎杖指纹图谱药材hplc-tof/ms正负总离子流色谱图及hplc色谱图；

图10按《中国药典》(2015年版)虎杖药材含量测定方法测定虎杖药材中虎杖苷、大黄素含量柱状图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

参照图1-9，一种虎杖指纹图谱质量控制体系的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一对照品溶液制备

准确称量2.00mg的对照品，分别置于10ml量瓶中，加入适量50％甲醇溶解，并以50％甲醇定容，得到质量浓度为200μg/ml的对照品贮备液，进样前将对照品贮备液用50％甲醇稀释10倍，对照品为虎杖苷(111575-200502)，大黄素(110756-200110)，大黄素甲醚110764-200608)，芦荟大黄素(110795-200605)；

步骤二供试品溶液制备

取虎杖药材粉碎过40目筛，取粉末约1g，精密称定，加入甲醇25ml，置圆底烧瓶中，称定重量，回流提取30分钟，冷却至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀滤过，取续滤液，即得；

步骤三化合物测定

通过hplc-tof/ms正负总离子流色谱图检测对照品溶液、供试品溶液，进行对比分析得出结果；

色谱条件为：色谱柱：orcac185μ250*4.6mm；检测波长：210nm；柱温：35℃。流速：1ml/min；流动相：a-乙腈，b-0.05％磷酸；洗脱方式：梯度洗脱0～25min，10％～25％a，25～40min，25％～40％a，40～50min，40％～60％a，50～58min，60％～100％a：58～65min，100％a；进样量：10μl；

质谱条件为：分流比设为1:4，tof-ms实验条件：正负离子分别进行全扫描(esi)，扫描质量范围50～1200da；干燥气的体积流量6l/min，干燥气温度180℃，雾化气压0.8bar，阳离子模式下，毛细管电压4500v，阴离子模式下的毛细管电压2600v，碎裂电压200vpp，选择甲酸钠溶液为内标矫正。

精密度试验：

取虎杖药材粉末约1g，精密称定，按样品制备方法制备虎杖药材供试品溶液,在确定的色谱条件下测定,连续进样6次，测定hplc色谱图，以14号峰的保留时间和色谱峰面积为参照，计算出各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积。精密度试验的hplc色谱图见图1，精密度试验数据见表1、2。各色谱峰的相对保留时间及相对峰面积的rsd值均小于5％，符合指纹图谱的要求。

表1精密度试验相对保留时间数据

表2精密度试验相对峰面积数据

稳定性试验：

取精密度试验项下的供试品溶液,密闭,放置于室温,分别在0，3，6，9，12，24h时间间隔下检测指纹图谱，以14号峰的保留时间和色谱峰面积为参照，计算出各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积。稳定性试验的hplc色谱图见图2，由表3、4可见，各色谱峰的相对保留时间及相对峰面积的rsd值均小于5％,符合指纹图谱的要求。说明供试品溶液在24h内稳定。

表3稳定性试验相对保留时间数据

表4稳定性试验相对峰面积数据

重复性试验：

取虎杖药材粉末约1g，精密称定，平行取6份，按确定的供试品溶液制备方法制备供试品溶液,在确定的色谱条件下测定,记录色谱图，以14号峰的保留时间和色谱峰面积为参照，计算出各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积。重复性试验的hplc色谱图见图3，重复性试验结果见表5、6，各色谱峰的相对保留时间及相对峰面积的rsd值均小于5％,符合指纹图谱的要求。

表5重复性试验相对保留时间数据

表6重复性试验相对峰面积数据

步骤四指纹图谱的测定

取14批虎杖药材作为样本进行指纹图谱研究，将14批药材的指纹图谱的aia数据文件导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2004a版相似度软件，以表7中h1号虎杖药材的指纹图谱为参照图谱，采用多样本平均数矢量综合作为共有模式矢量，时间宽度设定为0.10，多点校正后，确定了19个主要的色谱特征峰。选取峰面积较大、出峰时间适中且稳定的14号峰作为参照峰，计算各色谱峰相对于其的峰面积比。若某一指纹图谱在某相对保留时间处无峰，相对峰面积为零，仍给相应的编号，以保证各色谱指纹图谱都有相同的色谱峰数。数据见表7，图4。

表7指纹图谱实验结果

步骤五聚类分析

将各色谱峰占总色谱峰的峰面积量化，得到14x19阶原始数据矩阵，运用“spss软件”对其进行聚类分析。聚类分析将14个虎杖样品分为2大类，可判定虎杖内在质量具有差异性。分类聚类谱系图见图5。14批样品分为两类，样品号为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14的样品属于ⅰ类，样品号为11的样品属于ⅱ类；

步骤六指纹图谱建立

根据对14批虎杖药材的聚类分析结果，从中选取归属于ⅰ类的10批药材的色谱图生成指纹图谱及对照指纹图谱，计算不同批次药材之间的相似度，结果见表8，图6、7。由虎杖相似度评价结果可以看出，各批虎杖与对照指纹图谱间的相似度为0.998～0.921，符合指纹图谱技术要求。

表8药材相似度评价结果

利用2004b版《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》计算软件，对上述14批样品与对照指纹图谱进行匹配，进行相似度评价，结果见表9。结果表明各批虎杖药材与对照指纹图谱间的相似度为0.998～0.921，表明各批次药材之间具有较好的一致性，本方法可用于综合评价虎杖药材的整体质量。

表9虎杖药材相似度评价

本研究中相似度评价结果表明药材虎杖的hplc色谱图很相似，但是通过聚类分析可以看到不同批次的虎杖在主要成分含量上有一定差别，并根据这种差别可以将其分为两大类。

步骤七色谱峰的指认

采用对照品结合液质联用法对虎杖指纹图谱中的主要特征峰进行指认。指纹图谱中19个主要特征峰的11个为：虎杖苷、表儿茶素没食子酸酯、6′-没食子酰基-白藜芦醇苷、大黄素-8-o-葡萄糖苷、新芒果苷、白藜芦醇、决明松-8-o-葡萄糖苷、决明松、大黄素甲醚-8-葡萄糖苷、大黄酸、大黄素，见图8、9，表10。

对照品法：

制备芦丁、白藜芦醇苷、白藜芦醇、大黄酸及大黄素混合对照品溶液，按虎杖指纹图谱方法测定，进行比对；

hplc-q-tof法：

质谱条件：hplc条件如前所述，分流比设为1:4，tof-ms实验条件：正负离子分别进行全扫描(esi)，扫描质量范围50～1200da；干燥气的体积流量6l/min，干燥气温度180℃，雾化气压0.8bar，阳离子模式下，毛细管电压4500v，阴离子模式下的毛细管电压2600v，碎裂电压200vpp，选择甲酸钠溶液为内标矫正。

表10指纹图谱色谱峰指认结果

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变而得到的技术方案、构思、设计，都应涵盖在本发明的保护范围之内。