近红外发光双核钌配合物作为肿瘤细胞识别和成像试剂的制作方法

本专利属于荧光生物分子探针领域，涉及双核钌配合物在识别肿瘤细胞和溶酶体定位荧光探针等相关领域中的应用。

背景技术：

目前，活细胞成像和生物分子示踪已成为生物医学和材料化学等领域的研究热点。激光扫描共聚焦技术具有独特的光学切片和三维重构能力，可实时动态观察细胞与分子变化，且具有高分辨率，因此，激光扫描共聚焦荧光显微镜已成为荧光成像和细胞研究最先进的工具之一(s.a.stricker,microsc.res.techniq.,1999,6,356-369)。近红外发光钌配合物与传统有机小分子荧光探针相比，由于具有高度可调的基态和激发态性质，斯托克斯位移大，不易光漂白、生物组织穿透性强等优势具有非常广阔的生物荧光成像应用前景(f.tang,x.wang,c.yao,rscadv.,2016,6,77745-77751；c.s.burke,a.byrne,t.e.keyes,j.am.chem.soc.,2018,140,6945-6955)。恶性肿瘤是导致居民死亡的“第一杀手”，肿瘤的早期诊断是治愈肿瘤的关键。肿瘤细胞靶向分子可以在肿瘤细胞内高度聚集，从而提高肿瘤检测灵敏度，因此，设计合成肿瘤靶向生物荧光探针成为当前研究热点之一。然而，目前对肿瘤细胞具有高度选择性的近红外发光钌配合物报道较少(j.li,l.zeng,chem.commun.,2019,73,10972-10975)。

溶酶体是一种膜性囊状细胞器，ph呈现弱酸性(4.5～5.5)，在细胞膜修复、细胞凋亡、自体吞噬以及细胞内物质运输与代谢等生命过程中发挥重要作用(m.ebner,a.philipp,h.volker,biochem.soc.t.,2019,4,1173-1185)。利用特异性荧光探针对溶酶体进行标记示踪对深入研究溶酶体生理功能以及相关疾病的诊断和治疗具有重要的现实意义。

技术实现要素：

本发明所用到的双核钌配合物荧光探针为[(bpy)2ru(hl¹)ru(h2l²)](clo4)4，其中，配体和双核配合物[(bpy)2ru(hl¹)ru(h2l²)](clo4)4结构式为：

本发明的目的在于提供所述双核钌配合物在肿瘤识别探针中的应用。

本发明的另一个目的在于提供所述双核钌配合物作为溶酶体荧光探针的应用。

与现有的活细胞荧光探针相比，本发明中的荧光探针的有益效果在于：

(1)目前已报道的可区分肿瘤细胞与健康细胞的钌配合物较少，本发明所述的双核钌配合物具有良好的近红外磷光发射性能，对肿瘤细胞有较高选择性，利用荧光成像技术，可实现肿瘤细胞的识别，在肿瘤的早期诊断和辅助治疗方面具有巨大的开发潜力。

(2)特异性定位在肿瘤细胞溶酶体。与传统的溶酶体荧光探针相比，光化学性质稳定，在成像浓度下几乎无细胞毒，可见光激发，近红外区发光，较紫外激发的细胞探针对细胞损伤小，可实现长时间细胞荧光实时监测。

附图说明

图1不同浓度的双核配合物孵育hela细胞在48h后的细胞存活率图。

图2双核钌(ii)配合物(40μm)的分别孵育hela细胞和hek293细胞8h后的共聚焦图片及相对荧光强度比较。

图3双核钌(ii)配合物(40μm)的孵育hela-hek293细胞共培养模型(hela:hek＝1:1)8h后的共聚焦图。

图4双核钌(ii)配合物孵育hela细胞8h后与lysotrackergreen、mitotrackergreen、hoechst33342共染后共聚焦细胞成像图。

具体实施方式

实施例1：细胞培养和双核钌(ii)配合物的细胞毒性实验

人宫颈癌hela细胞在37℃的co2培养箱中培养(相对湿度95％，co2含量5％)，细胞培养液为含10％胎牛血清和1％双抗的dmem培养基。

mtt法检测配合物对细胞存活率的影响。取对数生长期的肿瘤细胞，以细胞浓度1×10⁴/孔接种于96孔板中，每孔100μl，空白对照孔加入无细胞的培养基，四周边缘孔用无菌pbs填充。培养箱中培养24h，弃去每孔培养基，加入用新鲜培养基配制的不同浓度双核钌配合物100μl，设置5-6个复孔，对照组加入不含钌配合物的新鲜培养基。培养48h后，每孔加入10μl5mg/ml的mtt溶液，继续孵育4h。最后，每孔加入150μldmso裂解液，振摇15min后，酶标仪检测每孔在490nm处od值，空白对照孔调零。按照如下公式计算细胞存活率：

检测结果如图1所示。求得抑制率为50％所对应的配合物浓度，ic50值>100μm，表明该双核钌配合物具有较低的细胞毒性。在成像浓度为40μm时，细胞存活率在80％以上，几乎无细胞毒，对细胞活力影响较小。

实施例2：双核钌(ii)配合物识别肿瘤细胞

以细胞密度为1×10⁴个/孔，将人宫颈癌hela细胞、人胚肾hek293细胞、分别接种于20mm的共聚焦小皿中，培养箱中培养24h后，将旧培养液弃去，换成含40μm双核钌配合物的新鲜培养基，继续培养8h，用ph＝7.4的磷酸盐缓冲液洗涤三次，用nikona1r激光共聚焦荧光显微镜在562nm激发，640-720nm红色通道成像。图2所示的结果表明，双核钌配合物能有效地被肿瘤hela细胞摄取，而人正常hek293细胞摄取率较低，相同实验条件下的荧光强度，肿瘤细胞是正常细胞的13倍。为进一步确定钌配合物对肿瘤细胞的靶向识别能力，构建了hela-hek293细胞共培养模型(hela:hek＝1:1)(图3)。共聚焦成像结果，绿色箭头指示的体积较大的不规则椭圆形细胞为肿瘤hela细胞，白色箭头指示的细长形细胞为正常hek293细胞，hela细胞内红色荧光强度明显高于hek293细胞。

实施例3：双核钌配合物在hela细胞内的亚细胞定位

将hela细胞以1×10⁴个/孔的细胞密度接种在20mm的共聚焦小皿中，培养24h后，加入含40μm双核钌配合物的新鲜培养基，在培养箱中孵育8h。将小皿中的培养液弃去，用ph＝7.4的磷酸盐缓冲液洗涤2次，加入浓度为200nm的溶酶体染料lysotrackergreen，200nm的线粒体染料mitotrackergreen和5μg/ml的细胞核染料hoechst33342，染色30分钟后，磷酸盐缓冲液洗涤3次，用nikona1r激光共聚焦荧光显微镜观察双核钌配合物的亚细胞定位。双核钌(ii)配合物(λex＝562nm，λem＝640-720nm)，lysotrackergreen和mitotrackergreen(λex＝488nm，λem＝505-530nm)，hoechst33342(λex＝405nm，λem＝430-460nm)。

成像结果(图4)表明，双核钌配合物的红色荧光与溶酶体染料lysotrackergreen的绿色荧光重叠，呈现明显的黄色，pearson系数为0.91，而与线粒体染料mitotrackergreen的绿色荧光和细胞核染料hoechst33342的蓝色荧光几乎无重叠。由此可知，该双核钌(ii)配合物可选择性定位在hela细胞的溶酶体内。