一种用于评价LAG3抗体的生物学活性的方法及其试剂盒与流程

本发明涉及lag3抗体活性检测技术领域，具体而言，涉及一种用于评价lag3抗体的生物学活性的方法及其试剂盒。

背景技术：

lag3(lymphocyteactivationgene-3，淋巴细胞活化基因3，也称作cd223)是一种i型跨膜免疫球蛋白超基因家族成员。其能与mhcii类分子(组织相容性复合物ii类分子)结合，负向调节免疫反应。通过研发抑制lag3与mhcii分子结合的lag3抗体，可上调免疫反应，增强细胞的抗肿瘤能力。

现有技术多采用超抗原葡萄球菌肠毒素(seb)刺激健康人pbmc分泌细胞因子，或者通过异体t-dc混合淋巴细胞反应来评价抗人lag3(hlag3)抗体的体外生物学活性。但这两种技术均需要采集健康人外周血以用于分离外周血淋巴细胞pbmc，或需要进一步获得诱导分化后的dc细胞及分离高纯度的t细胞，实验材料获取困难，实验流程复杂，并且因供者不同，实验稳定性较差。

目前，还可通过荧光素酶报告基因体系，通过检测lag3蛋白下游信号途径的活化信号，以评价抗hlag3抗体介导的mhcii类分子的阻断活性，但该方法需要花费大量的时间以构建两种细胞株，即表达lag3蛋白的稳定细胞株和包含荧光素酶报告基因的稳定细胞株，构建周期长，过程繁琐。

鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明实施例的目的在于提供了一种用于评价lag3抗体的生物学活性的方法及其试剂盒，该方法包括将表达lag3蛋白的t淋巴瘤细胞和表达mhcii的细胞的混合产物与待评价lag3抗体共孵育，检测孵育产物中细胞因子的表达量。

该试剂盒包括有表达lag3蛋白的t淋巴瘤细胞和表达mhcii的细胞。

本发明具有以下有益效果：

本发明实施例提供的用于评价lag3抗体的生物学活性的方法，仅需要构建一种稳定表达lag3蛋白的细胞株，体系构建时间短且稳定性好，能够有效检测lag3抗体的活性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例1中的jurkat-hlag3稳定细胞株上hlag3/cd3的比值结果；

图2为本发明实施例2中jurkat-hlag3和raji细胞共孵育后il2的分泌结果；

图3为本发明实施例2中14号克隆上hlag3和cd3的表达情况；

图4为本发明验证例1中丝裂霉素c处理raji细胞1～3天后raji细胞的检测结果，其中，图4a为细胞存活率检测结果，图4b为活细胞密度检测结果；

图5为本发明验证例2中加入不同外源刺激因子后il2的检测结果；

图6为本发明验证例3中不同jurkat细胞与raji细胞混合比例以及不同共孵育时间下il2的检测结果；

图7为本发明验证例4中不同的抗hlag3抗体在评价体系中il-2的表达情况；

图8为本发明验证例5中jurkat-hlag3和raji细胞上表达pd1和pdl1的检测结果；

图9为本发明验证例5中不同抗体作用下il2的分泌情况。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明提供了一种用于评价lag3抗体的生物学活性的方法，其包括：将表达lag3蛋白的t淋巴瘤细胞细胞和表达mhcii的细胞的混合产物与待评价lag3抗体共孵育，检测孵育产物中细胞因子的表达量。

在本发明提供的方法中，表达lag3蛋白的t淋巴瘤细胞细胞与表达mhcii的细胞共孵育后，t淋巴瘤细胞细胞上的lag3蛋白与mhcii结合，免疫下调，抑制t淋巴瘤细胞细胞分泌细胞因子；当在共孵育产物中加入抗lag3抗体后，抗lag3抗体与lag3蛋白结合，以阻断lag3蛋白与mhcii的结合，使t淋巴瘤细胞细胞分泌细胞因子的功能恢复，细胞因子的分泌量增加。

在可选实施方式中，所述表达lag3蛋白的细胞与所述表达mhcii的细胞的细胞数量比为(5～20)：1。具体地，所述表达lag3蛋白的细胞与所述表达mhcii的细胞的细胞数量可比为5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1或20:1。

在可选实施方式中，所述共孵育的孵育时间为22～26h。具体地，所述共孵育的孵育时间为22h、23h、24h、25h或26h。在该混合孵育时间下，lag3蛋白的t淋巴瘤细胞细胞分泌细胞因子的能力较强。

在可选实施方式中，所述表达lag3蛋白的t淋巴瘤细胞中，hlag3/hcd3的表达比为0.5～40。在该hlag3/hcd3的表达比的范围内，人源t淋巴瘤细胞能稳定表达lag3蛋白，使用于评价lag3抗体的生物学活性的方法的稳定性更好，检测结果更准确。

在可选实施方式中，所述表达lag3蛋白的t淋巴瘤细胞中，hlag3/hcd3的表达比为0.8～1.5。具体地，hlag3/hcd3的表达比可为0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4或1.5。

在可选实施方式中，所述表达lag3蛋白的细胞为人源t淋巴瘤细胞系。

在可选实施方式中，所述表达lag3蛋白的细胞为jurkat细胞。

在可选实施方式中，所述表达mhcii的细胞为raji细胞。

在可选实施方式中，在共孵育前，所述方法包括采用细胞增殖抑制剂处理raji细胞1～3天。本发明采用细胞增殖抑制剂处理细胞，能够在维持细胞功能的前提下抑制raji细胞的增殖，保持反应体系的稳定，增加检测结果的稳定性和准确度。

在可选实施方式中，所述增殖抑制剂为丝裂霉素c。

在可选实施方式中，所述丝裂霉素c的作用浓度为1～10μg/ml。

在可选实施方式中，所述丝裂霉素c的作用浓度为2.5～10μg/ml。具体地，所述丝裂霉素c的作用浓度为2.5μg/ml、3μg/ml、3.5μg/ml、4μg/ml、4.5μg/ml、5μg/ml、5.5μg/ml、6μg/ml、6.5μg/ml、7μg/ml、7.5μg/ml、8μg/ml、8.5μg/ml、9μg/ml、9.5μg/ml或10μg/ml。

在可选实施方式中，所述待评价lag3抗体包括relatlimab、lag525、regn3767、mk-4280、mgd013、sym022、fs118和gsk2831781中的任意一种。

在可选实施方式中，细胞因子为il2或干扰素γ，优选为il2。

此外，本实施例还提供了用于评价lag3抗体的生物学活性的试剂盒，其包括有表达lag3蛋白的t淋巴瘤细胞和表达mhcii的细胞。需要说明的是，表达lag3蛋白的t淋巴瘤细胞和表达mhcii的细胞同上述实施方式所述，在此不再赘述。

在可选实施方式中，该试剂盒还包括丝裂霉素c和/或细胞因子检测试剂。

在可选实施方式中，所述细胞因子检测试剂为il2检测试剂。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

构建稳定表达人lag3的jurkat稳定细胞株。

jurkat细胞不表达内源性的人lag3蛋白(hlag3)，通过慢病毒体系构建稳定表达hlag3蛋白(序列如seqidno.1所示)的jurkat稳定细胞株，即jurkat-hlag3，具体如下。

用含10％的dmem完全培养基将293t细胞按5×10e6接种于100mm平皿中，于37℃、5％co2培养箱培养过夜。次日，待293t细胞生长至汇合率为80～90％，采用聚乙烯亚胺pei进行质粒转染，37℃、5％co2培养箱中静置培养。

次日，将细胞上清完全吸去(第一次病毒上清)，加入新鲜的dmem完全培养基，在培养箱中继续培养48小时。吸取病毒上清后，加入新鲜的完全培养基继续培养1天后，收集上清，并将收集的上清与第一次病毒上清合并后，于4℃、3000×g离心10min后，通过0.45μm滤膜过滤浓缩。

采用流式细胞仪进行慢病毒滴moi检测。根据moi，采用助转剂polybrene进行jurkat细胞的慢病毒感染，72小时后，采用有限稀释法进行单克隆的筛选，在96孔板中连续培养15-20天后，光学显微镜下观察细胞克隆化情况，然后转移至24孔板中扩大培养，根据细胞生长情况，挑选单克隆化细胞转移至6孔板中，待单克隆细胞生长3天后，采用流式细胞术检测cd3和lag3的表达，并对挑选出的部分jurkat-hlag3细胞株进行传代稳定性评估。

筛选获得的38株jurkat-hlag3稳定细胞株上hlag3/cd3的比值结果如图1所示，hlag3/hcd3的表达比例介于0.5～40之间，选取hcd3/hlag3比值介于0.8～3的克隆。

实施例2

jurkat-hlag3稳定细胞株的传代稳定性评估。

为防止外源人lag3基因整合后的丢失，对实施例1得到的部分jurkat-hlag3克隆进行稳定性评估。

通过jurkat-hlag3和raji细胞混合培养体系，检测细胞因子il2的分泌情况：

将5μg/mlcd3抗体包被于96孔板中，次日，按1×10e4/孔raji细胞，2×10e5/孔jurkat-hlag3细胞进行共孵育，37℃连续培养3天后，采用酶联免疫反应elisa检测上清中il2的表达，检测结果如图2所示。

由图2可知，相对#34、#35、#87和#95号克隆外，#14号克隆jurkat-hlag3几乎没有il2的分泌，加入raji细胞后，il2的分泌量显著上调，说明#14细胞能够明显的评价lag3抗体的生物学活性。同时，通过流式细胞仪，检测传代过程中不同代次下#14号克隆上lag3和cd3的表达情况，如图3所示，不同传代下，#14号克隆jurkat-hlag3上lag3与cd3的表达比例介于0.8～1.5之间。

实施例3

评价lag3抗体的生物学活性的方法。

用1ml含10％fbs的rpmi1640完全培养基重悬raji细胞至活细胞密度为5×10e6/ml，在raji细胞中加入丝裂霉素c至终浓度为2.5μg/ml，37℃细胞培养箱静置处理30min。补加dpbs至10ml，250×g离心5min后，吸弃上清后，用dpbs再次洗涤细胞一次。

最后，细胞完全培养基重悬raji细胞至活细胞浓度为2×10e5/ml。取jurkat-hlag3#14(实施例2提供的)细胞液，250×g离心5min后，调整活细胞浓度至1×10e6/ml。

将raji细胞和jurkat-hlag3#14细胞按等体积混匀后，按100μl/孔均分至96孔平底板中。用细胞完全培养基稀释抗hlag3抗体至所需浓度。按100μl/孔均分至96孔平底板中。将96孔板转移至37℃，5％co2细胞培养箱中，培养1天。

收集细胞上清，用humanil-2,uncoatedelisakit(ebioscience，cat.88-7025)进行il-2的定量检测。

验证例1

验证丝裂霉素c的浓度对于raji细胞的影响。

采用实施例3提供的方法，并设置6组试验例(试验例1～6)，试验例1～6分别采用不同作用浓度的丝裂霉素c处理raji细胞，丝裂霉素c处理浓度分别为10μg/ml、7.5μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml、1μg/ml以及0μg/ml。丝裂霉素c处理raji细胞1～3天后，检测细胞活性，检测结果如图4所示。

图4a为不同浓度下，细胞存活率检测结果，图4b为不同浓度下，活细胞密度检测结果。

由图4a和4b可知，当丝裂霉素c的作用浓度为2.5μg/ml时，经处理1～3天后的raji细胞活率不受影响，同时能以最小丝裂霉素浓度抑制raji细胞的生长。

验证例2

验证外源刺激因子对评价lag3抗体的生物学活性的方法的影响。

采用实施例3提供的方法，设置5组试验例(试验例1～5)，试验例1～4的区别条件在于分别依次采用5μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml以及0μg/mlokt3(外源刺激因子)提前包被平板，试验例5为实验当天加入葡萄球菌肠毒素seb。

5组试验例均对照设置有人igg4抗体对照组(humanigg4isoctrl组)和空白对照组(blankctrl组)，检测各试验例中lag3抗体relatlimab促进jurkat-hlag3分泌il2的情况，检测结果如图5所示。

由图5可知，在不进行okt3或seb刺激的条件下，jurkat-hlag3经raji细胞处理，并加入抗lag3抗体relatlimab后，能恢复分泌相当或更多的细胞因子il-2，因此，实施例3提供的方法不需要外源刺激因子的加入。

验证例3

验证jurkat细胞与raji细胞混合比例以及共孵育时间对评价lag3抗体的生物学活性的方法的影响。

采用实施例3提供的方法，对照设置5组试验例，5组试验例的区别条件在于jurkat-hlag3和raji细胞的细胞数量比依次为1:40、1:20、1:10、1:5以及1:2，每组试验例对照设置2组对照组(humanigg4isoctrl组和blankctrl组)。检测jurkat-hlag3、raji细胞以及relatlimab共孵育1天、2天和3天后评价体系中的il2分泌结果，检测结果如图6所示。

由图6可知，il-2在孵育1天后分泌量相对孵育2天或3天较高；当jurkat-hlag3细胞和raji细胞的混合比例为5:1时，相对其他混合比例，il2分泌量相对较高，同时检测到加入抗lag3抗体relatlimab介导的刺激jurkat-hlag3恢复il2分泌的能力显著。

验证例4

验证评价lag3抗体的生物学活性的方法的可行性。

选择6个抗hlag3抗体采用实施例3提供的方法进行抗体活性评价，分别检测il2的表达量，检测结果如图7所示。

由图7可知，不同的抗hlag3抗体在该体系中il-2的表达量不同。该体系可用于抗hlag3抗体体外活性的评价。

验证例5

验证评价lag3抗体的生物学活性的方法的特异性。

采用流式分析术，检测jurkat-hlag3和raji细胞上pd1和pdl1的表达，结果如图8所示，jurkat-hlag3和raji细胞上均有pd1和pdl1的表达。

本实施例采用实施例3提供的方法，设置8组试验例，8组试验例的区别在于待评价抗体不同，区别如下：

试验例1：10μg/ml人lag3抗体(relatlimab)；

试验例2：10μg/mlopdivo(抗hpd1抗体)；

试验例3：0.1μg/mlopdivo；

试验例4：10μg/mlhigg4iso；

试验例5：noab(空白对照)；

试验例6：10μg/mlrelatlimab+1μg/mlopdivo；

试验例7：10μg/mlhlg4iso+1μg/mlopdivo；

试验例8：noab+1μg/mlopdivo；

检测8组试验例的il-2的分泌情况，检测结果如图9所示。由图9可知，仅用relatlimab作用时，jurkat-hlag3细胞有增加il-2的分泌量，说明该体系仅适用用于抗hlag3抗体的体外活性评价。

综上，本发明实施例提供了一种表达lag3蛋白的细胞和用于评价lag3抗体活性的试剂盒及其方法，该用于评价lag3抗体活性的方法包括将上述表达lag3蛋白的细胞与表达mhcii的细胞混合，作为评价体系，通过检测评价体系中分泌的细胞因子的量来鉴定待评价lag3抗体的生物学活性，该体系具有稳定性好，构建周期短，过程简单等优点。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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<110>深圳市菲鹏生物制药股份有限公司

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