基于二硫化铼纳米片构建三型胶原蛋白光电化学传感器的方法及应用与流程

本发明属于新型纳米功能材料与生物传感技术领域，尤其涉及一种基于二硫化铼纳米片构建三型胶原蛋白光电化学传感器的方法及应用。

背景技术：

腹主动脉瘤(abdominalaorticaneurysm，aaa)是一种严重的进展性退行性疾病，表现为腹主动脉的扩张，伴随着动脉壁细胞外基质的降解和慢性炎症的发生。aaa在65岁以上的老年男性中发病率高达8％，其中男性略高于女性，是我国第13位的致死原因。吸烟、高龄和动脉粥样硬化已经被证实是诱发aaa最主要的危险因素。大多数aaa患者除了偶尔的腹痛外并没有明显的临床症状，少数患者在发现时瘤体即已破裂，破裂后死亡率高达80％，对人体健康和生命有严重危害。因此，早期筛查诊断对于防治腹主动脉瘤或主动脉夹层具有重要意义。

目前超声检查、ct和mri是筛查腹主动脉瘤或主动脉夹层的主要手段，然而由于受到医疗条件和成本的限制，通过上述方法进行大规模的早期筛查防治不够方便快捷。研究表明，三型胶原蛋白的异常表达在腹主动脉瘤的发病中起着重要作用。目前检测三型胶原蛋白的方法主要有色谱法、质谱法、酶联免疫法。上述检测方法存在操作复杂繁琐、特异性和灵敏性不高、且费时等缺点。因此，亟需提供一种检测成本低、快速高效、且灵敏度高、特异性强的三型胶原蛋白传感器具有重要意义。

光电化学化学传感器由于灵敏度高、特异性强、检测成本低等特点，近几年被越来越多的研究者所关注。光电化学传感器是当外加光源激发光敏材料导致电子-空穴对进行分离，电子供体占据电子空穴时，电子在电极、半导体、修饰物和分析物上传递形成光电流，且分析物浓度的变化会引起光电流大小的变化，这种变化可以反映分析物浓度和光电流大小的关系，从而实现对分析物的定量分析。然而，光电化学传感器的技术难点在于如何提高光电流的大小及其稳定性。

过渡金属二硫化物由于其优异的光电化学性能被广泛应用于催化和光电领域。二硫化铼(化学式为res2)纳米材料为具有直接带隙性质的过渡金属二硫化物，其剥离以后为片状的二维层状结构纳米材料，具有较大的比表面积和优异的光电化学活性。目前，二硫化铼纳米片的剥离方法主要是在单一溶剂中采用水浴超声剥离，由于超声能量不集中，导致整个剥离过程耗时长、且剥离效果不佳。因此，有必要研究一种新的二硫化铼纳米片剥离方法，以提高其剥离效果、并缩短其剥离时间。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术存在的问题，提供一种基于二硫化铼纳米片构建三型胶原蛋白光电化学传感器的方法及应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种基于离子液体辅助剥离的二硫化铼纳米片的制备方法，步骤如下：将1-丁基-3-十二烷基咪唑溴盐溶于n-甲基吡咯烷酮中，再向其中加入res2粉末，用探针超声机超声处理，得到分散有res2纳米片的溶液，再经离心、洗涤、干燥，即得到res2纳米片。

本发明还提供所述1-丁基-3-十二烷基咪唑溴盐的制备方法，包括如下步骤：

(1)将氢化钠少量多次加入含咪唑的乙腈溶液中，冰浴下反应制得白色咪唑钠的乙腈悬浊液，冷却至室温备用；

(2)向上述悬浊液中加入溴代十二烷，并于回流温度下搅拌过夜，待反应结束后抽滤，然后取滤液旋干溶剂得到粗产品，再经纯化处理后得到淡黄色油状液体十二烷基咪唑；

(3)将步骤(2)得到的十二烷基咪唑、溴代正丁烷溶于乙腈中，并于回流温度下搅拌过夜，待反应结束后旋干溶剂得到粗产品，再经纯化后得到黄色粘稠油状液体1-丁基-3-十二烷基咪唑溴盐。

作为上述方案的进一步限定，所述氢化钠、咪唑、溴代十二烷的摩尔比为4:2:1。

作为上述方案的进一步限定，步骤(3)中，所述十二烷基咪唑溴盐、溴代正丁烷的摩尔用量比为1:1～3。

作为上述方案的进一步限定，所述1-丁基-3-十二烷基咪唑溴盐与res2粉末的用量比为2～8:1。

作为上述方案的进一步限定，所述探针超声处理时间为2～4h，功率为300w，超声机设置工作5s停顿2s。

作为上述方案的进一步限定，所述离心为先500rpm离心5min，再于12000rpm离心15min。本发明首先通过500rpm离心5min以除掉块状res2，再将含有res2纳米片的上清液在12000rpm下离心除去溶剂，从而获得比表面积及光电化学性能优异的res2二维片层纳米材料。

本发明还提供所述一种基于二硫化铼纳米片构建三型胶原蛋白光电化学传感器的方法，包括如下步骤：

s1、玻碳电极预处理：直型的裸玻碳电极(直径3mm)，用0.3μmal2o3悬浊液抛光，蒸馏水冲洗干净，然后依次在hno3、乙醇、二次蒸馏水中超声清洗，晾干备用；

s2、取6～12μl上述任一方法制备得到的res2纳米片分散液滴涂至步骤s1所得洁净的玻碳电极表面，室温下晾干，制得res2/gce修饰电极；

s3、在步骤s2制得的电极表面继续滴涂5～8μl的10μg/ml的三型胶原蛋白抗体溶液，室温晾干，用ph＝7.4的pbs缓冲溶液洗去未固定的抗体，得anti-ⅲ-col/res2/gce修饰电极；

s4、再将anti-ⅲ-col/res2/gce修饰电极在戊二醛蒸汽中交联5min，用ph＝7.4的pbs缓冲溶液洗净，室温晾干；

s5、将步骤s4制得的修饰电极置于0.25wt％牛血清白蛋白溶液中浸泡0.5h，以封闭电极表面可能存在的非特异性结合位点，取出后用ph＝7.4的pbs缓冲溶液洗净，室温晾干，得anti-ⅲ-col(bsa)/res2/gce修饰电极，即三型胶原蛋白光电化学传感器，放置于4℃冰箱中保存待用。

本发明还提供上述方法制备的基于二硫化铼纳米片构建的三型胶原蛋白光电化学传感器在定性和/或定量检测三型胶原蛋白抗原中的应用。

所述的基于二硫化铼纳米片构建的三型胶原蛋白光电化学传感器检测三型胶原蛋白抗原的方法，包括如下步骤：

a、标准溶液配制：配制一组包括空白标样在内的不同浓度的三型胶原蛋白抗原标准溶液；

b、工作电极修饰：以上述制备方法制得的光电化学传感器为工作电极，将工作电极置于步骤a中配制的浓度分别为0.0005，0.001，0.01，0.1，1，10，50，100，1000ng·ml^-1的三型胶原蛋白抗原标准溶液中进行孵育，制得ⅲ-col-anti-ⅲ-col(bsa)/res2/gce修饰电极；

c、工作曲线绘制：使用电化学工作站的三电极体系进行测试，将步骤b制得的ⅲ-col-anti-ⅲ-col(bsa)/res2/gce修饰电极作为工作电极、铂片电极作为对电极、饱和甘汞电极作为参比电极，在以抗坏血酸的磷酸缓冲溶液作为支持电解质的溶液中进行测试；采用i-t测试手段，根据所得的光电流值与三型胶原蛋白抗原标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线；

d、测试待测样品的光电流值，结合工作曲线，测算待测样品中三型胶原蛋白抗原的浓度。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明成功制备了1-丁基-3-十二烷基咪唑溴盐离子液体，然后以该离子液体为辅助试剂，借助探针超声剥离二硫化铼粉体成功制备出具有良好生物相容性和大的比表面积的二维片层纳米材料，并基于该二硫化铼纳米片修饰电极，负载三型胶原蛋白抗体，成功构建了三型胶原蛋白光电化学传感器。本发明三型胶原蛋白光电化学传感器的制备方法简单，实现了样品中三型胶原蛋白抗原的快速、灵敏及高选择性检测，且制作成本低，可应用与便携式检测，在医疗领域具有广阔的应用前景。

(2)本发明首次提出将1-丁基-3-十二烷基咪唑溴盐离子液体用于剥离二硫化铼，在剥离过程中离子液体的长链可伸入res2的片层结构中以辅助片层之间克服静电作用力，从而提高res2的剥离效率；另一方面离子液体可附着在res2片层表面，从而阻止已完成剥离的片层res2再次聚合团聚，以提高res2的分散性及稳定性。

(3)本发明采用探针超声机对res2粉体进行剥离，震源可直接与二硫化铼溶液接触，且超声能量更加集中，从而大大缩短了res2的剥离时间，以提高res2的剥离效率及其光电化学活性。

(4)本发明首次将二硫化铼二维片层结构纳米材料应用于光电化学生物传感器的制备，由于res2二维片层结构纳米材料为直接带隙性质的过渡金属二硫化物，从而有助于光生电子-空穴的分离，且生物相容性好、比表面积大，有助于保持抗体生物活性，以提高检测灵敏度。

(5)离子液体导电性好、生物相容性好、且电位窗口宽，本发明利用离子液体作为剥离试剂辅助剥离过渡金属二硫化物，不仅有助于保持抗体生物活性，同时离子液体可作为电子导体协同提高传感器的检测灵敏度。

(6)本发明采用离子液体作为剥离试剂，绿色环保，同时为光电材料在电化学传感器方面的应用提供了新的更广阔的发展前景，具有更加广泛地潜在使用价值。

附图说明

图1为实施例1制得的1-丁基-3-十二烷基咪唑溴盐离子液体的核磁共振波谱表征。

图2为实施例2制得的res2纳米片的透射电子显微镜表征图。

图3为实施例2制得的res2纳米片的原子力显微镜表征图。

图4为实施例2制得的res2纳米片的紫外可见吸收光谱图。

图5中(a)、(b)分别为实施例2制得的res2纳米片中铼、硫两种元素的x–射线光电子能谱分析结果。

图6为实施例2制得的res2纳米片的x射线粉末衍射表征结果。

图7为本发明ⅲ-col光电化学传感器制备过程示意图。

图8为本发明光电化学传感器的光电流响应与孵育时间的关系曲线图。

图9为本发明光电化学传感器的光电流响应与孵育温度的关系曲线图。

图10为本发明光电化学传感器的光电流响应与坏血酸浓度的关系曲线图。

图11为本发明制备的裸gce(曲线a)，res2/gce(曲线b)，anti-ⅲ-col/res2/gce(曲线c)，anti-ⅲ-col(bsa)/res2/gce(曲线d)和ⅲ-col-anti-ⅲ-col(bsa)/res2/gce(曲线e)的交流阻抗图。

图12为本发明制备的裸gce(曲线a)，res2/gce(曲线b)，anti-ⅲ-col/res2/gce(曲线c)，anti-ⅲ-col(bsa)/res2/gce(曲线d)和ⅲ-col-anti-ⅲ-col(bsa)/res2/gce(曲线e)的光电流-时间响应曲线。

图13中(a)、(b)分别为res2修饰电极、anti-ⅲ-col/res2修饰电极的界面扫描电子显微镜表征图。

图14中(a)、(b)分别为实施例3所制备的光电化学传感器对于不同浓度ⅲ-col抗原的光电流响应情况图、传感器对ⅲ-col响应的线性关系曲线。

图15为本发明制得的光电化学传感器的抗干扰性能实验结果。

图16为本发明制得的光电化学传感器的光电流-时间稳定性实验结果。

图17中(a)、(b)分别为对比例1、实施例2制得的res2/gce修饰电极在0.1mol·l^-1抗坏血酸的0.1mol·l^-1pbs缓冲溶液(ph＝7.0)中进行光电化学性能测试的结果图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明；应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明；除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

以下实施例中所用白光灯为5w高亮外置白光光源，购自“光概念车灯饰品店”淘宝店，网址为：http://item.taobao.com/item.htm？spm＝a1z09.2.9.101.lfdgy0&id＝39175152864&_u＝fp3euhgb0aa&qq-pf-to＝pcqq.c2c，生产厂家为惠州市云峰照明科技有限公司。

白光led灯发出的光源经由直径为8mm的光纤引导至电极表面，采用辐射计测定其光强度为180mw/cm²。

下面通过具体的实施例子并结合附图对本发明做进一步的详细描述。

实施例1

一种1-丁基-3-十二烷基咪唑溴盐离子液体，其制备方法如下：

(1)称取氢化钠(0.04mol，0.96g)少量多次加入含咪唑(0.02mol，1.36g)的120ml乙腈溶液中，冰浴反应3h后形成白色咪唑钠的乙腈悬浊液，冷却至室温备用；

(2)加入溴代十二烷(0.01mol，2.42g)至步骤(1)得到的咪唑钠的乙腈悬浊液中，升温至65℃，搅拌过夜，点板监测反应进程，反应完成后抽滤，除掉不溶杂质后旋转蒸发除掉乙腈得到粗产品，再经由硅胶柱梯度洗脱，洗脱剂为(ch2cl2:meoh＝10:1)，得到淡黄色油状液体十二烷基咪唑；

(3)将步骤(2)得到的十二烷基咪唑(0.01mol，2.36g)，溴代正丁烷(0.02mol，2.74g)溶于40ml乙腈中，升温至65℃，搅拌过夜，点板监测反应进程，反应完全后旋转蒸发除掉乙腈得到粗产品，经由硅胶柱梯度洗脱，洗脱剂为(ch2cl2:meoh＝10:1)，得到黄色粘稠油状液体1-丁基-3-十二烷基咪唑溴盐。

¹hnmr(400mhz，d2o)δ：9.55(s,1h),7.92(s,2h),4.20(dd,j＝12.7,6.9hz,4h),1.87–1.67(m,4h),1.43–1.10(m,20h),0.85(t,j＝7.4hz,3h),0.80(t,j＝6.7hz,3h)。如图1所示，通过图谱化学位移值以及峰面积的积分，可以确定分子中氢原子的种类和含量，从而证实产物的结构正确。

实施例2

一种基于离子液体辅助剥离的二硫化铼纳米片的制备方法，步骤如下：

(1)取0.1g1-丁基-3-十二烷基咪唑溴盐于离心管中，加入15mln-甲基吡咯烷酮使之溶解完全，再向其加入20mgres2粉末，用探针超声机超声，探针超声处理时间为3h，功率为300w，超声机设置工作5s停顿2s，得到分散有res2纳米片的溶液；

(2)将步骤(1)所得的res2纳米片分装于离心管中，使用500rpm离心5min以除掉块状res2，收集含有res2纳米片的上清液，再于12000rpm离心15min除掉溶剂，再用去离子水和无水乙醇交替离心洗涤三遍，真空干燥，得到res2纳米片。

图2为本实施例制得的res2纳米片的透射电子显微镜表征图，从图中结果可以看出，经过超声剥离后res2为纳米薄片结构，且res2纳米片分散均匀，堆叠形成尺寸约为100～300nm的res2纳米薄片。

图3为本实施例制得的res2纳米片的原子力显微镜表征图，从图中可以看出，本发明制得的res2纳米片的厚度为5-6层，且片层结构明显。

图4为本实施例制得的res2纳米片的紫外可见吸收光谱图，从图中可以看出，res2纳米片在nir区域显示出较强的吸收，并且在812.5nm处出现一个特征吸收峰。由此说明本发明制得的res2纳米片具有较强的光吸收能力，有助于提高传感器的光电转换效率及检测灵敏度。

图5中(a)、(b)分别为本实施例制得的res2纳米片中铼、硫两种元素的x–射线光电子能谱分析结果。图中41.95ev和44.35ev归属于re⁴⁺4f7/2、re⁴⁺4f5/2的电子结合能；162.4ev和163.6ev归属于硫(s^2-2p3/2和s^2-2p1/2)的两个特征峰。从而表明本发明成功制备了res2纳米片。

图6为本实施例制得的res2纳米片的x射线粉末衍射表征结果，res2纳米片在2θ值约为14.6°，29.6°，44.9°和61.2°处出现了四个强的衍射峰，分别对应于res2三斜晶相的(100)，(002)，(3-21)和(203)四个晶面。该测试结果与纯三斜晶res2的jcpds卡片no.24-0922一致。由此表明本发明成功制备了res2纳米片。

实施例3

如图7所示，一种基于二硫化铼纳米片构建三型胶原蛋白光电化学传感器的方法，包括如下步骤：

s1、玻碳电极预处理：直型的裸玻碳电极(直径3mm)，用0.3μmal2o3悬浊液抛光，蒸馏水冲洗干净，然后依次在hno3、乙醇、二次蒸馏水中超声清洗，晾干备用；

s2、将实施例2制得的res2纳米片分散于水中形成2mg·ml^-1的分散液，取8μlres2分散液滴涂至步骤s1所得洁净的玻碳电极表面，室温下晾干，制得res2/gce修饰电极；

s3、在步骤s2制得的电极表面继续滴涂6μl10μg/ml的三型胶原蛋白抗体溶液，室温晾干，用0.01mol·l^-1ph＝7.4的pbs缓冲溶液洗去未固定的抗体，得anti-ⅲ-col/res2/gce修饰电极；

s4、再将anti-ⅲ-col/res2/gce修饰电极在戊二醛蒸汽中交联5min，用0.01mol·l^-1ph＝7.4的pbs缓冲溶液洗净，室温晾干；

s5、将步骤s4制得的修饰电极置于0.25wt％牛血清白蛋白溶液中浸泡0.5h，以封闭电极表面可能存在的非特异性结合位点，取出后用ph＝7.4的pbs缓冲溶液洗净，室温晾干，得anti-ⅲ-col(bsa)/res2/gce修饰电极，即三型胶原蛋白光电化学传感器，放置于4℃冰箱中保存待用；

s6、将anti-ⅲ-col(bsa)/res2/gce修饰电极分别置于不同浓度的ⅲ-col抗原溶液中，其浓度分别为：0.0005，0.001，0.01，0.1，1，10，50，100，1000ng·ml^-1，35℃孵育25min，然后用0.01mol·l^-1ph＝7.4的pbs缓冲溶液洗净，得ⅲ-col-anti-ⅲ-col(bsa)/res2/gce修饰电极，即结合了ⅲ-col的三型胶原蛋白的光电化学传感器，4℃保存备用。

s7、自组装光电化学测试系统：以5w的白光灯为激发光源，经光纤引导至电极表面，采用三电极系统测试光电流：以3mm的直型玻碳电极作为工作电极，hg/hg2cl2电极(饱和kcl)作为参比电极，铂丝电极作为对电极，光电流由chi660e电化学工作站(上海辰华仪器公司)测定。光电流在恒定电位(0.05vvshg/hg2cl2)、0.1mol·l^-1抗坏血酸的0.1mol·l^-1pbs缓冲溶液(ph＝7.0)中进行。

关于步骤s6中，ⅲ-col抗原的最佳孵育时间可通过考察传感器的光电流响应与孵育时间的关系曲线来确定，结果如图8所示。由图中结果可知：在10～35min范围内，随着孵育时间延长，免疫传感器识别ⅲ-col前后的电流响应差值快速增加，25min后趋于稳定，表明抗原-抗体免疫结合趋于饱和，因此，本发明选择25min为最佳孵育时间。

关于步骤s6中，ⅲ-col抗原的最佳孵育温度可通过考察传感器的光电流响应与孵育温度的关系曲线来确定，结果如图9所示。由图中结果可知：在25～45℃范围内，随孵育温度升高，免疫传感器识别ⅲ-col前后的电流响应差值快速增加，35℃时达到最大值；当温度高于35℃后，会影响蛋白质活性，降低其识别能力，电流响应差值降低。因此，本发明选择35℃为最佳孵育温度。

关于步骤s7中，抗坏血酸的最佳浓度是通过同一传感器在不同浓度抗坏血酸的0.1mol·l^-1pbs缓冲溶液(ph＝7.0)中的光电流-时间响应曲线来确定，结果如图10所示。由图中结果可知：从0～0.10mol·l^-1，随着抗坏血酸浓度逐渐增加，光电流也逐渐増大。随抗坏血酸浓度进一步增大，光电流减小。这是由于浓度太大，抗坏血酸在溶液中的吸光度增加，从而导致照射到电极表面的光强度下降而致使量子点的激发效率降低。因此，考虑到电极响应对抗坏血酸浓度的敏感性，本发明选择0.10mol·l^-1作为抗坏血酸的最佳浓度。

以下光电化学性能测试也均选用上述确定下来的最佳参数条件。

实施例4

如图11所示，对实施例3各步骤所制得的修饰电极进行电化学交流阻抗谱(eis)表征，eis是探索化学修饰电极界面性质的有效工具之一。其谱图一般分为高频部分和低频部分，其中高频部分为动力学控制区域，低频部分为扩散控制区域。在5.0mmol·l^-1k3[fe(cn)6]/k4[fe(cn)6](1:1)+0.1mol·l^-1pbs(ph＝7.0)+0.1mol·l^-1kcl溶液中进行交流阻抗表征，并用randlescircuit拟合电路计算电极界面的电荷传递电阻，在randlescircuit拟合电路中，界面电荷传递电阻(rct)、扩散电阻(zw)与界面电容(cdl)并联，半圆的直径对应于界面电荷传递电(rct)。nyquist曲线如图11所示，可以看出裸电极(曲线a)的交流阻抗图谱在高频部分的半圆很小，经模拟计算其rct为68.0ω；当res2纳米片修饰至电极表面后，其高频部分的半圆直径增加(曲线b)，阻抗较大，界面电荷传递电阻增至1305.6ω；曲线c是anti-ⅲ-col/res2修饰电极界面的交流阻抗谱图，由于抗体是不利于电子传递的生物大分子，会阻碍界面的电子传递，界面电荷传递电阻增加为1337.6ω；当用bsa封闭电极表面可能存在的非特异性活性位点后，交流阻抗谱的半圆直径大大增加(曲线d)，模拟计算其电荷传递电阻为4391.7ω；当免疫传感器与0.1ng·ml^-1ⅲ-col抗原特异性结合后，抗原-抗体复合物覆盖电极表面，其界面电荷传递电阻进一步增加，达到8178.8ω(曲线e)。以上结果表明，本发明经逐步修饰后，成功制备出ⅲ-col光电化学传感器。

如图12所示，当修饰电极表面结合anti-ⅲ-col抗体(c)及bsa(d)封闭非活性位点后，res2修饰电极的光电流由14μa分别下降至10.25μa、7.23μa。这可能是由于蛋白对电子传递的阻碍作用，使溶液中电子给体抗坏血酸难以扩散至电极表面，从而导致光电流强度的降低。当免疫传感器进一步与0.1ng·ml^-1ⅲ-col抗原特异性结合后(e)，观察到光电流强度进一步减小至5.86μa。由此表明本发明成功制备了ⅲ-col光电化学传感器。

采用扫描电子显微镜对电极修饰过程中的界面进行了表征，图13中(a)、(b)分别为res2修饰电极、anti-ⅲ-col(bsa)/res2修饰电极的界面。从图中可以看出，当res2修饰至电极表面后，电极表面覆盖了大量片层结构的res2纳米材料，这种片层结构的纳米薄膜具有比表面积大的特点，有利于提高抗体在电极表面的吸附能力和作用位点，更有利于电子传导，以提高传感器的光电转换效率；当进一步修饰ⅲ-col抗体后，我们发现res2片层结构被ⅲ-col抗体蛋白覆盖，且界面较修饰抗体前模糊，这可能是由于戊二醛与抗体间发生交联作用所致。以上结果表明，免疫传感器层层修饰制备成功。

本发明采用光电流-时间法考察了实施例3中的光电化学传感器对于不同浓度ⅲ-col抗原的光电流响应情况，图14中(a)、(b)分别为实施例3所制备的光电化学传感器对于不同浓度ⅲ-col抗原的光电流响应情况图、传感器对ⅲ-col响应的线性关系曲线。从图中结果可以看出：当ⅲ-col的浓度在0.0005～1000ng·ml^-1之间时，anti-ⅲ-col(bsa)/res2修饰电极键合ⅲ-col抗原前后的光电流差值(δi＝i0-i)与ⅲ-col抗原浓度的对数成良好的线性关系，线性方程为：δi＝0.362logcⅲ-col(ng·ml^-1)+1.778(r＝0.996)，检出限为0.1pg·ml^-1(s/n＝3)。这表明基于1-丁基-3-十二烷基咪唑溴盐离子液体辅助剥离的res2纳米片构建的光电化学传感器可用于ⅲ-col抗原的高灵敏检测。

实施例5

抗干扰性能是衡量光电化学传感器的实用性的重要指标之一。为了考察本发明实施例3制得的ⅲ-col光电化学传感器的特异性识别性能，本实施例选取了癌胚抗原(cea)，神经元特异性烯醇酶(nse)，人血清白蛋白(has)，甲胎蛋白(afp)和鳞状细胞癌抗原(scca)五种肿瘤标志物作为干扰项进行选择性实验。将0.1ng·ml^-1的ⅲ-col分别与10ng·ml^-1的cea、nse、has、afp、scca溶液混合，在最佳条件下进行光电化学测试，结果如图15所示。由图中结果可知：干扰物加入前后免疫传感器的光电流响应差值无明显变化，因此，表明本发明制得的光电化学传感器具有良好的选择性。

为进一步考察本发明制得的ⅲ-col光电化学传感器的可重复性，同时制备了六支anti-ⅲ-col(bsa)/res2/gce，用于测试浓度为0.1ng·ml^-1的ⅲ-col抗原溶液的光电流变化情况。通过计算6支传感器测定结果的相对标准偏差为3.7％，表明本发明制得的光电传感器具有良好的可重复性。

为了考察所制备的免疫传感器的稳定性。我们将制备好的传感器置于ph＝7.4的磷酸缓冲溶液中，4℃冰箱中保存备用，2周后用于测试浓度为0.1ng·ml^-1ⅲ-col抗原溶液的光电流变化情况。实验发现光电流响应差值为初始值的91.6％，说明该免疫传感器稳定性较好，能较好的维持抗体的生物活性。

此外，为了进一步考察所制备的anti-ⅲ-col(bsa)/res2/gce修饰电极的稳定性。通过控制led光源开关使每次光照时间约为10s，在10分钟内对电极连续激发16次以上，结果如图16所示。从图中结果可以看出：光电流信号稳定，几乎无明显的光电流衰减现象。说明我们该修饰电极在0.10mol·l^-1的抗坏血酸溶液中具有非常好的稳定性，可以用作免疫传感器。

实施例6

为了考察本发明所制备的光电化学传感器的实际应用价值，我们将其用于检测临床血清样品中ⅲ-col的含量。本实验选取了临床2位患有腹主动脉瘤的患者，采集患者接受手术前、后的血清样品，并用0.01mol/lph＝7.4的pbs缓冲溶液按1:50的比例稀释后，用作待测样品，以测试本发明所制备的anti-ⅲ-col(bsa)/res2/gce传感器的实用性，每个血样测定3次，其测定结果见下表1。

表1临床血清样品中ⅲ-col含量测定结果

由上表结果可知：患者a和b接受手术后，血清中ⅲ-col的水平增加，说明通过手术治疗能够对腹主动脉瘤患者起到积极作用，且本发明测定结果准确可靠，有望用于临床腹主动脉瘤的筛查诊断中，具有广阔的潜在应用价值。

对比例1

本对比例提供一种基于离子液体辅助剥离的二硫化铼纳米片的制备方法，与实施例2相比，不同之处在于：直接将20mgres2粉末均匀分散于15mln-甲基吡咯烷酮，用探针超声机超声，探针超声处理时间为3h，功率为300w，超声机设置工作5s停顿2s，得到分散有res2纳米片的溶液。其余与实施例2均相同，在此不再赘述。

将本对比例制得的res2纳米片分散于水中形成2mg/ml的分散液，取8μlres2分散液滴涂至步骤s1所得洁净的玻碳电极表面，室温下晾干，制得res2/gce修饰电极。

将本对比例及实施例2制得的res2/gce修饰电极在0.1mol·l^-1抗坏血酸的0.1mol·l^-1pbs缓冲溶液(ph＝7.0)中进行光电化学性能测试，结果分别如图17中(a)、(b)所示。从图中结果可以看出，本发明通过采用1-丁基-3-十二烷基咪唑溴盐离子液体作为剥离试剂辅助剥离制得的res2纳米片的光电流值为14μa，明显高于传统方法剥离制得的res2纳米片的光电流值9μa。由此表明本发明通过采用1-丁基-3-十二烷基咪唑溴盐离子液体辅助剥离res2纳米材料，能够显著提高res2的剥离效率及光电化学性能。

以上所述，仅为本发明的说明实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，做出的若干改进和补充也应视为本发明的保护范围；凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明精神和范围的情况下，利用以上所揭示的技术内容做出的些许更改、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所做的任何等同变化的更改、修饰与演变，均仍属于本发明的保护范围。