一种动物源性食品中氨基糖苷类药物残留量的检测方法与流程

本发明涉及一种氨基糖苷类药物残留量的检测方法，尤其是一种动物源性食品中氨基糖苷类药物残留量的检测方法。

背景技术：

氨基糖苷类兽药在预防和控制动物疫病中发挥着重要的作用，但其在动物源性食品中残留可能给人体健康带来严重的危害，因而成为人们日益关注的公共卫生问题。我国农业部规定牛奶中链霉素的最大残留限量(mrl)为200μg/kg；日本肯定列表制度规定牛肉、猪肉中链霉素和双氢链霉素总量的mrl为0.6mg/kg；欧盟规定蜂产品、牛奶、肉和肝脏中链霉素的mrl分别为0.2、0.2、0.5和0.5mg/kg；美国食品药品管理局(fda)规定在奶中链霉素的mrl为0.125mg/kg；世界卫生组织(who)和(cac)规定牛肉和牛奶中链霉素和双氢链霉素的mrl分别为0.5mg/kg和0.2mg/kg。因此,发展快速、准确、灵敏的残留检测方法显得尤其重要，也成为当前研究的热点问题。

氨基糖苷类抗生素(aminoglycosides)是由氨基糖与氨基环醇通过氧桥连接而成的苷类抗生素，代表药物有链霉素、庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素等，种类结构类似，极性强，多易溶于水，水溶液中以多聚离子形式存在，性质稳定，多无发光团，没有特征的紫外吸收，因此在进行hplc-uv检测时，必须通过柱前或柱后衍生化，若采用非衍生化法多采用lc-ms，hplc-elsd法。

由于氨基糖苷类药物的特殊结构和检测难度，近几年国内外检测此类抗生素的方法主要以液质联用法为主。但是由于氨基糖苷类药物易溶于水，极性很强，在c18柱上保留很弱，且无紫外吸收，目前使用最多的是通过加入七氟丁酸离子对试剂增强保留，动物源食品基质复杂，给目标物的定性和定量检测带来很大的难度。目前文献报道的方法前处理步骤繁琐，整个检测周期长，基质效应较为严重，很难获得良好的峰型和分离。

技术实现要素：

基于此，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种不使用七氟丁酸离子化试剂且能高效检测氨基糖苷类药物残留含量的方法。

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案为：一种动物源性食品中氨基糖苷类药物残留量的检测方法，包括以下步骤：

(1)制备氨基糖苷类标准溶液，选取基质进行配标；

(2)将待测样品进行提取、净化后，采用液相色谱串联质谱进行检测，得到动物源性食品中氨基糖苷类药物残留量；

液相色谱条件如下：

色谱柱：hilic色谱柱；

流动相a：体积百分含量为0.1％的甲酸甲酸铵溶液；

流动相b：体积百分含量为0.1％的甲酸乙腈溶液；

梯度洗脱程序：以体积分数计，在0～1min，流动相a为10％，流动相b为90％；在1～5min，流动相a为10～97％，流动相b为90～3％；在5～7min内，流动相a为97％，流动相b为3％；在7.1～8min，流动相a为97～10％，流动相b为3～90％；在8.1～12min，流动相a为10％，流动相b为90％。

由于氨基糖苷类药物残留结构稳定，且无紫外吸收；本申请采用液相质谱质/谱联用仪，能有效的减少基质干扰，同时通过提供电离所需的离子，增强电离程度和响应，达到有效分离和检测的目的。

优选地，所述提取过程为：将待测样品利用酸化乙腈进行涡旋振荡重复提取2次。

更优选地，所述酸化乙腈为质量百分含量为2％的甲酸乙腈，每次提取的提取体积为10ml，ph为2.5～3.5。

优选地，所述质谱条件为：电喷雾电离离子源；检测方式为多反应监测扫描模式；扫描方式为正离子扫描；喷雾电压5.5kv；毛细管温度为550℃；雾化气压力为50psi；辅助气压力为50psi；气帘气压力为25psi；碰撞气压力为8psi。

优选地，所述净化过程包括上净化柱、淋洗、洗脱步骤；所述净化柱为羧酸型阳离子交换柱；所述羧酸型阳离子交换柱的型号为3ml、500mg。

更优选地，所述淋洗过程为：依次用3ml质量百分含量为5％的氨水溶液、3ml甲醇进行淋洗。

优选地，所述洗脱过程中的洗脱液为3ml质量百分含量为5％的甲酸甲醇。

优选地，所述基质为猪肉、鸡肝、鱼肉、牛奶或蜂蜜。

优选地，所述流动相a中含30mmol/ml的甲酸铵；所述流动相b中含1mmol/ml的甲酸铵。

优选地，所述步骤(2)中，在将待测样品进行提取前，在待测样品中加入亚铁氰化钾溶液和乙酸锌溶液，涡旋混匀，进行沉淀蛋白。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：

本申请液相色谱串联质谱方法不使用离子化试剂，且同时可满足多种基质的氨基糖苷类药物检测。可以很好地避免七氟丁酸等离子对试剂及仪器造成的污染及离子抑制问题；同时增加了畜禽内脏、水产品、鸡蛋、蜂蜜等基质，提取液使用了甲酸甲酸铵等常用试剂，提高了实验的通用性。

附图说明

图1为10种氨基糖苷类药物在不同提取溶剂下的回收率；

图2为10种氨基糖苷类药物使用不同固相萃取柱的回收率。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

本实施例具体说明了本申请检测方法的检测过程如下：

(一)标准配制

分别比较了流动相配标和基质配标，选取了畜禽动物肌肉、肝脏、水产品、牛奶、蜂蜜等具有代表性的基质，研究不同基质效应对目标物检测的干扰程度。

配制标准溶液：

1、分别精确称取10种氨基糖苷类标准品适量，每种都用水配制成浓度为1mg/ml的标准储备液，放置于4℃冰箱避光保存。使用时可以将储备液通过方法中的初始流动相稀释成适当浓度的标准工作液。

2、选取具有代表性的基质，如猪肉、鸡肝、鱼肉、牛奶、蜂蜜进行基质配标。

标准曲线范围：50μg/l、100μg/l、250μg/l、500μg/l、1000μg/l

(二)提取试剂的选取

由于氨基糖苷类抗生素极易跟蛋白结合，导致提取困难，所以在本研究过程中，在提取之前增加了沉淀蛋白过程【加亚铁氰化钾溶液和乙酸锌溶液各1ml，涡旋混匀，沉淀蛋白】，首先破坏此类抗生素与蛋白的络合态，增加提取效率，其次此类抗生素结构中含有多个氨基和羟基，故呈碱性，极性和水溶性较高，所以在选取提取液时，我们选取了极性强的酸化乙腈，并调节ph到3.0左右，通过提供氢离子及酸性环境，增加提取效果。

提取试剂的浓度、提取体积：2％甲酸乙腈(ph＝3±0.5)10ml，涡旋振荡重复提取2次。

(三)净化方式的选取

比较直接提取、不同类型的固相萃取柱以及选择不同的淋洗液和洗脱液的净化效果，最终确定最优的净化方式。由于氨基糖苷类化合物大部分呈碱性，所以在净化过程中我们选取了wcx(羧酸型阳离子交换柱)，增加上样过程的吸附程度，净化效果明显。

净化柱：wcx(羧酸型阳离子交换柱)3ml，500mg；

淋洗液：3ml5％的氨水溶液，3ml100％甲醇依次淋洗；

洗脱液：3ml5％甲酸甲醇。

(四)色谱条件

色谱柱：agelatechnologieshilic色谱柱(2.1×100mm，3μm)；流速：0.3ml/min；进样量：2μl；柱温：35℃；流动相a：0.1％甲酸甲酸铵溶液(含30mmol/ml甲酸铵)，流动相b：0.1％的甲酸甲酸铵乙腈溶液(含1mmol/ml甲酸铵)；梯度洗脱程序：0～1min，10％流动相a+90％流动相b；1～5min流动相a10％-97％；5～7min，97％流动相a保持2min；7.1～8min流动相a97％-10％；8.1～12min，10％流动相a保持。

(五)质谱条件

电喷雾电离离子源(electrosprayionization，esi)；

检测方式为多反应监测(mrm)扫描模式；

扫描方式是正离子扫描；

喷雾电压5.5kv；

毛细管温度550℃；

雾化气压力(gs1)为50psi；

辅助气压力(gs2)为50psi；

气帘气压力(cur)为25psi；

碰撞气压力(cad)为8psi；

多反应监测(mrm)质谱采集参数如表1所示：

表1十种氨基糖苷类药物多反应监测(mrm)质谱采集参数

*为定量离子

(六)结果分析

1、提取液的选择

由于氨基糖苷类抗生素结构中含有多个氨基和羟基，故呈碱性，极性和水溶性较高，所以在选取提取液时，我们分别比较了磷酸缓冲液、0.1％甲酸乙腈、2％甲酸乙腈(ph＝3.0±0.1)等酸化提取液，通过提供氢离子及酸性环境，增加提取效果。从附图1中可以看出，0.1％甲酸乙腈的提取效果最差，磷酸缓冲液和2％甲酸乙腈提取液(ph＝3.0±0.1)效果相当，但是基于乙腈有沉淀蛋白的效果，所以最终选择使用2％甲酸乙腈(ph＝3.0±0.1)作为提取溶液。

2、净化方式的优化

我们分别比较了watersoasishlb(60mg，3ml)、watersoasiswcx(60mg，3ml)、watersoasismcx(60mg，3ml)等三种不同类型的净化小柱，结果表明氨基糖苷类化合物在hlb上基本无保留，在mcx(强阳离子交换柱)上很难洗脱下来，而在wcx(羧酸型阳离子交换柱)有很好的保留，同时也能达到较好的净化效果。之后我们又根据回收率优化了洗脱液和淋洗液，最终选择5％氨水溶液作为淋洗液，5％甲酸甲醇溶液作为洗脱液，见附图2。

3、色谱条件的优化

本申请考察了c18和hilic两种不同色谱柱对十种氨基糖苷类药物残留的分离效果。结果表明，氨基糖胺类化合物在c18色谱柱上不易保留，出峰时间太早，容易引起基质干扰，而在亲水性的hilic色谱柱上得到了较好的保留，出峰时间明显推后，且峰型尖锐，故选用亲水性的hilic色谱柱。

分别比较了水-乙腈；甲酸水-乙腈以及甲酸甲酸铵-乙腈等不同流动性对氨基糖苷类药物响应及峰型的影响，发现在流动相里加入甲酸后，目标化合物的电离效果明显提高，而加入甲酸铵缓冲液后，有利于稳定电离所需的酸性环境，所以最终确定选用以0.1％的甲酸甲酸铵溶液和0.1％的甲酸乙腈溶液为流动相。

4、质谱条件的优化

通过优化每个化合物的锥孔电压、碰撞电压等质谱参数，选择响应最高的离子作为定量离子，次之作为定性离子，见表1。

5、方法的线性范围、检出限、回收率以及精密度

由于此类化合物基质抑制效果明显，本方法采用基质配标，外标法定量的方法，对十种氨基糖苷类药物进行测定，以待测物的浓度作为横坐标，待测物的峰面积作为纵坐标，绘制标准曲线。结果显示，壮观霉素、双氢链霉素、链霉素、巴龙霉素、卡那霉素、妥布霉素、庆大霉素在50-1000mg/l范围内线性关系良好，新霉素、潮霉素b、安普霉素在200-4000mg/l范围内呈良好线性，选择基质抑制最强的空白待测样品，添加不同浓度的质量浓度，以其3倍信噪比(s/n)确定其中壮观霉素、双氢链霉素、链霉素、巴龙霉素、卡那霉素、妥布霉素、庆大霉素的检出限lod为20μg/kg；新霉素、潮霉素b、安普霉素的检出限lod为100μg/kg，见表2。

表2十种氨基糖苷类药物线性方程和线性范围

选取空白基质样品，通过添加低、中、高三种不同浓度质量浓度(loqs、2×loqs、3×loqs)，按优化的实验条件进行检测，每个添加水平做六平行，结果表明，10种氨基糖苷类药物在猪肉、鱼肉、鸡肝中的回收率在71.5％-102％之间，相对标准偏差(rsd)在3.8％-13.2％之间，见表3。在牛奶、鸡蛋、蜂蜜中回收率在65.5％-100％之间，相对标准偏差(rsd)在2.0％-14.2％之间，见表4，满足检测要求。

表3牛奶、鸡蛋、蜂蜜中三种浓度水平下10种氨基糖苷类药物的回收率及相对标准偏差

表4猪肉、鱼肉、鸡肝中三种浓度水平下10种氨基糖苷类药物的回收率及相对标准偏差

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。