一种同时检测人尿中乙醇酸和马尿酸的浓度的方法与流程

本发明涉及生化检测分析技术领域，尤其是涉及一种同时检测人尿中乙醇酸和马尿酸的浓度的方法。

背景技术：

肾结石是我国常见的多发病，若发现一种可预测肾结石高危人群的标志物，提前对他们的饮食结构及生活方式等进行干预，从而可减轻病人的痛苦与政府的经济负担。发明人前期通过代谢组学的方法，比较了肾结石患者和正常人群尿代谢物之间的差异(具体参见：hnmr-basedmetabolomicstudyofmetabolicprofilingfortheurineofkidneystonepatients)，结果发现了15种差异代谢物，进一步通过roc曲线和logistic回归模型，发现联合“马尿酸和组氨酸”、“马尿酸和甘氨酸”、“马尿酸和乙醇酸”和“马尿酸和枸橼酸”的精确度优于单一或其它联合模型，这4组之间无统计学上的差异，敏感性均>90％”，这4组对于区分肾结石人群与对照人群，其特异性最高达84％。因此，可采用这4组代谢物中的任何一组作为标志物来预测肾结石可能发生的情况。通过检测人尿液中上述4种组合中任一组两种物质的浓度，如有一组中的两种代谢物同时异常，提示这些人为肾结石的高危人群，可提前干预并定期复查，从而降低肾结石风险。

为了让上述研究成果得到切实的应用，在肾结石的预防和干预中充分发挥作用，本发明人依据现有技术对上述任何一组的物质进行检测，均难达到采用同一种方法可快速且稳定地检测上述任一组的两种物质的浓度。

技术实现要素：

为了克服现有技术存在的上述技术问题，本发明提供一种同时检测人尿中乙醇酸和马尿酸的浓度的方法，该方法可同时检测人尿中乙醇酸和马尿酸的浓度，其检测灵敏、分析快速、重复性好，且操作简单、方法准确可靠，可为实际尿液中马尿酸和乙醇酸的分析检测提供一个良好的方法参考。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种同时检测人尿中乙醇酸和马尿酸的浓度的方法，包括如下步骤：

s01、样品采集:收集医院肾结石患者及正常对照人群的晨尿，采样时防止污染；

s02、样品的制备：分别取5ml水、10ml甲醇、5ml水对c18固相萃取小柱进行浸润、淋洗和活化；用去离子水将s01所采集的尿液稀释5倍后，用c18固相萃取小柱纯化得尿液纯化液；

s03、对样品进行离子色谱-电导法分析：将步骤s02所得的尿液纯化液用滤膜过滤器过滤后注入到离子色谱仪中对所述尿液纯化液中的马尿酸和乙醇酸浓度进行分析，其具体色谱条件如下：

分离柱：metrosepa5150阴离子交换柱，淋洗液：3.5mmol/lna2co3+3.0mmol/lnahco3，流速：0.3ml/min，进样量：2ml，电导检测器检测，50mmol/l的硫酸溶液作为抑制器再生液；

s04、根据步骤s03得到的图谱计算样品中乙醇酸或马尿酸对应的峰面积，然后根据峰面积和标准曲线的回归方程自动计算人尿中乙醇酸或马尿酸的浓度。

进一步地，步骤s04中标准曲线的制作过程如下：分别配制含有50mg/l、10mg/l和2mg/l的马尿酸与乙醇酸混合标准液，然后，将上述浓度的混合标准液用滤膜过滤器过滤后注入到离子色谱仪中，采用步骤s03的色谱条件对其中的马尿酸和乙醇酸进行分析，以峰面积平均值为横坐标，标准系列浓度为纵坐标绘制标准曲线。

相对现有技术，本发明的有益效果在于：经过反复的实验探索发现，采用3.5mmol/lna2co3+3mmol/lnahco3条件，能够同时且较好地将人尿中的乙醇酸和马尿酸分离出来，并且，可将分析的时间缩短在15min之内。总体来说，该方法采用了固相萃取方法对尿液中的马尿酸和乙醇酸待测物进行分离提纯，并采用离子色谱-电导检测法测定了实际尿液中乙醇酸和马尿酸的浓度。该方法可同时检测人尿中乙醇酸和马尿酸的浓度，其检测灵敏、分析快速、重复性好，且操作简单、方法准确可靠，可为实际尿液中马尿酸和乙醇酸的分析检测提供一个良好的方法参考。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明条件摸索人尿的离子色谱图；

图2是本发明的乙醇酸和马尿酸的标准离子色谱图(50mg/l)；

图3是本发明的乙醇酸和马尿酸的标准离子色谱图(10mg/l)；

图4是本发明的乙醇酸和马尿酸的标准离子色谱图(2mg/l)；

图5是本发明的人尿的离子色谱图；

图6是把图5纵坐标的最高值降低后，以凸显出马尿酸和乙醇酸的峰的图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的分析，显然，所描述的仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

为了方便，本发明下述实施例所采用的主要仪器与试剂如下：离子色谱仪(瑞士万通883型，配置抑制器模块)，c18固相萃取小柱(waterssep-pak)，针筒式滤膜过滤器(津腾)。

实施例

一种同时检测人尿中乙醇酸和马尿酸的浓度的方法，包括如下步骤：

s01、样品采集:收集我院肾结石患者及正常对照人群的晨尿，采样时防止污染；

s02、样品的制备：分别取5ml水、10ml甲醇、5ml水对c18固相萃取小柱进行浸润、淋洗和活化；用去离子水将s01所采集的尿液稀释5倍后加入c18固相萃取小柱中，用洗脱得尿液纯化液；

s03、对样品进行离子色谱-电导法分析：将步骤s02所得的尿液纯化液用滤膜过滤器过滤后注入到离子色谱仪中，按照下述色谱条件对所述尿液纯化液中的马尿酸和乙醇酸浓度进行分析，其具体色谱条件如下：

分离柱：metrosepa5150阴离子交换柱，淋洗液：3.5mmol/lna2co3+3.0mmol/lnahco3，流速：0.3ml/min，进样量：2ml，电导检测器检测，50mmol/l的硫酸溶液作为抑制器再生液；

s04、根据步骤s03得到的图谱计算样品中乙醇酸或马尿酸对应的峰面积，然后根据峰面积和标准曲线的回归方程自动计算人尿中乙醇酸或马尿酸的浓度。

其中，步骤s04中标准曲线的制作过程如下：分别配制含有50mg/l、10mg/l和2mg/l的马尿酸与乙醇酸混合标准液，然后，将上述浓度的混合标准液用滤膜过滤器过滤后注入到离子色谱仪中，采用步骤s03的色谱条件对其中的马尿酸和乙醇酸进行分析，以峰面积平均值为横坐标(x，(μs/cm)×min)，标准系列浓度为纵坐标(y，mg/l)绘制标准曲线。

结果例

2.1分离条件的摸索

用配置好的50mg/l马尿酸与乙醇酸混合标准液和人尿样本进行分离条件的摸索。对分离条件进行不断摸索，最终摸索出最佳条件为3.5mmol/lna2co3+3mmol/lnahco3。由图1和图2具体可知：在上述条件下，乙醇酸和马尿酸可被很好地分离，且乙醇酸的出峰时间(即为：可检测到的时间)为：5.43min，马尿酸的出峰时间为：13.84min。

2.2马尿酸和乙醇酸的标准曲线建立

按照2.1摸索出的本发明的色谱条件，分析10mg/l和2mg/l的马尿酸与乙醇酸混合标准液，得到图3和图4的图谱，然后计算图2-4中乙醇酸和马尿酸对应的峰面积，得到的各个浓度及其对应的峰面积的数据，并根据该数据建立的标准曲线见表1。

表1乙醇酸和马尿酸的标准曲线

2.3实际尿液中乙醇酸浓度和马尿酸浓度的检测

按照本发明的色谱条件对采集到的人尿进行检测，其具体检测结果见图5和图6的图谱。通过图谱可知：在实际尿液样本中，马尿酸可独立分开，不受其他物质影响；乙醇酸虽不能成独立峰，但峰值高，受其他物质影响小；且乙酸醇和马尿酸被很好地分开，并可在15分钟内完成检测。进一步，对采集到的人尿进行3次连续检测，记录原始结果，并根据出峰时间，明确该峰对应的物质，然后以峰下面积作为x值，代入2.2所建立的标准曲线中，得到其对应的y值，即对应的乙醇酸或马尿酸的浓度，其检测数据见表2。

表2三次重复检测的数据

由表2可知，三次检测到的乙醇酸浓度在173.356-174.982mg/l之间，马尿酸浓度在66.852-68.204mg/l，其结果的浮动均在5％之内，由此可见，采用离子色谱-电导法不仅可同时且快速地检测出人尿中的乙醇酸和马尿酸的浓度，且检测稳定性强，重复性较好。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。