一种用于检测人体的液体标本中肿瘤细胞的检测试剂盒的制作方法

本发明涉及肿瘤细胞的检验检测领域，具体涉及一种用于检测人体的液体标本中肿瘤细胞的检测试剂盒。

背景技术：

人体的液体标本包括胸水、尿液、腹水、血液等液体形态的标本。在一些病理情况下如感染、恶性肿瘤等，人体的某些体腔会产生过多的体液而发生积液，如胸膜腔、腹腔等。如何快速、有效、准确地判断这些体液标本是否是恶性肿瘤引起的，具有十分重要的临床意义。而明确其是否是恶性肿瘤积液的金标准是在体液标本中找到恶性肿瘤细胞。以胸水为例，胸膜腔正常情况下只有少量润滑液，病理下会产生大量液体造成积液。目前诊断胸水是否是恶性的方法为：收集胸水标本，离心后取细胞沉淀，固定包埋成石蜡块保存，切片染色在显微镜下找恶性肿瘤细胞。此方法步骤过多，耗时长(3-7天)，对数量极少的肿瘤细胞容易漏诊。另外，检查尿液脱落细胞中是否包含肿瘤细胞的过程与对胸水标本的检查类似。

专利申请cn201610878477公开一种循环肿瘤细胞快速检测试剂盒及其制备和应用方法。该试剂盒联合免疫捕获和膜过滤的方法分离循环肿瘤细胞。所述试剂盒包括循环肿瘤细胞吸附剂、肿瘤细胞荧光纳米探针、白细胞荧光纳米探针；所述循环肿瘤细胞吸附剂中肿瘤细胞表面特异性抗体选自：epcam或egfr；所述白细胞荧光纳米探针中白细胞特异性抗体选自：cd45、cd15或cd33；所述肿瘤细胞荧光纳米探针中肿瘤细胞特异性抗体选自：ck8/ck18/ck19、panck、vimentin或plastin-3；该试剂盒具有操作便捷、检测时间短、快速准确、无需大型仪器、可降低癌症筛查成本、易被患者接受等特点，可产生良好的经济和社会效益。但该循环肿瘤细胞一般来自于血液，而事实上因血液中各种干扰因素的影响，直接对过滤膜上截留的肿瘤细胞进行检验是有相当大的难度的。而且该专利申请中也没有公开任何肿瘤细胞已经过滤和检测成功的镜检照片。也就是说，虽然现有技术中已经公开使用过滤膜过滤血液中癌细胞然后镜检的方法，但因为其中具体操作方法和细节的限制，而使得这样的试剂盒很难得到商用。

因此，本领域需要提供一种新的用于检测人体的液体标本中肿瘤细胞的检测试剂盒。

技术实现要素：

我们开发了一种基于膜过滤技术快速富集肿瘤细胞的方法用于快速分离富集诊断液体标本中的肿瘤细胞。其原理为通过膜过滤技术直接分离液体标本中的细胞，其中红细胞和白细胞被去除，上皮细胞、间皮细胞和肿瘤细胞等体积较大的细胞被牢固的吸附固定在过滤膜上。整个过滤过程一步完成，无需前期处理步骤，过滤完成后过滤膜可以进行各种下游染色(如he染色即苏木精—伊红染色，巴氏染色，免疫组化染色)。

因此，本发明首先提供一种用于检测人体的尿液标本中肿瘤细胞的检测试剂盒，所述试剂盒包括过滤膜、细胞固定物和常规染色用的染料，所述过滤膜的滤孔为穿透膜厚度方向的直孔道，且滤孔的孔径为5～20微米，过滤膜的厚度为30微米以下，所述细胞固定物中包含甲醛和/或多聚甲醛，所述染料中包含苏木素。

本发明还提供一种用于检测人体的胸水标本中肿瘤细胞的检测试剂盒，所述试剂盒包括过滤膜、细胞固定物和免疫组化用的高碘酸，所述过滤膜的滤孔为穿透膜厚度方向的直孔道，且滤孔的孔径为5～20微米，过滤膜的厚度为30微米以下，所述细胞固定物中包含甲醛和/或多聚甲醛。

本发明还提供一种用于检测人体的液体标本中肿瘤细胞的检测试剂盒，所述试剂盒包括过滤膜、细胞固定物、常规染色用的染料和免疫组化用的高碘酸，所述过滤膜的滤孔为穿透膜厚度方向的直孔道，且滤孔的孔径为5～20微米，过滤膜的厚度为30微米以下，所述细胞固定物中包含甲醛和/或多聚甲醛，所述染料中包含苏木素。

本发明中，所述过滤膜的直孔道是指膜上的通孔为垂直膜面的垂直孔道或倾斜孔道，该滤孔不是弯曲孔道或无规孔道。

在一种具体的实施方式中，所述试剂盒中包含高碘酸溶液，且高碘酸溶液的浓度为0.01～2wt％，优选0.05～1wt％，更优选0.1～0.5wt％。

本本发明中，所使用的高碘酸溶液的浓度和加入高碘酸溶液后的室温反应时间关联。在高碘酸溶液浓度为0.2％时反应2分钟最佳。使用本发明所述试剂盒时，高碘酸溶液的浓度太高则可能会影响抗原，导致阳性反应较弱。例如高碘酸溶液浓度为0.5％时反应1分钟，可能可以得到较为满意的检测结果，但也可能会阳性反应稍弱。而若高碘酸溶液浓度为1％或2％时，则检测的阳性反应会更弱。另外，高碘酸溶液浓度较低则需要相应延长反应时间，例如高碘酸溶液浓度为0.1％时，相应需要把反应时间延长至5分钟左右。

在一种具体的实施方式中，所述试剂盒中还包含与待测肿瘤细胞匹配的一抗。

在一种具体的实施方式中，所述试剂盒中还包含曲拉通x100、二抗以及浓缩的dab染色剂中的一种或多种。

在一种具体的实施方式中，所述试剂盒中还包括过滤器，所述过滤器包括过滤柱和用于控制液体流动的阀门。

在一种具体的实施方式中，所述过滤膜为径迹蚀刻膜，且所述径迹蚀刻膜的厚度为25微米以下，优选20微米以下，更优选15微米以下。

发明中，过滤膜的厚度过厚则容易堵塞孔道。在现有技术中包含规整直孔道且厚度够薄的过滤膜中，径迹蚀刻膜是最合适的，而光刻膜的厚度很难达到这个要求。

在一种具体的实施方式中，所述过滤膜为孔径均匀且孔径在7～9微米的径迹蚀刻膜。

在一种具体的实施方式中，所述试剂盒还包括用于封片的浓度为20～60wt％的甘油。

在一种具体的实施方式中，所述细胞固定物为细胞固定液，且所述细胞固定液为浓度为2.5～20wt％的多聚甲醛溶液或浓度为4～50wt％的甲醛溶液。

本发明还提供一种如上所述试剂盒的应用，包括先使用过滤膜过滤体液，再在体液液面降低至仍然保持在过滤膜的膜面上方时加入生理盐水继续过滤，加入生理盐水继续过滤的次数为一次或多次，然后在体液与生理盐水的混合液液面降低至仍然保持在过滤膜的膜面上方时加入呈液态的细胞固定物，将过滤膜上的细胞固定，细胞固定物固定细胞的时间为1分钟以上，优选3～60分钟，更优选5～20分钟，然后将细胞已经固定好的过滤膜从过滤器中取出，再对过滤膜使用免疫组化处理后送镜检；且将另一张已经过滤和细胞已经固定好的过滤膜从过滤器中取出，再对过滤膜使用所述常规染色用的染料染色后送镜检；或者将进行免疫组化处理相同的一张过滤膜裁剪成多份后，对另一份过滤膜使用所述常规染色用的染料染色后送镜检；且所述免疫组化处理包括先在过滤膜上加高碘酸溶液，再先后在过滤膜上孵育一抗和二抗，再对其使用dab染料染色，最后使用甘油封片以便送镜检；优选在固定反应完成后，继续过滤以便将包含细胞固定液、体液和生理盐水的混合液全部流动至过滤膜下方，再从过滤器中取出膜上细胞已经固定好的过滤膜；另外，优选加入高碘酸溶液的反应时间为0.5～10分钟，更优选1～5分钟。

优选所述人体的液体即体液包括胸水、尿液、腹水、血液中的一种或多种。

本发明至少具备如下有益效果：

1、耗时短，检测速度快，可以用于快速病理检测。

2、步骤简单，液体样品不需要繁琐的前期预处理。

3、可以直接分离掉绝大部分红细胞和白细胞，视野干净，更有利于在显微镜下观察，排除干扰。该分离过程尤其对常规染色法来说非常重要。

4、样品处理量大，提高检出率，减少假阴性。

5、所有待检测细胞，均匀地分布于一个平面膜上，不需要传统的从石蜡块中切片后显微镜下观察。对于阳性细胞很少的标本可以大大提高检测效率和灵敏度。

6、本发明的试剂盒中包含细胞固定物，且细胞固定物中包含甲醛和/或多聚甲醛，且在使用所述试剂盒中的细胞固定物时，具体以浓度为2.5～20wt％的多聚甲醛溶液或浓度为4～50wt％的甲醛溶液为细胞固定液，结合特定的细胞固定方法，即过滤膜上的肿瘤细胞在未被完全固定之前保持不直接与空气接触，即固定前的细胞保持处在液体环境中。这使得本发明所述试剂盒和相应的操作方法能成功固定过滤膜上的肿瘤细胞，用于镜检。

7、本发明用于检测胸水标本或用于检测其他体液标本的试剂盒中包含免疫组化用的高碘酸。本发明在使用高碘酸后，后续结合使用一抗、二抗和dab染色剂，使得本发明所述胸水标本或体液标本中的肿瘤细胞的种类能被明确鉴定。高碘酸的使用对本发明试剂盒极为重要，不使用高碘酸处理会造成严重的非特异性染色，出现假阳性结果。本发明提供的试剂盒为肿瘤细胞的鉴定提供了一种非常方便快捷的方式。

8、对于本发明所述试剂盒的应用来说，为了保持肿瘤细胞在固定之前处于液体中，发明人之前使用显微镜对过滤膜上的肿瘤细胞进行在线监测，但这毕竟大幅增加了装置设备的复杂程度和操作难度。而本发明中却保持肿瘤细胞处在液体环境时，即在过滤尚未完结之前就将固定液倒入过滤器中，待肿瘤细胞在过滤膜上的液体环境中完全固定后，再将剩余的液体滤掉和将过滤膜取出，使得本发明能高效和精准地检测到标本中的肿瘤细胞。

附图说明

图1为实施例1所示的疑似肺癌患者胸水采用常规染色法进行膜过滤检测恶性肿瘤细胞的检测结果图。

图2为实施例1所示的疑似肺癌患者胸水采用免疫组化方法染色进行膜过滤检测恶性肿瘤细胞的检测结果图，其中的一抗使用的是ttf-1蛋白。

图3为实施例1所示的疑似肺癌患者胸水采用免疫组化方法染色进行膜过滤检测恶性肿瘤细胞的检测结果图，其中的一抗使用的是p40蛋白。

图4为实施例2所示的疑似膀胱癌患者尿液采用常规染色法染色进行膜过滤检测恶性肿瘤细胞的检测结果图，其中的染色剂为苏木素。

图5为对比例1所示的疑似肺癌患者胸水采用免疫组化方法染色进行膜过滤检测恶性肿瘤细胞的检测结果图，其中的一抗使用的是ttf-1蛋白。

图6为对比例2所示的疑似肺癌患者胸水采用免疫组化方法染色进行膜过滤检测恶性肿瘤细胞的检测结果图，其中的一抗使用的是ttf-1蛋白。

图7为对比例3所示的疑似肺癌患者胸水采用免疫组化方法染色进行膜过滤检测恶性肿瘤细胞的检测结果图，其中的一抗使用的是ttf-1蛋白。

图8为实施例1中厚度为12微米的径迹蚀刻膜截留肿瘤细胞的原理示意图。

图9为对比例4中厚度为32微米的径迹蚀刻膜无法截留肿瘤细胞的原理示意图。

具体实施方式

以下结合附图进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不以实施例为准。

实施例1

本实施例为胸水中癌细胞的检测。对于绝大部分患者的胸水标本来说，可以不做常规染色，而只做免疫组化就可以确诊其中的癌细胞(如果过滤膜上有癌细胞的话)到底为鳞癌、腺癌还是小细胞癌。对于极少数患者的胸水标本来说，如果只做免疫组化(例如ttf-1阴性且p40阴性)而不做常规染色，可能存在漏检，因为其常规染色可能呈阳性。但因这毕竟是极其少见的情况，因而本发明的试剂盒中可以不包含常规染色的染料。

但对于胸水标本来说，如果只做常规染色，而不做免疫组化染色，则即使知道患者胸水中有癌细胞，但因本发明中使用的是体液中的细胞，而不是活检的肿瘤组织，因而无法直接通过组织学形态、细胞排列的规律特点判断癌的种类，需要做免疫组化检测才能鉴别它是鳞癌、腺癌还是小细胞癌。也就是说，即使对胸水标本做了常规染色检验发现有肿瘤细胞后，依然不知道该肿瘤细胞的种类及分型(鳞癌、腺癌、小细胞癌、大细胞肺癌、恶性间皮瘤等、或其它癌转移到肺中形成的胸水)，而明确肿瘤细胞的来源及分型对后续治疗意义重大。因此，对于胸水标本来说，做免疫组化检测是必须的，常规染色则能对免疫组化染色起到相互补充验证的效果，另外还能弥补少数患者的漏检(免疫组化皆呈阴性，但常规染色为阳性)情况，因而这样会得到更加真实可靠的结果。此外，对于现有技术中常规的病理学检测，采用石蜡包埋法检测患者的肿瘤组织，在很多情况下病理学家可以根据癌组织的常规染色所显示的组织形态就能判断出是鳞癌、腺癌还是其他类型癌症；对于不典型的或无法判断的，再通过免疫组织化学染色进一步确诊。

因此，对于胸水标本来说，可以先使用常规染色快速初步地判断是否存在明显的异型恶性细胞，再通过免疫组织化学进一步确诊恶性细胞的类型和来源，如到底为鳞癌还是腺癌。

本实施例以疑似肺癌患者胸水中癌细胞的检测为例，其具体步骤如下：

1.组装膜过滤装置，过滤器中设置一张径迹蚀刻膜(膜厚度为12微米±1微米，孔径为8微米±1微米)作为过滤膜，过滤器上面连接针筒用于存储过滤样品，下端连三通阀用于开关过滤装置，排气后关闭三通阀，加入3ml生理盐水湿润管壁。

2.将胸水标本加入针筒中，打开三通阀，使胸水缓慢过滤。过滤时要确保不能让液体完全流尽，液面不能低于过滤膜，以免截留在过滤膜上的肿瘤细胞破裂。

3.过滤中加入生理盐水清洗管壁，直至滤液澄清。在此过程中仍然需要确保不能让液体完全流尽，液面不能低于过滤膜，以免截留在过滤膜上的肿瘤细胞破裂。例如胸水液面保持在过滤膜的膜面上方10mm以上时，不需要加入生理盐水。而当胸水液面或胸水与生理盐水的混合液的液面降低至过滤膜的膜面上方10mm以下时，需要加入生理盐水。每个胸水标本大概使用生理盐水清洗3～4次，使得胸水标本得到完全的过滤。

4.即将过滤完成时加入固定液4％多聚甲醛过滤固定，共加入约10ml多聚甲醛，使得截留在过滤膜上的肿瘤细胞充分固定。在固定步骤完成之前，依然应避免过滤装置中进入空气，即不能让过滤器的膜面上方的液体完全流尽，液面不能低于过滤膜。

5.室温充分固定10min后取出过滤膜。此时过滤膜上的肿瘤细胞已经固定完成，固定完成后过滤器中的液体可以流尽，此时对肿瘤细胞不会有影响，肿瘤细胞不会再破碎。将取出的过滤膜置于六孔板中，于摇床上使用pbst(磷酸盐吐温缓冲液)洗5min×3次。

在固定并冲洗过滤膜后，后续步骤为染色步骤。对于胸水标本来说，一般做三张过滤膜，其中一张使用常规染色法染色，如巴氏染色或苏木素染色。其它两张过滤膜做免疫组化染色进一步确定。

以下是常规染色法中的巴氏染色步骤。

6a.对一张已经规定和清洗的过滤膜加巴氏染色试剂盒核染剂5分钟，然后加入温自来水中返蓝五分钟。

7a.加入浆染剂染色5分钟，滤纸沿膜边吸干。

8a.加入增色剂中增色20秒，且不要洗的条件下直接使用40％甘油封片观察。

本领域技术人员可知的，浆染剂、核染剂和增色剂，这些都是商购的巴氏染色试剂盒中的成分。

以下是常规染色法中的苏木素染色步骤。

6b.对一张已经固定和清洗的过滤膜加入苏木素染色液染色5分钟，然后加入温自来水中返蓝五分钟。使用40％甘油封片观察。

图1为对实施例1所示的疑似肺癌患者胸水采用常规染色法进行膜过滤检测恶性肿瘤细胞。图1中标记的两个方框处为正常细胞，标记的两个圆圈处为恶性细胞。也就是说，从常规染色法可见该患者的胸水中含有肿瘤细胞。该检测耗时小于30分钟。但若需要进一步确定该恶性肿瘤细胞属于鳞癌、腺癌还是其他类癌症，则需要做免疫组化染色实验来检测。

以下是免疫组化染色步骤。

6.吸去pbst，加入1ml缓冲溶液1(0.25％tritonx100)，置于室温反应15min。

7.吸去缓冲溶液1，于摇床上pbst洗5min×3次。

8.吸去pbst，加入1ml缓冲溶液2(0.2％高碘酸)，置于室温反应2min。

9.吸去缓冲溶液2，于摇床上pbst洗5min×3次。

10.取出过滤膜，正面朝上置于湿盒中，加入已配好的一抗溶液使充分覆盖过滤膜(一抗用pbst稀释，一抗ttf-1稀释浓度为1：400，一抗p40稀释浓度为1：200)。4℃孵育过夜或室温30分钟。所述一抗例如为ttf-1或p40。

11.回收一抗，取出过滤膜，置于六孔板中，于摇床上pbst洗5min×3次。

12.取出过滤膜，正面朝上置于湿盒中，加入反应增强液200ul，使充分覆盖过滤膜，室温处理20min。所述反应增强液例如使用商购的免疫组化试剂盒中的反应增强液。

13.回收反应增强液，取出过滤膜，置于六孔板中，于摇床上pbst洗5min×3次。

14.取出过滤膜，正面朝上置于湿盒中，加入hrp标记的二抗200ul，使充分覆盖过滤膜，室温处理25min。

其中，一抗是指第一抗体，二抗是指第二抗体。第一抗体就是能和特异性抗原特异性结合的免疫球蛋白。种类包括单克隆抗体和多克隆抗体。第二抗体是能和抗体结合，即抗体的抗体，同时二抗被标记了辣根过氧化物酶(hrp)，其主要作用是检测抗体的存在，放大一抗的信号，并引入显色系统。15.回收二抗，取出过滤膜，置于六孔板中，于摇床上pbst洗5min×3次。

16.取出过滤膜，正面朝上置于湿盒中，加入新鲜配制的dab(新鲜配制即指将浓缩的dab染料稀释至合适浓度)显色上清，使充分覆盖过滤膜，室温处理5min。

17.取出过滤膜，置于六孔板中，于摇床上pbst洗5min×2次。

18.取出过滤膜，以40％甘油封片观察。

图2为对实施例1所示的疑似肺癌患者胸水采用免疫组化方法染色进行膜过滤检测恶性肿瘤细胞，其中的一抗使用的是ttf-1蛋白。图2中，过滤后过滤膜使用免疫组化检测ttf-1蛋白。从图2可见，肿瘤细胞细胞核被染成棕色，明确过滤膜上的肿瘤细胞为肺腺癌。该免疫组化法检测耗时4-6小时。

本领域技术人员可知的，ttf-1是肺腺癌的标识物，p63和p40都是鳞癌的标识物，与p63相比，p40的特异性和准确性都更高，因而相对来说会更好。因此，发明人还对实施例1所示的疑似肺癌患者胸水采用免疫组化方法染色进行膜过滤检测恶性肿瘤细胞，其中的一抗使用的是p40蛋白，检测结果图见图3。从图3可见，该患者免疫组化p40蛋白呈阴性。这说明该疑似肺癌患者胸水中的肿瘤细胞为肺腺癌，而不是鳞癌。

本领域技术人员可知的，常规购买的免疫组化试剂盒中含有二抗，以及用于使得检测观察效果更好的“反应增强液”。本发明中使用商购的免疫组化试剂盒中的混合二抗以及反应增强液。此外，因为一抗种类太多，因而常规购买的免疫组化试剂盒中一般都不包含一抗。此外，可以商购一种dab显色试剂盒，其主要成分是浓缩的dab染色剂。

此外，本发明中待过滤检测的胸水标本可以做前处理，也可以不做前处理。例如胸水中血凝块太多时则一般需要做前处理。过滤的液体标本在过滤器的过滤柱中的初始高度可以任意选择，例如可以是1～5cm高或10～20cm高，等等。当然，标本量太大时，过滤时间相应长，且需要使用的冲洗用生理盐水的冲洗次数也更多。而当标本量太小时，可能难以保持液体没过过滤膜的膜面，另外也可能因标本量太少而未过滤截留到肿瘤细胞。在本发明的过滤操作中，一般全程使用生理盐水冲洗3～5次，首先当标本高度从20cm降低到10mm时不需加生理盐水冲洗，在标本高度降低到一定高度例如10mm时，关闭过滤器上的三通阀，加入生理盐水，进行第一次冲洗过滤。保持过滤膜处在液体(待检标本与生理盐水的混合液)中，向液体中加入固定剂。此前一定不要把过滤膜捞出，以免膜上的肿瘤细胞受到压力而破裂。

实施例2

本实施例为尿液中癌细胞的检测。检测患者尿液中是否有癌细胞，用于判断患者是否患有尿路上皮癌，包括上尿路的肾盂、输尿管癌，以及下尿路的膀胱癌。一般很难有其它恶性肿瘤能转移到尿液中。所以对尿液的过滤膜检测来说，一般使用常规染色法检测出尿液中是否有癌细胞即可，而无需做免疫组化染色确定相应的肿瘤细胞来源或分型。

如果尿液中检测到恶性肿瘤细胞，则一定是癌。如果尿液中没有检测到恶性肿瘤细胞，则不一定患者没有癌。因为，人体每天都是不断的产生尿液并排泄掉，也有一部分尿路上皮癌患者其肿瘤细胞并不脱落至尿液中，因此，在对尿液检测中无肿瘤细胞只是代表该次尿液标本无肿瘤细胞。和膀胱镜活检相比，活检是取患者的膀胱肿块送检，是判断良恶性的金标准，但是该检测方法是痛苦的和有创的。另外，对于上尿路的肾盂、输尿管癌目前没有很好的手术前活检手段进行检测。因此，本发明提供了一种十分快捷、方便、无创的尿路上皮癌检测方法，非常适用于肾盂、输尿管癌、膀胱癌的大规模筛查以及辅助诊断。使用本发明所述试剂盒检测到恶性细胞基本可以确诊患者患有尿路上皮恶性肿瘤；如果使用本发明所述试剂盒并未检测到尿液中含肿瘤细胞，则还需要参考其它检测结果判断。

以疑似膀胱癌患者尿液中癌细胞的检测为例，其具体步骤如下：

1.组装膜过滤装置，过滤器中设置一张径迹蚀刻膜作为过滤膜，过滤器上面连接针筒用于存储过滤样品，下端连三通阀用于开关过滤装置，排气后关闭三通阀，加入3ml生理盐水湿润管壁。

2.将尿液标本加入针筒中，打开三通阀，使尿液缓慢过滤。过滤时要确保不能让液体完全流尽，液面不能低于过滤膜，以免截留在过滤膜上的肿瘤细胞破裂。

3.过滤中加入生理盐水清洗管壁，直至滤液澄清。在此过程中仍然需要确保不能让液体完全流尽，液面不能低于过滤膜，以免截留在过滤膜上的肿瘤细胞破裂。例如尿液液面保持在过滤膜的膜面上方10mm以上时，不需要加入生理盐水。而当尿液液面或尿液与生理盐水的混合液的液面降低至过滤膜的膜面上方10mm以下时，需要加入生理盐水。每个尿液标本大概使用生理盐水清洗3～4次，使得尿液标本得到完全的过滤。

4.即将过滤完成时加入固定液4％多聚甲醛过滤固定，共加入约10ml多聚甲醛，使得截留在过滤膜上的肿瘤细胞充分固定。在固定步骤完成之前，依然应避免过滤装置中进入空气，即不能让过滤器的膜面上方的液体完全流尽，液面不能低于过滤膜。

5.室温充分固定5min后取出过滤膜，此时过滤膜上的肿瘤细胞已经固定完成，固定完成后过滤器中的液体可以流尽，此时对肿瘤细胞不会有影响，肿瘤细胞不会再破碎。将取出的过滤膜置于六孔板中，于摇床上pbst(磷酸盐吐温缓冲液)洗5min×3次。

在固定并冲洗过滤膜后，后续步骤为染色步骤。对于尿液标本来说，一般使用常规染色法做一张过滤膜即可，如苏木素染色或巴氏染色。以下是巴氏染色步骤。

6.加巴氏染色试剂盒核染剂5分钟，然后加入温自来水中返蓝五分钟。

7.加入浆染剂染色5分钟，滤纸沿膜边吸干。

8.加入增色剂中增色20秒，且不要洗的条件下直接使用40％甘油封片观察。

图4为对实施例2所示的疑似膀胱癌患者尿液采用常规染色法染色进行膜过滤检测恶性肿瘤细胞的检测结果图，其中的染色剂为苏木素。从图4的尿液标本检测结果可见，过滤膜上部分细胞的细胞核大，具体如见两个圆圈标记处，异型性明显，可以判断为恶性肿瘤细胞。根据这个检测结果就基本可以判断患者为肾癌或膀胱癌，而不太可能是其他转移癌。当然，也可以对该尿液标本进一步做膜过滤和免疫组化染色实验来确诊。

实施例3

人体的液体标本一般包括胸水、尿液、腹水和血液等。通过本发明所述试剂盒的检测检验发现，该试剂盒对前三种液体标本的检测效果更好，而对血液标本的检测效果较差，主要是因为血液中干扰过滤检测的成分和因素太多。对于不同的体液标本来说，有的仅需做常规染色检测，有的仅需做免疫组化检测，而有的标本却既需要做常规染色检测，也需要做免疫组化检测。因此，当本发明的试剂盒通用于所有的体液标本时，其既包括常规染色的试剂，也包含免疫组化检测的试剂。本发明所述检测试剂盒中一般包括多人份的试剂和材料。例如，试剂盒中每人份一般都需要三张过滤膜，一张过滤膜用于做常规染色检测，另外两张过滤膜用于做免疫组化检测。

因pbst和生理盐水均为实验室的常见试剂，因而本发明所述试剂盒中并不包括这两种组分，这两种组分若加入试剂盒中反而会使得试剂盒的运输和保存等工作都变得不方便。

对比例1

本实施例为胸水中癌细胞的检测。对比例1中的检测方法与实施例1相似，但缺少实施例1中的步骤1～3，而实施实施例1中步骤4～5和6～18，即胸水不经过过滤膜的过滤处理，而直接使用多聚甲醛固定，之后免疫组化染色，免疫组化染色中的一抗使用的是ttf-1抗体。图5为对比例1所示的疑似肺癌患者胸水采用免疫组化方法染色进行膜过滤检测恶性肿瘤细胞的检测结果图。从图5和图2的对比可见，图5中存在大量非特异性染色。显然对比例1所示方法不能用于准确判断胸水中肿瘤细胞的情况。

对比例2

本实施例为胸水中癌细胞的检测。对比例2中的检测方法与实施例1相似，但缺少实施例1中的步骤4，或者虽然实施步骤4却在步骤4中是在过滤膜上的液体滤完之后再加多聚甲醛固定，而实施实施例1中步骤1～3、5和6～18，即胸水不经过多聚甲醛在液体环境中固定细胞的处理，之后免疫组化染色，免疫组化染色中的一抗使用的是ttf-1抗体。图6为对比例2所示的疑似肺癌患者胸水采用免疫组化方法染色进行膜过滤检测恶性肿瘤细胞的检测结果图。从图6和图2的对比可见，图6中膜上的细胞破裂，阳性细胞染色明显减弱，视野中只能看到径迹蚀刻膜本身的一个个圆孔。显然对比例2所示方法也不能用于准确判断胸水中肿瘤细胞的情况。

对比例3

本实施例为胸水中癌细胞的检测。对比例3中的检测方法与实施例1相似，但缺少实施例1中的步骤8，而实施实施例1中步骤1～5、6～7和9～18，即胸水在免疫组化染色过程中没有使用高碘酸，免疫组化染色中的一抗使用的是ttf-1抗体。图7为对比例3所示的疑似肺癌患者胸水采用免疫组化方法染色进行膜过滤检测恶性肿瘤细胞的检测结果图。从图7和图2的对比可见，图7中假阳性染色明显，正常白细胞也被染上颜色。显然对比例3所示方法也不能用于准确判断胸水中肿瘤细胞的情况。

对比例4

本实施例为胸水中癌细胞的检测。对比例4中的检测方法与实施例1相似，但将实施例1中的径迹蚀刻膜的厚度由12微米±1微米更改为32微米±1微米。实验结果显示，在该厚度的过滤膜上截留到肿瘤细胞的概率大幅度降低。

而若将实施例1中的径迹蚀刻膜的厚度由12微米±1微米更改为25微米±1微米。实验结果显示，在该厚度的过滤膜上可以截留肿瘤细胞，但截留到的肿瘤细胞的数量变少或者截留到肿瘤细胞的概率变低。进一步的实验发现，径迹蚀刻膜的厚度越大，则过滤膜能截留到肿瘤细胞的概率越低。该实验中，具体使用申请人在先的专利申请cn201811172818.6中公开的一种可以在显微镜下使用的过滤装置来观察。具体地，当膜厚度即过滤孔的长度小于过滤目的细胞(肿瘤细胞)的直径时，细胞会变形成双凸哑铃样结构牢牢的固定卡死在过滤膜的过滤孔里(图8)，要形成这种结构，膜孔的大小和膜孔的长度均需要小于等于过滤的目的细胞。一旦形成双凸哑铃样结构，细胞会十分牢固的被固定在膜孔中，即使施加各种外力也很难洗脱，如反向冲洗，反向离心(离心力高达4000g)，脱水后冲洗等。而当膜的厚度增加至明显超过目的细胞时，细胞会变形直接通过过滤孔(图9)，而不会形成双凸哑铃样结构被固定在过滤膜上。

从上述实施例1和对比例1～4的比对可知，若想得到能准确判断鉴别体液中是否存在肿瘤细胞的检测试剂盒，本发明中包含对体液过滤的过滤膜、用于细胞固定的细胞固定物、用于免疫组化染色用的高碘酸以及特定厚度的过滤膜，这几个条件缺一不可。甚至本发明中还必须采用在液体中固定细胞的特殊细胞固定方法。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演和替换，都应当视为属于本发明的保护范围。