一种发光细菌检测土壤重金属综合含量的方法及其应用与流程

本发明属于生物法进行环境检测的领域，具体涉及一种发光细菌检测土壤重金属综合含量的方法及其应用。

背景技术：

土壤是大自然中非常重要的组成部分，对维持生态平衡、能量循环等有着不可或缺的作用。城市土壤是影响城市环境的重要因素，同时也严重影响着人类的健康。生活污水和工业废水是造成城市土壤污染的主要来源；其中，铜、镍、锌、铅、镉等重金属离子都会对土壤中生态环境造成破坏，导致生态失衡，危及人类社会和人类健康。例如重金属离子镍会导致肺癌，鼻癌，喉癌和前列腺癌；有研究表明，镉会导致肾脏、肺部疾病，还会导致骨质脆弱；铅是致癌物质，接触过量会导致死亡；即便非大量的铅则也会干扰神经的发育，特别是在儿童中，可能导致永久性学习障碍和行为障碍。有非致癌风险hq的统计调查表明，儿童对重金属致癌更为敏感，原因是儿童更容易接触或者口服摄入重金属；同时，大剂量的铜和锌会导致肠胃出现不适，高剂量的铜还会引起肝脏损坏。随着城市的高速发展，越来越多的工厂建立在市区周边甚至居民区附近，废水中含有的有害金属离子种类也越来越复杂，尽管国家对工业废水排放有着明确的规定，但是仍有不少工厂会将未经处理或者处理不彻底的工业废水排放出去，进而污染城市用水及城市土壤。

生物毒性测试是指系统地利用生物反应测定污染物或环境因素存在时，生物体受到的影响或危害。发光细菌是一类在正常的生理条件下能够发射可见荧光的细菌，这种可见荧光波长在450-490nm之间。常见菌属有异短杆菌属、发光杆菌属、希瓦氏菌属及弧菌属等。其特点是在受到重金属离子的抑制后发光强度会减弱，变化程度与受试物的浓度在一定范围内呈相关关系，因此可根据发光细菌的发光强度大小来判断金属离子浓度的高低以及毒性大小。同时，发光细菌拥有检测成本低、速度快、操作方便的优势，这使发光细菌检测法拥有了更广阔的应用前景。

目前，尚未存在一种将发光细菌从水污染检测推广到了土壤污染检测中，检测工业废水排放是否达标造成土壤重金属污染的方法，也尚未存在一种有效、快速进行重金属综合毒性检测并定量描述土壤中重金属离子的综合含量的方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种发光细菌检测土壤重金属综合含量的方法及其应用，解决了上述背景技术中的问题。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供了一种发光细菌检测土壤重金属综合含量的方法，包括如下步骤：

1)样品预处理：将采集到的土样剔除杂物并进行风干、研磨、过筛，随后加水配成土壤悬浊液，经震荡、静置、过滤、离心后得到无色透明的上清液即为待测样品；

2)费氏弧菌与样品作用：将新复苏的费氏弧菌用氯化钠溶液稀释得到菌稀释液，将菌稀释液与待测样品混合，反应15min；

3)发光强度检测：采用超微弱光检测器对混合后的待测样品进行检测费氏弧菌的发光强度，即得到样品的发光强度；

4)数据处理：构建费氏弧菌的发光强度与土壤重金属离子的浓度的关系模型，将计算步骤3)的相关发光强度，进行比对，得到待测样品中土壤重金属离子的浓度范围。

在本发明一较佳实施例中，步骤1)中，将采集到的土样剔除杂物，在30-35℃的条件下风干3-7天，研磨后100目细筛，将过筛后的土壤和水以1：5的体积比配成土壤悬浊液，摇床震荡8h，静置16h后取得上清液，用20微米超滤膜进行过滤，将滤液以转速5000-9000rpm，时间为3-5min进行离心，得到无色透明的上清液。

在本发明一较佳实施例中，步骤2)中，将冻干费氏弧菌复苏，将新复苏的费氏弧菌以1:4的体积比用2％的氯化钠溶液进行稀释，得到菌稀释液；将菌稀释液以1:90的体积比与待测样品混合。

在本发明一较佳实施例中，步骤3)中，采用aol-1型全光谱超微弱光检测器通过循环伏安法进行费氏弧菌的发光强度检测，初始电位0.2，高电位1.25，低电位0.2，扫描方向为正，灵敏度为1·e^-0.005。

在本发明一较佳实施例中，步骤3)中，检测空白组的发光强度，所述空白组由将菌稀释液以1:90的体积比与2％的氯化钠溶液混合，反应15min得到。

在本发明一较佳实施例中，步骤4)中，所述关系模型为费氏弧菌的相对发光强度与土壤毒性的关系，所述相对发光强度为样品的发光强度与空白组的发光强度的百分比值，所述土壤毒性与重金属离子浓度线性相关。

在本发明一较佳实施例中，步骤4)中，以金属离子的种类、离子浓度为输入变量，不同种类金属离子以不同浓度混合的情况下费氏弧菌相对发光强度为响应变量，采用响应面分析法构建费氏弧菌的相对发光强度与土壤毒性的关系模型。

在本发明一较佳实施例中，所述的土壤毒性可划分为三个毒性区间，毒性区间以定义的毒性系数来划分。将pb²⁺:cu²⁺:ni²⁺的浓度比例为0.2:0.35:0.45mg/l时定义为毒性系数为1。故pb²⁺:cu²⁺:ni²⁺浓度比例同步放大10倍毒性系数就是10，同步放大0.3倍毒性系数就是0.3，同步放大0.5倍毒性系数就是0.5，以此类推。其中，毒性系数在0-10为ⅰ级毒性区间，该区间所对应的重金属离子含量为10^-2mg/l；毒性系数在10-15为ⅱ级毒性区间，所对应的重金属离子含量为10^-1mg/l；毒性系数在15-25为ⅲ级毒性区间，所对应的重金属离子含量为2×10¹mg/l。

本技术方案与背景技术相比，它具有如下优点：

1.本方案构建了重金属含量与发光细菌相对发光强度的对应模型，实现了通过检测发光细菌的发光强度来判断土壤重金属污染程度的检测方法，操作简单，设备单一，成本低廉且适用性广，在土壤污染检测方面具有重要意义；

2.本方案采用费氏弧菌，其生命力强、繁殖速度快、价格便宜，曾在检测污水中的毒性物质并作为一种单一重金属离子毒性的表征试剂中有稳定表现，其实验可重复程度高，可靠性强；

3.本方案的方法应用土壤检测试剂盒，达到便捷、快速的检测土壤重金属污染的目的，在试剂应用和商业推广上有很大的应用前景。

附图说明

图1为费氏弧菌相对发光强度与毒性系数关系图。

图2为a：响应面模拟出的相对发光强度由强到弱排序；b各离子浓度均缩小2倍；c各离子浓度均缩小1倍；d各离子浓度均放大10倍。

具体实施方式

实施例1

本实施例的一种光细菌检测土壤重金属综合含量的方法，包括如下步骤：

1)样品预处理：

采集某塑料厂附近的土壤，剔除杂物，所述杂物包括砂砾、石块、木棒、杂草、植物残根、昆虫尸体和石块和新生体如锰结核、石灰结核等；

将剔除杂物后的土壤平铺在垫衬有干净白纸的晾晒板或木板上自然风干，严禁暴晒。当土壤达到半干状态时，将大块土打碎，以免结成硬块，并在风干过程中，随时拣掉石砾、动植物残体。风干室保证干燥通风，风干温度30-35℃，风干时间为3-7天；

将风干土用研磨棒磨碎，首先需过孔径为2mm尼龙筛，用研钵反复研磨，过筛3-4遍，直至仅有少量沙粒停止，然后再过100目细筛；

将过筛后的土壤以土壤：水＝1：5的体积比配成土壤悬浊液，摇床震荡8h，静置16h后取得上清液，用20微米超滤膜进行过滤，将滤液以转速7000rpm，时间为3min进行离心，得到无色透明的溶液作为待测样品；

2)费氏弧菌与样品作用：将购自浙江托科司生物科技有限责任公司的费氏弧菌冻干粉进行复苏，将新复苏的费氏弧菌以1:4的比例用2％的氯化钠溶液进行稀释，得到菌稀释液；将菌稀释液以1:90的比例与预处理后的样品混合，反应时间为15min；

3)发光强度检测：

①设置空白组，将菌稀释液与2％氯化钠溶液以1:90的比例混合15min，采用aol-1型全光谱超微弱光检测器对空白组进行检测费氏弧菌的发光强度，记录空白组的发光强度；

②采用aol-1型全光谱超微弱光检测器对空白组和混合后的待测样品进行检测费氏弧菌的发光强度，记录空白组和样品的发光强度；

使用时，采用的是循环伏安法，初始电位0.2，高电位1.25，低电位0.2，扫描方向为正，灵敏度为1·e^-0.005；先用aol-1型全光谱超微弱光检测器进行环境光检测，检测时长为30秒，环境光检测结束后，将空白组和待测样品先后放入aol-1型全光谱超微弱光检测器中进行检测，检测时长同为30秒；

4)数据处理：

①构建费氏弧菌的发光强度与土壤重金属离子的浓度的关系模型：

采用响应面分析法拟合出离子综合浓度与相对发光强度由强到弱的线性关系模型，将此线性模型中各离子浓度等比例放大和缩小，不同倍数下斜率的绝对值相同，线性关系任然成立，如图2所示。

定义毒性系数：将pb²⁺:cu²⁺:ni²⁺的浓度比例为0.2:0.35:0.45mg/l时定义为毒性系数为1。

故放大10倍毒性系数就是10,放大0.3倍毒性系数就是0.3，放大0.5倍毒性系数就是0.5.以此类推得到模型，如图1所示

②对照模型：将计算步骤3)的相关发光强度，进行比对，得到待测样品中土壤重金属离子的浓度范围；

其中，

如图1，当样品的相对发光强度在区间0.283％-0.335％时，将样品的相对发光强度带入汞离子浓度与费氏弧菌相对发光强度关系图；若得到该样品的相对发光强度所对应的汞离子浓度在0.09mg/l以上，认为该样品属于本发明中的ⅲ级毒性区间，若小于或等于0.09mg/l，则认为该样品属于本发明中的ⅰ级毒性区间；

在本实施例中，得到样品的相对发光强度为0.726％，对应毒性区间ⅱ级，土壤的总毒性相当于重金属离子含量10¹等级，在采样时发现工厂外的土壤中混有塑料泡沫脚料，塑料制品在土壤中难以降解，因此此处土壤毒性较高有一定合理性。

实施例2

实施例2与实施例1的区别在于：

本实施例采集了某停产的工厂附近的土壤作为检测样品，，剔除砂砾、石子、杂草、植物残根后对样品进行研磨，先过2mm筛后再进行研磨过筛3遍，直至仅有少量沙粒停止，然后再过100目细筛。将过筛后的土壤以土壤：水＝1：5的比例配成土壤悬浊液，摇床震荡8h，静置16h后取得上清液，用20微米超滤膜进行过滤，将滤液以转速7000rpm，时间为3min进行离心，得到无色透明的溶液作为待测样品。

在本实施例中，得到样品的相对发光强度为0.773％，对应毒性区间ⅱ级，土壤的总毒性相当于重金属离子含量10¹等级。

实施例3

实施例3与实施例1的区别在于：

本实施例采集金属加工厂附近的土壤作为检测样品，剔除砂砾、石子、杂草、植物残根后对样品进行研磨，先过2mm筛后再进行研磨，,过筛5遍，直至仅有少量沙粒停止，然后再过100目细筛。将过筛后的土壤以土壤：水＝1：5的比例配成土壤悬浊液，摇床震荡8h，静置16h后取得上清液，用20微米超滤膜进行过滤，将滤液以转速9000rpm,时间为3min进行离心，得到无色透明的溶液作为待测样品。

在本实施例中，得到样品的相对发光强度为0.553％，对应毒性区间ⅱ级，土壤的总毒性相当于重金属离子含量10¹等级。

实施例4

实施例4利用本发明方法设计了一种土壤检测试剂盒。

试剂盒内包括费氏弧菌冻干粉2ml，费氏弧菌复苏液2ml，2％氯化钠溶液30ml,20μm超滤膜两张，说明书一份。说明书含有毒性检测模型图如图1，以及相对发光强度计算公式。

试剂盒的操作方法

1)将待测土壤样品风干、过筛，以土壤：水＝1：5的比例配成土壤悬浊液，摇床震荡8h，静置16h。取静置后的上清液通过20μm滤膜过滤，取滤液进行5000-9000rpm,3min的离心，取离心后的清液作为土壤待测液。

2)取费氏弧菌冻干粉和复苏液，置于室温下平衡15min。将2ml复苏液注入冻干粉试剂瓶中，静置10min。待复苏完成后将费氏弧菌以1:4的比例用2％的氯化钠溶液进行稀释，得到菌稀释液。

3)取2ml土壤待测液作为空白对照。取稀释菌液200μl，土壤待测液1800μl进行混合。本试剂盒共可检测80份样品，包括70份土壤待测样和10份空白对照。

为确保检测的准确性，本试剂盒使用时须保证稀释菌液与待测样品接触时间在15-20min内，可使用aol-1型全光谱超微弱光检测器或其他微弱光检测仪器检测费氏弧菌发光强度，检测最佳时长为30s。

(4)得到费氏弧菌的发光强度后，按照实施例1步骤4)中相对发光强度的计算公式计算样品相对发光强度，将其对应到本发明的模型中，即可判断每份待测土壤中重金属离子含量范围。

以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。