母猪初乳中PEDV特异性SIgA抗体的ELISA检测方法及其试剂盒与流程

本发明属于动物抗体检测技术领域，尤其涉及一种母猪初乳中pedv特异性siga抗体的elisa检测方法及其试剂盒。

背景技术：

猪流行性腹泻(porcineepidemicdiarrhea，ped)是在猪肠道发生的一种能导致猪水样腹泻、呕吐、脱水后死亡的疾病，该病具有发病急、传播快、死亡率高的特点，给养猪业带来巨大的困扰并造成严重的经济损失。pedv主要感染哺乳仔猪，其感染情况和发病情况与哺乳仔猪的日龄密切相关，尤以低日龄(10日龄以下)最易感染，其发病率和死亡率可达100％。因此，提高哺乳仔猪对pedv的抵抗力对预防ped是非常重要的。而黏膜免疫作为机体抵抗病原入侵的第一道防线，是哺乳仔猪抵抗外部抗原入侵的重要屏障，在提高哺乳仔猪抵抗力方面起着重要作用。

因10日龄的仔猪自身免疫系统并不完善，若想抵御pedv的侵染只能通过母乳来获得被动免疫，而母猪初乳中的免疫球蛋白主要是分泌型免疫球蛋白a(siga)，该球蛋白不能通过胎盘屏障，因此新生仔猪可从母乳中获取从而保护自身免于pedv的感染。

粘膜作为猪全身分布最广的免疫系统，其即可诱导局部免疫应答又可诱导全身免疫应答，免疫效果好，尤其是初生仔猪由于无法进行疫苗免疫，乳汁粘膜免疫在其抵抗外部抗原入侵发挥重要的作用，而乳汁黏膜免疫主要是哺乳仔猪通过母乳从母体中获得抗体而达到的。乳汁黏膜免疫主要起作用的抗体为siga，siga作为评价黏膜免疫重要指标，其组成成分有diga、sc和j链，而sc是siga特有的成分，是siga与iga、diga区分的主要标志，故可以通过sc来检测乳汁中siga抗体的水平，从而为哺乳仔猪初期的pedv的防控提供帮助。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种经济、便捷、快速、准确的母猪初乳中pedv特异性siga抗体的elisa检测方法及其试剂盒，以利于开展pedv疫苗免疫。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

母猪初乳中pedv特异性siga抗体的elisa检测试剂盒，包括包被酶标板，包被酶标板以pedv病毒粒子作为包被抗原。

上述elisa检测试剂盒，还包括包被液、封闭液、sc兔多抗(二抗)、hrp标记山羊抗兔igg(购自全式金生物技术有限公司)、洗涤液、稀释液、底物液、终止液。

pedv病毒粒子由pedv病毒液放置在紫外灯下灭活一个小时(每隔十分钟均匀摇晃5s)制备。

sc兔多抗按以下方法制备：

<1>猪sc片段基因的扩增及蛋白表达载体的构建

从母猪初乳中对猪sc基因的110-374位氨基酸序列进行扩增，得到pcr产物；将pcr产物进行胶回收并克隆至pmd-18t载体上，与原核表达载体pet-32a进行双酶切，并对酶切产物进行回收和纯化后，通过t4连接酶在16℃的条件下进行酶切产物的连接，得到重组表达载体pet-32a-sc，并对其进行测序及双酶切鉴定；

<2>重组质粒的诱导表达及检测

将双酶切和测序结果均正确的重组质粒转化至bl21(de3)plysschemicallycompetentcell中并涂板培养，然后放置于37℃水平摇床进行扩增，待扩增的菌液od值为0.6时，按照加入iptg(终浓度0.8mm)继续在37℃水平摇床诱导5h；将诱导好的菌液经离心，超声破碎等处理后进行sds-page电泳，以检测重组sc蛋白的表达情况和反应原性。

步骤<1>中扩增为先进行rt-pcr扩增，然后进行pcr扩增；

rt-pcr扩增体系共12.5μl，其中：takara：5×buffer2.5μl，takara：dntpmix(2.5mmol/μl)1μl，takara：m-mlvreversetranscriptase(200u/μl)0.25μl，vazyme：rnasin酶抑制剂(40u/μl)0.25μl，下游引物(针对单股正链rna)或oligodt0.5μl，rna8μl，42℃作用1h，得到cdna；

pcr扩增反应体系共25μl，其中：ddh2o8.5μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，primerstar酶12.5μl，cdna3μl；扩增条件为：94℃预变性5min；进入循环：94℃变性40s、62℃退火40s，72℃延伸50s，34个循环；72℃再延伸10min后，4℃保存，得到目的片段；

其中，所用sc片段引物为sc-f和sc-r，它们分别具有序列表seq.id.no.1和seq.id.no.2的碱基序列.

步骤<1>中双酶切体系共100μl，其中：质粒33μl，内切酶ecorⅰ7μl，内切酶hindⅲ7μl，10×buffer10μl，ddh2o43μl，37℃水浴锅过夜双酶切。

步骤<1>中酶切产物的连接体系共10μl，其中：t4dna连接酶1μl，双酶切重组质粒所回收的目的片段7μl，双酶切pet-32a载体所回收的目的片段1μl，t4dna连接酶buffer1μl；各组分混匀后，离心，16℃条件下连接至少8h。

母猪初乳中pedv特异性siga抗体的elisa检测方法，包括以下步骤：

抗原包被：将抗原pedv病毒粒子和包被液加入酶标板，进行包被；

封闭：加入含bsa的pbs作为封闭液进行封闭，弃去封闭液并用pbst洗去残余封闭液；

加抗体：先加入初乳，37℃孵育1h，反应后用pbst洗涤；

再加入sc兔多抗，37℃孵育1h，反应后用pbst洗涤；

然后加入hrp标记山羊抗兔igg，37℃孵育1h，反应后用pbst洗涤；

显色和测定：加底物，避光显色后加入终止液，在酶标仪450nm波长下进行读数。

包被抗原中，每孔包被的pedv病毒粒子约为10⁵，4℃的条件下至少包被12h；初乳(一抗)按以下处理：收集母猪的初乳，在4～8℃的条件下3000rpm/min离心30分钟，弃掉上层脂肪和下层沉淀，取中间层乳清；封闭中，加入含体积百分比1％bsa的pbs作为封闭液，在37℃的条件下封闭2h；显色和测定中，加入tmb，在37℃的条件下避光反应20min后，加入终止液。

初乳(一抗)的稀释度为1：10，加入量为100μl；sc兔多抗(二抗)的稀释度为1：1000，加入量为100μl；hrp标记山羊抗兔igg(三抗)的稀释度为1：2000，加入量为100μl。

针对母猪初乳中pedv特异性siga抗体检测缺乏有效手段的问题，发明人建立了一种母猪初乳中pedv特异性siga抗体的elisa检测方法，该法运用基因克隆、原核表达、多克隆抗体制备等技术，先从母猪初乳中克隆得到siga特有的成分sc片段，并构建原核表达载体对该片段进行表达，然后用pedv病毒对制备的兔抗猪sc多克隆抗体进行包被，封闭后依次加入一抗、二抗和三抗各孵育1h，最后加终止液测od450nm值。据此，发明人还研制了相应试剂盒，包括包被酶标板以pedv病毒粒子作为包被抗原。本发明具有经济、便捷、快速、准确的特点，为进一步探索母猪乳汁中pedv特异性siga抗体的动态变化规律、进行pedv粘膜免疫效果的评估以及对免疫程序的优化提供了可靠的方法，也为哺乳仔猪对pedv的预防提供科学依据。

附图说明

图1是sc扩增结果，图中：m：dl2000dnamarker；1：sc产物。

图2是pet-32a-sc重组质粒双酶切结果，图中：m：dl10000dnamarker；1：pet-32a-sc双酶切产物；2：pet-32a空载对照。

图3是pet-32a-sc重组质粒的同源性分析图，图中：1、pet-32a-sc测序结果，2、参考序列。

图4是pet-32a-sc重组蛋白表达形式分析图，图中：m：蛋白质分子质量标准；1：空载体；2：裂解上清；3：裂解沉淀。

图5是sc蛋白的纯化结果图，图中：m：蛋白质分子质量标准；1-4：sc纯化产物。

图6是sc多克隆抗体的western-bloting分析图，图中：m：蛋白质分子质量标准；1-2：sc纯化产物。

具体实施方式

一、母猪初乳中pedv特异性siga抗体的elisa检测方法

1.1抗原包被：将抗原pedv病毒粒子和包被液加入酶标板，进行包被，每孔包被的pedv病毒粒子约为10⁵，4℃的条件下至少包被12h；然后用pbst洗去未结合的抗原及杂质；

1.2封闭：加入含体积百分比1％bsa的pbs作为封闭液，在37℃的条件下封闭2h，然后弃去封闭液，并用pbst洗去残余的封闭液；

1.3加抗体：先加入10倍稀释的初乳，37℃孵育1h，反应后用pbst洗涤；再加入1000倍稀释的sc兔多抗，37℃孵育1h，反应后用pbst洗涤；然后加入2000倍稀释的hrp标记山羊抗兔igg，37℃孵育1h，反应后用pbst洗涤；

1.4显色和测定：加底物，避光显色后加入终止液，在酶标仪450nm波长下进行读数。

其中，sc片段多克隆抗体按如下制备：

<1>猪sc片段基因的扩增及蛋白表达载体的构建

从母猪初乳中对猪sc基因的110-374位氨基酸序列进行扩增，具体为：

采用以引物sc-f和sc-r作为特异性引物，上下游引物分别为限制性内切酶位点ecorⅰ和hindⅲ(下划线部分)。

先进行rt-pcr扩增，12.5μl的rt-pcr扩增体系为：

takara：5×buffer2.5μl，takara：dntpmix(2.5mmol/μl)1μl，takara：m-mlvreversetranscriptase(200u/μl)0.25μl，vazyme：rnasin酶抑制剂(40u/μl)0.25μl，下游引物(针对单股正链rna)或oligodt0.5μl，rna8μl，42℃作用1h，得到cdna；

然后进行pcr扩增，25μl的pcr扩增反应体系为：

ddh2o8.5μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，primerstar酶12.5μl，cdna3μl；扩增条件为：94℃预变性5min；进入循环：94℃变性40s、62℃退火40s，72℃延伸50s，34个循环；72℃再延伸10min后，4℃保存，得到目的片段；

将pcr产物进行胶回收并克隆至pmd-18t载体上，与原核表达载体pet-32a进行双酶切，双酶切体系为：质粒33μl，内切酶ecorⅰ7μl，内切酶hindⅲ7μl，10×buffer10μl，ddh2o43μl，37℃水浴锅过夜双酶切，并对酶切产物进行回收和纯化。

通过t4连接酶在16℃的条件下进行酶切产物的连接，10μl连接酶反应体系为：t4dna连接酶1μl，双酶切重组质粒所回收的目的片段7μl，双酶切pet-32a载体所回收的目的片段1μl，t4dna连接酶buffer1μl；各组分混匀后，离心，16℃条件下连接至少8h。得到重组表达载体pet-32a-sc，并对其进行测序及双酶切鉴定。

<2>重组质粒的诱导表达及检测

将双酶切和测序结果均正确的重组质粒转化至bl21(de3)plysschemicallycompetentcell中并涂板培养，然后放置于37℃水平摇床进行扩增，待扩增的菌液od值为0.6时，按照加入iptg(终浓度0.8mm)继续在37℃水平摇床诱导5h。将诱导好的菌液经离心，超声破碎等处理后进行sds-page电泳，以检测重组sc蛋白的表达情况和反应原性。

二、试剂盒组装

为方便使用，参照前述发明内容及组装检测试剂盒，试剂盒包含试剂如下：

包被酶标板、包被液、封闭液、sc兔多抗(二抗)、hrp标记山羊抗兔igg(购自全式金生物技术有限公司)、洗涤液、稀释液、底物液、终止液。

二、本发明elisa检测方法的应用

1、设计特异性引物

对ncbi公布的猪pigr序列(登陆号：nm-214159.1)进行分析，最终确定110-374位氨基酸为较好的抗原表位区域，再利用primer5.0软件设计扩增sc基因的110-374位氨基酸序列的特异性引物，上下游引物分别为限制性内切酶位点ecorⅰ和hindⅲ(下划线部分)；

表1引物信息

2、猪sc片段基因的扩增及蛋白表达载体的构建

从母猪初乳中对猪sc基因的110-374位氨基酸序列进行扩增，具体为：

先进行rt-pcr扩增，12.5μl的rt-pcr扩增体系为：

takara：5×buffer2.5μl，takara：dntpmix(2.5mmol/μl)1μl，takara：m-mlvreversetranscriptase(200u/μl)0.25μl，vazyme：rnasin酶抑制剂(40u/μl)0.25μl，下游引物(针对单股正链rna)或oligodt0.5μl，rna8μl，42℃作用1h，得到cdna；

然后进行pcr扩增，25μl的pcr扩增反应体系为：

ddh2o8.5μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，primerstar酶12.5μl，cdna3μl；扩增条件为：94℃预变性5min；进入循环：94℃变性40s、62℃退火40s，72℃延伸50s，34个循环；72℃再延伸10min后，4℃保存，得到目的片段；如图1所示，经1％琼脂糖凝胶电泳检测，在第1泳道出现795bp左右目的条带，与预期结果相符；用dna凝胶回收试剂盒回收和纯化目的片段，得到pcr产物。

3、pcr产物与原核表达载体分别进行双酶切

100μl双酶切体系为：质粒33μl，内切酶ecorⅰ7μl，内切酶hindⅲ7μl，10×buffer10μl，ddh2o43μl，37℃水浴锅过夜双酶切。对酶切产物进行回收和纯化，酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图2和图3所示。

4、连接

通过t4连接酶在16℃的条件下进行酶切产物的连接，10μl酶切产物的连接体系为：

t4dna连接酶1μl，双酶切重组质粒所回收的目的片段7μl，双酶切pet-32a载体所回收的目的片段1μl，t4dna连接酶buffer1μl；各组分混匀后，离心，16℃条件下连接至少8h，得到重组表达载体pet-32a-sc，并对其进行测序及双酶切鉴定。

5、重组质粒的诱导表达及检测

将双酶切和测序结果均正确的重组质粒转化至bl21(de3)plysschemicallycompetentcell中并涂板培养，然后放置于37℃水平摇床进行扩增，待扩增的菌液od值为0.6时，加入iptg(终浓度0.8mm)继续在37℃水平摇床诱导5h。将诱导好的菌液经离心，超声破碎等处理后进行sds-page电泳，以检测重组sc蛋白的表达情况和反应原性。

6、elisa检测操作

抗原包被：将抗原pedv病毒粒子和包被液加入酶标板，进行包被，每孔包被的pedv病毒粒子约为10⁵，4℃的条件下至少包被12h；然后用pbst洗去未结合的抗原及杂质；

封闭：加入含体积百分比1％bsa的pbs作为封闭液，在37℃的条件下封闭2h，然后弃去封闭液，并用pbst洗去残余的封闭液；

加抗体：先加入10倍稀释的初乳(100μl)，37℃孵育1h，反应后用pbst洗涤；再加入1000倍稀释的sc兔多抗(100μl)，37℃孵育1h，反应后用pbst洗涤；然后加入2000倍稀释的hrp标记山羊抗兔igg(100μl)，37℃孵育1h，反应后用pbst洗涤；其中，初乳按以下处理：收集母猪的初乳，在4～8℃的条件下3000rpm/min离心30分钟，弃掉上层脂肪和下层沉淀，取中间层乳清；

显色和测定：加tmb，在37℃的条件下避光显色后加入终止液，在酶标仪450nm波长下进行读数。

序列表

<110>广西大学

<120>母猪初乳中pedv特异性siga抗体的elisa检测方法及其试剂盒

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>27

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ccggaattctgtggtctgggcattagc27

<210>2

<211>27

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

cccaagcttgtttgtttccttcgggtt27

<210>3

<211>795

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

tgtggtctgggcattagcagccgaggcctgtcttttgatgtgagcctggaggtcagccaa60

ggtcctggacagataggtgatgtccacgtctacacagcagacctgggcagcacagtaacc120

atcaactgccctttcaagtctgagaatgctcagaagccgaaatccgtgtacaagaaactg180

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acatttgactgcgccctgggccaggagatggcaaatgtggccaaatttctgtgccagcta480

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ccgaaggaaacaaac795