一种同时检测TMV和TVBMV的速测卡及其制备、使用方法与流程

本发明涉及一种生物工程技术领域的速测卡及其使用方法，具体是一种同时检测烟草花叶病毒（tmv）和烟草脉带花叶病毒（tvbmv）的速测卡及其制备、使用方法。

背景技术：

烟草花叶病毒（以下简称tmv）为棒状病毒科（virgaviridae），烟草花叶病毒属（tobamovirus）病毒。病毒粒子为螺旋杆状，长300nm，直径18nm，病毒结构极为稳定，基因组为正单链rna。tmv寄主植物多达350余种，侵染烟草等茄科作物会出现明显的花叶和斑驳症状，并可造成严重的矮化或畸形，对农业生产危害极大。

烟草脉带花叶病毒（以下简称tvbmv），为马铃薯y病毒科（potyviridae），马铃薯y病毒属（potyvirus）病毒。病毒粒子为线状，基因组为正单链rna。tvbmv病害发生非常广泛，但是其症状极易和其他病毒混淆，生产中tvbmv被错误诊断而采取不当的防治方法的情况屡屡发生。

目前常规检测tmv和tvbmv的方法为pcr，需要专门的实验室场地，需要借助专门的仪器设备，并且对操作人员要求较高，需要有相当的专业知识、技能和操作经验，检测过程前处理复杂，所需时间很长。

以层析流动为检测原理的金标卡检测方法已在很多领域中有过应用，包括食品安全检测、植物转基因检测等，但针对烟草病毒的检测较少，而同时检测tmv和tvbmv等的速测卡还未见有公开报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种制备同时检测tmv和tvbmv的金标卡检测方法，并应用其针对叶片样品中tmv和tvbmv进行快速、现场和灵敏的检测。

本发明是通过以下技术方案实现的：一种同时检测烟草花叶病毒tmv和烟草脉带花叶病毒tvbmv的速测卡，包含：底板上依次粘贴的样品垫、金标垫、nc膜以及吸收垫，所述的金标垫固定有胶体金标记的tmv单克隆抗体和tvbmv单克隆抗体，所述的nc膜有两条检测线，分别固定tmv或tvbmv特异性多克隆抗体。

所述的tmv单克隆抗体和tvbmv单克隆抗体分别由分泌tmv单克隆抗体的杂交瘤细胞株和分泌tvbmv单克隆抗体的杂交瘤细胞株制备得到。

所述的金标垫上每种单克隆抗体的量为5ng-50ng，优化的量为tmv单克隆抗体24ng，tvbmv单克隆抗体36ng；nc膜上多克隆抗体的量为0.4μg-1.2μg，优化的量为tmv多克隆抗体0.4μg，tvbmv多克隆抗体0.45μg。

分泌tmv单克隆抗体的杂交瘤细胞株，保藏编号为cctccno:c2019177，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉，武汉大学，保藏日期：2019年9月27日，分类命名：杂交瘤细胞株fl085-01；分泌tvbmv单克隆抗体的杂交瘤细胞株，保藏编号为cctccno:c2019180，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉，武汉大学，保藏日期：2019年9月27日，分类命名：杂交瘤细胞株fl349-11。

还包括封盖板，所述的封盖板设置加样孔和结果观察孔，加样孔对应样品垫的位置，结果观察孔对应金标垫和nc膜位置。

所述的一种同时检测烟草花叶病毒tmv和烟草脉带花叶病毒tvbmv的速测卡的制备方法，（1）将tmv和tvbmv的特异性多克隆抗体和二抗分别固定于nc膜上；（2）在碱性条件下将胶体金颗粒分别与抗tmv特异性单克隆抗体与抗tvbmv特异性单克隆抗体通过静电作用力相互结合；（3）速测卡的组装：底板上依次粘贴的样品垫、金标垫、nc膜以及吸收垫，加盖封盖板与底板合并形成速测卡。

所述的一种同时检测烟草花叶病毒tmv和烟草脉带花叶病毒tvbmv的速测卡的使用方法，首先于加样孔中加入样品溶液并水平放置，样品溶液会沿样品垫渗透至胶体金标记抗体的试纸条，并与nc膜上的特异性抗原竞争结合试纸条上固定的特异性单克隆抗体。1min后，于结果观察孔中观察颜色变化，作出判断；如果只有控制线c线，没有相应的检测线t线，则表明为待检物质为阴性；既有控制线c线，又有相应的检测线t线，则表明待检物质为阳性。

本发明制得的新型tmv/tvbmv二合一速测卡对烟草叶片具有较好的抗干扰效果，可广泛应用于烟草的快速检测。较现有的速测卡操作相比，具有以下特有优势。

（1）同一张卡上能同时检测tmv和tvbmv，而不是两张单种卡的简单物理性胶连，加样仅需1次，而且反应均在同一条件下进行。

（2）样品前处理完全统一，操作简单，100微升样品加样量即可。

（3）检测时间短（1min）、结果判定标准统一。完全阴性结果（仅出现1条c线）；阳性（＋）：只要任何一条tmv/tvbmv的t线显色。

（4）采用双抗加芯的检测方法（即金标垫和检测线处均固定抗体，现有技术中，检测线处固定抗原），能解决现有技术中采用单抗检测方法无法准确检测大分子化合物的技术缺陷。

本发明提供的同时检测tmv和tvbmv的二合一免疫胶体金速测卡可为实际检测部门提供了快速、现场和灵敏的检测方法，主要应用于叶片样品的检测。

附图说明：

图1为本发明速测卡的结构示意图，1-结果观察孔；2-c线、控制线；3-tmv线；4-tvbmv线；5-加样孔。

具体实施方式

结合本发明的内容提供以下实施例:

（1）tmv、tvbmv单克隆抗体的制备

取保藏编号为c2019177的tmv单克隆抗体杂交瘤细胞株和保藏编号为c2019180的tvbmv单克隆抗体杂交瘤细胞株，在细胞培养瓶中扩大培养；

取7周龄balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡，每只小鼠0.2ml。10天后腹腔接种一定数量的单克隆抗体杂交瘤细胞。小鼠腹部明显膨大，用弯头滴管采集腹水，间接elisa测定腹水抗体效价。

小鼠腹水离心15min（2000rpm，室温），挑去上层油脂，在4℃搅拌下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵至半饱和，继续搅拌30min，离心30min（13000rpm，4℃），弃上清；沉淀溶于适量pbs(0.01mph7.4)；在4℃搅拌下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵至33%，继续搅拌30min，离心30min（13000rpm，4℃），弃上清；沉淀溶于适量pbs（0.01m，ph7.4），4℃透析过夜，测定蛋白质含量，-20℃冻存备用。

硫酸铵沉淀后继续才用proteing小柱进行纯化，新柱子先用5ml超纯水过柱，再用5ml0.4mpb缓冲液(ph7.0)平衡纯化小柱；抗体过柱，过程中要求缓慢过柱，以求抗体蛋白更好的结合在结合位点上；继续10ml0.4mpb缓冲液(ph7.0)平衡纯化小柱；5ml0.1m甘氨酸-盐酸缓冲液（ph7.0）洗脱结合位点上的抗体，并加入1mtris-hci(ph2.7)中和甘氨酸，使ph保持为适合抗体保存的中性；10ml0.4mpb缓冲液(ph7.0)平衡纯化小柱；5ml20%乙醇溶液过柱，于4℃条件下保存纯化小柱。

（2）兔多克隆抗体制备

取2月龄雌性新西兰大白兔一只进行免疫，共进行三次免疫，采取腹股沟皮下多点注射。每次每只新西兰大白兔抗原免疫用量为500μg，初次免疫用等量弗氏完全佐剂乳化，第二次免疫用等量弗氏不完全佐剂乳化，第三次免疫用等量生理盐水混合，耳静脉注射加强免疫。加强免疫14天后取血。

血清离心15min（4000rpm，室温），取上清，在4℃搅拌下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵至半饱和，继续搅拌30min，离心30min（13000rpm，4℃），弃上清；沉淀溶于适量pbs(0.01m,ph7.4)；在4℃搅拌下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵至33%，继续搅拌30min，离心30min（13000rpm，4℃），弃上清；沉淀溶于适量pbs（0.01m,ph7.4），4℃透析过夜，测定抗体含量，-20℃冻存备用。硫酸铵沉淀后继续采用proteing小柱进行纯化，新柱子先用5ml超纯水过柱，再用5ml0.4mpb缓冲液(ph7.0)平衡纯化小柱；抗体过柱，过程中要求缓慢过柱，以求抗体蛋白更好的结合在结合位点上；继续10ml0.4mpb缓冲液(ph7.0)平衡纯化小柱；5ml0.1m甘氨酸-盐酸缓冲液（ph2.7）洗脱结合位点上的抗体，并加入1mtris-hcl(ph8.0)中和甘氨酸，使ph保持为适合抗体保存的中性。

（3）tmv/tvbmv二合一速测卡的制作

1）在封盖板（塑料板）有两个的孔，分别为加样孔和观察孔，加样孔大小为3mm×7mm，观察孔大小为4mm×18mm；加样孔对应样品垫的位置，结果观察孔对应金标垫和nc膜位置；

2）在底板（塑料板）依次粘贴样品垫（玻璃纤维膜）和的固定有胶体金标记抗体的试纸条、nc膜、吸收垫。玻璃纤维膜大小为4mm×15mm；金标记抗体试纸条大小为3mm×4mm；nc膜大小为4mm×28mm；吸收垫大小为4mm×19mm；

3）以haucl4为原料，采用柠檬酸钠还原法制备粒径为25nm的胶体金，在碱性条件下将胶体金颗粒分别与tmv特异性单克隆抗体与tvbmv特异性单克隆抗体通过静电作用力相互结合；

4）使用划膜喷金标机，在金标垫上固定5ng-50ng两种单克隆抗体，优化的量为tmv单克隆抗体24ng，tvbmv单克隆抗体36ng，nc膜上固定0.4μg-1.2μg两种多克隆抗体，优化的量为tmv多克隆抗体0.4μg，tvbmv多克隆抗体0.45μg；

5）使用划膜喷金标机，将tmv和tvbmv的特异性多克隆抗体和二抗（羊抗小鼠）分别固定于nc膜上，自然风干后，封闭缓冲液中封闭一小时、洗涤缓冲液中洗两次后在室温条件下自然风干；控制线c线上的二抗（羊抗小鼠），它是以抗体为抗原制备的可以识别抗体免疫球蛋白igg的抗体，只要是抗体经过，它都会反应，因此用来做质控线。

6）加盖封盖板与底板合并形成速测卡；成速测卡于37℃干燥，时间为30min。

（4）tmv/tvbmv二合一速测卡检测病毒粒子效果评价

①加样孔中加入100μl空白样品液（ph7.4，0.2mol/lpbs:8g氯化钠、3.35g十二水合磷酸氢二钠，0.2g磷酸二氢钾，0.2g氯化钾，双蒸水溶解定容至1l），在室温条件下反应8分钟后在结果观察孔中观察显色结果。结果表明，观察孔中呈现明显的酒红色的控制线c线，t1线和t2线不显色。

②加样孔中加入100μl1μg/ml的tmv病毒粒子溶液（采样同上的pbs溶液稀释配成），按照与空白样品同样的操作步骤。结果表明，观察孔中控制线c线、检测线t1线，检测线t2线无色。

③加样孔中加入100μl1μg/ml的tvbmv病毒粒子溶液（采样同上的pbs溶液稀释配成），按照与空白样品同样的操作步骤。结果表明，观察孔中控制线c线、检测线t2线，检测线t1线无色。

④加样孔中加入100μl同时含有1μg/ml的tmv病毒粒子和1μg/ml的tvbmv病毒粒子溶液（采样同上的pbs溶液稀释配成），按照与空白样品同样的操作步骤。结果表明，观察孔中控制线c线、检测线t1线、检测线t2线呈现酒红色。

（5）tmv/tvbmv二合一速测卡检测叶片样本效果评价

①加样孔中加入100μl阴性叶片样本提取液，按照与空白样品同样的操作步骤。结果表明，观察孔中呈现明显的酒红色的控制线c线，检测线t1线、t2线不显色。

②加样孔中加入100μltmv阳性的叶片样本提取液，按照与空白样品同样的操作步骤。结果表明，观察孔中控制线c线、检测线t1线呈现酒红色，检测线t2线无色。

③加样孔中加入100μltvbmv阳性的叶片样本提取液，按照与空白样品同样的操作步骤。结果表明，观察孔中控制线c线、检测线t2线呈现酒红色，检测线t1线无色。

④加样孔中加入100μltmv和tvbmv均为阳性的叶片样本提取液，按照与空白样品同样的操作步骤。结果表明，观察孔中控制线c线、检测线t2线、检测线t1线呈现酒红色。

经试验得到本检测卡检测灵敏度：tmv：100ppb，tvbmv：500ppb。

申请人声明，本发明专利通过上述实施例来说明本发明专利的技术方案，所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明专利的任何改进，均落在本发明的专利保护范围内。