一种单克隆多聚体M蛋白解聚方法与流程

本发明属于医学检验技术领域，具体涉及一种单克隆多聚体m蛋白解聚方法。

背景技术：

m蛋白是浆细胞或b淋巴细胞单克隆大量增殖时所产生的一种异常免疫球蛋白，其氨基酸组成及排列顺序十分均一，空间构象、电泳特征也完全相同，本质为免疫球蛋白或其片段(轻链、重链等)。由于它产生于单一克隆(monoclone)，又常出现于多发性骨髓瘤(multiplemyeloma)、巨球蛋白血症(macroglobulinemia)、恶性淋巴瘤(malignantlymphoma)病人的血或尿中，故称m蛋白。m蛋白血症可分为恶性与意义不明的两大类。恶性m蛋白血症多见于多发性骨髓瘤(包括轻链病)、巨球蛋白血症、重链病、7sigm病(solomen－konkel病)、半分子病及不完全骨髓瘤蛋白病(c端基因缺陷)等。意义不明的m蛋白血症(monoclonalgammopathyofundeterminedsignificance，mgus)又分为两种，一种是与其他恶性肿瘤(如恶性淋巴瘤)伴发者，另一种即所谓良性m蛋白血症。

m蛋白的检测方法主要有琼脂或琼脂糖电泳、免疫电泳、免疫固定电泳、选择免疫电泳等。m蛋白在电泳时出现典型的单株峰(亦称m区带)，特点是区带窄而浓，扫描时呈现尖高峰，在γ区高比宽≥2，在β区≥1。此m区带可因ig的不同而出现在在γ～α2的任何区域。m蛋白增殖的另一特点是其他各区带明显减少，显示图像较简单。有时有的患者血中m蛋白并不高，这是由突变细胞的ig分泌能力决定的。这种病人的血清在电泳时m峰可不明显，易被其他蛋白掩盖，需采用稀释血清成应用其他敏感方法如免疫固定电泳来检测。

免疫电泳时，通常结果有以下三种情况：①正常人血清免疫电泳结果：可分辨出20多种蛋白成分。在阳极端有船形很浓的沉淀线为白蛋白。通常ig组分靠阴极端，最靠近加样孔者为igm，依次为iga、igg，三者成平滑的连续沉淀线。②多发骨髓瘤：多发性骨髓瘤分igg、iga、igm、igd和ige5种，igg和iga又分亚类，所有ig的轻链又分两个型。因此，免疫电泳时变形沉淀线的位置随各分子的电泳区带不同而异，从慢γ～β2区皆可出现。igg1多出现在慢γ区，igg4在β～α2区。m蛋白与相应的抗重链血清、抗轻链血清形成迁移范围十分局限的浓密的沉淀弧。由于此种病人血清中ig含量甚高，免疫扩散时可出现抗原绝对过剩而不出现沉淀线，此时需稀释血清重做，往往可获得满意结果。③巨球蛋白血症：由于igm分子大量增殖所致。在免疫电泳时，常常出现以下特征：一是沉淀线明显变形。正常情况下，igm形成短小沉淀线，不易看到变形。当igm大量出现时，则会使整个igm沉淀线变形。二是抗原孔周围和电泳纵轴出现团块状沉淀。三是电泳时igm组分无迁移，这多是igm分子聚合，电泳不移动所致。此时，四级结构的抗原决定簇不易打开，根据蛋白特性和原理，需要用一种有机化学试剂来处理这种情况的m蛋白的再检测。比如：传统方法一般用1％或10％的β-巯基乙醇对血清进行解聚处理，β-巯基乙醇可以还原二硫键，二硫键被打开后可以使蛋白质的四级或三级结构被破坏。

由于β-巯基乙醇能够打开蛋白质的结构，它常常被用于蛋白质分析。去掉干扰条带，呈现客观m蛋白条带，使结果更容易判读。但是，β-巯基乙醇属于高毒化学品，经皮肤、吞咽吸收有致命危险；刺激眼睛、呼吸道粘膜，引起慢性咽炎。同时属于易燃品，储运具有一定的危险性。所以，寻找合适可以替代本品处理m蛋白的检测方法是很有必要的。

技术实现要素：

基于此，本发明提供一种单克隆多聚体m蛋白解聚方法，所述单克隆多聚体m蛋白解聚方法能很好地对单克隆多聚体m蛋白进行解聚，且解聚过程中使用的是无毒有机化学试剂，安全环保。

具体技术方案为：

一种单克隆多聚体m蛋白解聚方法，包括以下步骤：

(1)采集静脉血，分离得到血清样本；

(2)向血清样本中加入含有二硫苏糖醇的pbs缓冲液，混匀得到混合液，使二硫苏糖醇在混合液中的浓度为0.04-0.3mol/l；

(3)将步骤(2)中的混合液于15-30℃孵育15-30min。

在其中一些实施例中，所述分离血清样本的方法如下：将采集的血液于3000-5000rpm/min条件下离心3-5min。

在其中一些实施例中，所述二硫苏糖醇在所述混合液中的浓度为0.05-0.15mol/l。

在其中一些实施例中，所述二硫苏糖醇在所述混合液中的浓度为0.05mol/l。

在其中一些实施例中，所述步骤(2)具体为：按体积比为1：1向血清样本中加入含0.08-0.6mol/l二硫苏糖醇的pbs缓冲液，混匀得到混合液，使二硫苏糖醇在混合液中的浓度为0.04-0.3mol/l。

在其中一些实施例中，所述步骤(2)具体为：按体积比为1：1向血清样本中加入含0.1-0.3mol/l二硫苏糖醇的pbs缓冲液，混匀得到混合液，使二硫苏糖醇在混合液中的浓度为0.05-0.15mol/l。

在其中一些实施例中，所述步骤(2)具体为：按体积比为1：1向血清样本中加入含0.1mol/l二硫苏糖醇的pbs缓冲液，混匀得到混合液，使二硫苏糖醇在混合液中的浓度为0.05mol/l。

在其中一些实施例中，所述孵育为25℃孵育20min。

本发明所述单克隆多聚体m蛋白解聚方法为利用含二硫苏糖醇的pbs缓冲液对血清样本进行处理，发明人经过研究发现，二硫苏糖醇的溶剂以及二硫苏糖醇在血清处理体系中的浓度均会明显影响单克隆多聚体m蛋白的解聚效果。向血清样本中加入含二硫苏糖醇的pbs缓冲液进行处理，并且使二硫苏糖醇在血清处理体系中的浓度为0.04-0.3mol/l时可以很好地对血清样本中的单克隆多聚体m蛋白进行解聚，而向血清样本中按相同方式加入相同量的含二硫苏糖醇的生理盐水进行处理，则不能对使血清样本中的单克隆多聚体m蛋白解聚。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供的单克隆多聚体m蛋白解聚方法可以很好地对单克隆多聚体m蛋白进行解聚，保证高分辨率电泳和免疫固定检测结果的准确性，且解聚效果优于使用β-巯基乙醇进行解聚，检测得到的沉淀带更清晰，结果更加直观易于判断。所述单克隆多聚体m蛋白解聚方法不需要使用有毒化学试剂，不会危害实验人员的身体健康，也不会污染环境，更加绿色安全。此外，iga型免疫球蛋白由于分子构象的关系，其轻链位点易被遮蔽，不能与轻链抗体相结合，导致检测结果不准确，而本发明所述解聚方法能有效解决此问题，进一步提高检测结果的准确性。

附图说明

图1为1-6号样本未解聚处理和经过实施例3所述方法进行单克隆多聚体m蛋白解聚后的检测结果图。

图2为10号样本分别经实施例3和对比例所述方法进行单克隆多聚体m蛋白解聚后的检测结果图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

实施例1

本实施例一种单克隆多聚体m蛋白解聚方法，包括以下步骤：

(1)采集静脉血，3000rpm/min离心5min，分离得到血清样本；

(2)按体积比为1：1向血清样本中加入含有0.4mol/l二硫苏糖醇的pbs缓冲液，混匀得到混合液，使二硫苏糖醇在混合液中的浓度为0.2mol/l；

(3)将步骤(2)中的混合液于25℃孵育20min。

实施例2

本实施例一种单克隆多聚体m蛋白解聚方法，包括以下步骤：

(1)采集静脉血，3000rpm/min离心5min，分离得到血清样本；

(2)按体积比为1：1向血清样本中加入含有0.3mol/l二硫苏糖醇的pbs缓冲液，混匀得到混合液，使二硫苏糖醇在混合液中的浓度为0.15mol/l；

(3)将步骤(2)中的混合液于25℃孵育20min。

实施例3

本实施例一种单克隆多聚体m蛋白解聚方法，包括以下步骤：

(1)采集静脉血，3000rpm/min离心5min，分离得到血清样本；

(2)按体积比为1：1向血清样本中加入含有0.1mol/l二硫苏糖醇的pbs缓冲液，混匀得到混合液，使二硫苏糖醇在混合液中的浓度为0.05mol/l；

(3)将步骤(2)中的混合液于25℃孵育20min。

对比例1

本对比例一种单克隆多聚体m蛋白解聚方法，采用β-巯基乙醇进行解聚处理，具体步骤如下：

(1)采集静脉血，3000rpm/min离心5min，分离得到血清样本；

(2)按体积比为1：3向血清样本中加入1％β-巯基乙醇还原液(25μl1％β-巯基乙醇还原液+75μl血清样本)，混匀得到混合液；1％β-巯基乙醇还原液制备方法如下：取10μlβ-巯基乙醇加入90μl生理盐水中，得到10％β-巯基乙醇，从10％β-巯基乙醇中取10μl加入90μlfluidil中，得1％β-巯基乙醇还原液；

(3)将步骤(2)中的混合液于25℃孵育20min。

对比例2

本对比例一种单克隆多聚体m蛋白解聚方法，除了二硫苏糖醇的溶剂为生理盐水外，其他均与实施例3相同，具体步骤如下：

(1)采集静脉血，3000rpm/min离心5min，分离得到血清样本；

(2)按体积比为1：1向血清样本中加入含有0.1mol/l二硫苏糖醇的生理盐水，混匀得到混合液，使二硫苏糖醇在混合液中的浓度为0.05mol/l；

(3)将步骤(2)中的混合液于25℃孵育20min。

对比例3

本对比例一种单克隆多聚体m蛋白解聚方法，除了二硫苏糖醇在混合液中的浓度为0.01mol/l外，其他均与实施例3相同，具体步骤如下：

(1)采集静脉血，3000rpm/min离心5min，分离得到血清样本；

(2)按体积比为1：1向血清样本中加入含有0.02mol/l二硫苏糖醇的pbs缓冲液，混匀得到混合液，使二硫苏糖醇在混合液中的浓度为0.01mol/l；

(3)将步骤(2)中的混合液于25℃孵育20min。

对比例4

本对比例一种单克隆多聚体m蛋白解聚方法，除了二硫苏糖醇在混合液中的浓度为0.35mol/l外，其他均与实施例3相同，具体步骤如下：

(1)采集静脉血，3000rpm/min离心5min，分离得到血清样本；

(2)按体积比为1：1向血清样本中加入含有0.7mol/l二硫苏糖醇的pbs缓冲液，混匀得到混合液，使二硫苏糖醇在混合液中的浓度为0.35mol/l；

(3)将步骤(2)中的混合液于25℃孵育20min。

利用实施例1-3和对比例1-4中的单克隆多聚体m蛋白解聚方法处理10例经确认为需要进行解聚处理的血液样本，然后进行高分辨率电泳和免疫固定检测，具体步骤如下：

一、样本的准备

1.单克隆多聚体m蛋白解聚处理：分别利用实施例1-3和对比例1-4中的单克隆多聚体m蛋白解聚方法进行解聚处理。

2.加样：各组取17μl单克隆多聚体m蛋白解聚处理后的血清样本放入样品盘的sp槽内，再取17μl稀释后的样本放入样品盘的igg，igaigm，k，λ槽内。

二、操作步骤

1.放置电泳胶片：

a.取2毫升界面液放入电泳槽内。

b.打开胶片的密封袋，取出胶片，揭去其上保护膜。

c.将胶片缓缓放入电泳槽内，其下不可残留汽泡。

d.用滤纸(blotc)将胶片上多余水分吸去。

2.点样：

取一片点样刀锋放在自动加样器4、10、16号位。

3.电泳：

a.将电极棒分别安放在电泳槽的正负极(外侧)，轻轻关上电泳槽的盖子。

b.按“selecttest”选择“serumife”为电泳项目。

c.按“start”--》“start”--》“continue”开始电泳，操作面板的屏幕上会显示当时的电压，电流，温度，剩余时间等参数。7分30秒后，仪器会自动报警提示电泳完成。打开盖子，用胶片铲将电泳片两侧盐桥切掉。

4.加抗血清：

a.将抗血清板放在胶片上(定位点上下对齐)，分别取50ul抗血清从靠右侧的孔内加在sp，igg，igaigm，k，λ槽内。

b.按“continue”，孵育开始。10分钟后孵育完成，仪器会自动报警提示。

c.10分钟后，打开盖子，取三片滤纸梳安插在抗血清板靠右侧的孔内，按“continue”开始吸去胶片上多余的抗血清。2分钟后仪器会自动报警提示完成。

d.2分钟后，打开盖子，移去抗血清板。

e.取一片滤纸(blotd)放在胶片上，手指均匀按压后按“continue”开始下一步操作,10分钟后仪器会自动报警提示完成。

f.打开盖子，去掉滤纸片，按“continue”开始下一步操作(烘干)。

g.8分钟后烘干完成，仪器会自动报警提示已完成。

5.染色：

a.打开盖子，取出胶片，将其挂在染色架上，放入染色槽内。

b.按“selecttest”选择“serumife”为操作项目。

c.按“start”--》“start”--》“continue”开始染色。

d.染色完成后，仪器会自动报警提示。此时可取出染色架取下胶片。

6.扫描：

a.启动扫描仪，将胶片放在胶片架上(圆孔在左侧)。

b.启动电脑进入win2000系统，运行epson扫描软件presto！。

c.在扫描软件界面下，用鼠标按扫描仪图标后出现扫描设置面板，设置如下：

原稿来源：平台式

解析度：266---600

d.用鼠标按“预扫描”后出现预扫描图谱，用鼠标选定扫描范围。

e.范围选定后，用鼠标按“扫描”开始扫描；图谱出现后，用鼠标按“photoshople”图标，软件会自动启动photoshop。

f.在photoshop界面下点开“file”菜单，选择“print”可打印图谱。

7.结果分析。

具体结果如表1和表2所示：

表1实施例1-3和对比例1解聚处理后检测结果

表2对比例2-4解聚处理后检测结果

由表1和图1可知，实施例1-3中的方法可以很好地对单克隆多聚体m蛋白进行解聚(图1，以实施例3为例)，保证了后续检测结果的准确性，且实施例1-3所述方法对单克隆多聚体m蛋白的解聚效果优于对比例1(使用β-巯基乙醇)，例如，10号样本经过β-巯基乙醇解聚后仍然具有干扰条带，不能得出准确检测结果，但是经过本发明方法二硫苏糖醇解聚处理后可以成功实现检测(图2)。

由表2可知，与实施例3相比，对比例2向血清样本中加入含有二硫苏糖醇的生理盐水进行处理，未能实现对单克隆多聚体m蛋白的解聚。与实施例3相比，对比例3和对比例4中二硫苏糖醇在血清处理体系中的浓度过低或过高，其对单克隆多聚体m蛋白的解聚效果均明显下降，导致一些血清样本不能成功解聚，不能实现检测。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。