一种联合定量检测五项心脏标志物试剂盒的制作方法

本实用新型涉及临床医学检验领域，具体地说，涉及一种联合定量检测超敏c反应蛋白、髓过氧化酶脂蛋白磷脂酶a2、氧化低密度脂蛋白和f2-异前列腺素荧光免疫层析检测试剂盒。

背景技术：

心血管性疾病是临床上常见的急危重症，病死率高、病情凶险，严重威胁着人类的健康与生命。有资料表明，心血管病的基本病理变化是动脉粥样硬化，近年来的研究显示炎症反应是动脉粥样硬化及心血管疾病的基础，尤其是慢性炎症被认为能增加动脉损伤疾病风险，使动脉粥样硬化斑块易于破裂，在动脉粥样硬化的形成中起了关键作用。动脉损伤是全身心血管系统的一种慢性炎症反应结果。但由于动脉损伤早期缺乏明显的临床表现，所以确诊时多处于疾病的中晚期，导致患者的预后差和过多的医疗花费。于是寻找有效的监测早期动脉病变、预测严重心脑血管病风险的心脑血管标志物具有重要的临床意义。

hs-crp是炎症病变的敏感标志物，能准确的检测低浓度c反应蛋白。临床试验表明，血清hs-crp水平随着冠心病病情呈渐进性升高趋势。hs-crp是反映炎性过程的敏感、精确的指标，体内轻微的炎症就可以导致hs-crp升高，流行病学研究显示增高的hs-crp可以预示10年内的chd发生。lp-pla2是钙离子非依赖性的分子量为45kda的分泌型蛋白。lp-pla2由巨噬细胞产生，是血管内皮炎症的标记物，不受其他炎症性疾病影响。可以特异性检测早期血管炎症的发生。多项临床试验研究表明，基础lp-pla2水平较高者以后发生心血管事件的比例较基础lp-pla2水平较低者显著升高。mpo是一种中性溶酶体酶，由活化的中性粒细胞、单核细胞及巨噬细胞产生，参与人体内多种炎症反应和氧化应激过程。mpo升高提示患者可能存在冠状动脉炎症，但血管未完全堵塞，并未引起心肌坏死，可以用于预测早期不良心血管事件发生的可能性。冠心病患者血浆中ox-ldl水平是正常对照者的2倍。血液f2-isop水平与冠心病的病变范围和严重程度密切有关。本实用新型一种联合定量检测hs-crp、mpo、lp-pla2、ox-ldl和f2-isop荧光免疫层析检测试剂盒将以上五者结合，通过联合检测患者血液hs-crp、mpo、lp-pla2、ox-ldl和f2-isop水平，可以更加准确有效地预测患者严重心脑血管病风险的可能，实现严重心血管事件早期诊断、风险预测和严重性评估。

中国发明专利cn201810746660.2公开了一种联合定量检测炎症标志物血清淀粉样蛋白a、超敏c反应蛋白与降钙素原检测试纸，该方法仅涉及炎症标志物，一般是产生验证了，才会检测出来，无法实现风险评估。目前临床应用的单一指标检测产品只能同时检测一个指标，五个指标需要五个检测试剂才能完成，具有检测效率低、成本高、耗材浪费等缺陷。

近年来，心血管事件已成为我国人口病死原因的第一位，故早期识别诊断及对其进行风险分级具有重要的临床意义。因此，发明一种对心脑血管性疾病早期诊断和风险分级准确度高的检测试剂盒很有必要。本实用新型联合应用心血管标志物hs-crp、mpo、lp-pla2、ox-ldl和f2-isop的荧光免疫层析法对心血管疾病进行预测和诊断，与传统指标相比，hs-crp、mpo、lp-pla2、ox-ldl和f2-isop的联合应用在严重心血管事件早期诊断和风险预测方面准确性更高，优势明显，预计可降低30％的死亡率。且本实用新型采用荧光免疫层析法，具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化、阳性检出率达90％以上、假阳性达到了最小化、检测效率高、检测成本低等突出优点，有重要的实用意义。

技术实现要素：

本实用新型的目的在于解决现有技术的不足，提供一种灵敏度高、准确性强、操作简便的联合定量检测hs-crp、mpo、lp-pla2、ox-ldl和f2-isop荧光免疫层析检测试剂盒。

本实用新型目的可通过采用以下技术方案予以实现：

一种联合定量检测超敏c反应蛋白、髓过氧化酶、脂蛋白磷脂酶a2、氧化低密度脂蛋白、f2-异前列腺素荧光免疫层析检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括检测卡、干燥剂和密封袋，所述检测卡包括扣卡和试剂条；所述试剂条包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸和pvc底板，所述结合垫分别包被有hs-crp抗体、mpo抗体、lp-pla2抗体、ox-ldl抗体、f2-isop抗体；所述硝酸纤维素膜包被固定有与所述检测抗体具有对人hs-crp、mpo、lp-pla2、ox-ldl、f2-isop配对结合特性的抗人hs-crp、mpo、lp-pla2、ox-ldl、f2-isop捕获抗体。

所述的检测卡为独立检测卡，五个检测项目的检测卡平行排列，检测卡排列顺序不限定。

所述的试剂盒为长方体形状。

本实用新型具有的积极效果：

(1)氧化低密度脂蛋白是新一代心脏标志物，一旦心脏受损，就回立刻体现出来，并被检测到，达到早期诊断的目的，为患者赢得宝贵的治疗时间。

(2)本实用新型采用荧光免疫层析检测方法制备试剂盒，解决了传统胶体金法、免疫比浊法、酶联免疫法存在判断准确度不高、易出现假阳性、检测耗时长、操作复杂的问题。项目方法具有特异、敏感、快速、准确、重复性好、易自动化、假阳性达到了最小化、检测效率高、检测成本低、操作简便等突出优点。

附图说明

图1为本实用新型试剂条结构的示意图。

图2为五联扣卡结构示意图。

具体实施方式

下述实施例结合附图对本实用新型进行进一步说明，但本实用新型并不局限于以下说明。

如图1、图2所示，本实用新型检测试剂盒除所述干燥剂和密封袋外，主要结构检测卡包括五联扣卡7和试剂条1，其中试剂条1包括样品垫5、结合垫3、硝酸纤维素膜2、吸水纸4和pvc底板6；五联扣卡7，扣卡均包括加样孔8和观察窗9，试剂条1安置于五联扣卡7内。

实施例：

(1)样品垫

用ph8.0碳酸氢钠缓冲液溶解bsa和nacl，至bsa终浓度为2％，nacl终浓度为0.1m，然后加入表面活性剂tween20至终浓度为0.5％，调节ph到8.0，按玻璃纤维素膜吸水量60ul/cm2，将以上缓冲液均匀铺于玻璃纤维素膜上，置于37℃干燥8小时即得样品垫。置于4℃保存，备用。

(2)结合垫

将荧光微球标记的单克隆抗体均匀铺在步骤(1)制得的样品垫上，真空冷冻干燥后密封，置于室温保存，备用。其中荧光微球标记的单克隆抗体制备过程如下：

a.荧光微球标记的hs-crp单克隆抗体

取粒径大小为300nm的荧光微球溶液0.5ml，用50mm，ph6.0的mes缓冲液2ml清洗去除微球溶液中的表面活性剂，然后50mm，ph6.0的mes缓冲液溶解微球至2ml，再用500ul10mg/ml活化剂edc和500ul50mg/ml稳定剂nhs进行活化，然后用50mm，ph6.0的mes清洗，去除剩余的活化剂，10mmpbs重新溶解微球，将活化好的荧光微球与hs-crp单克隆抗体混合，抗体终浓度为120ug/ml，最终体积为2ml，室温下，充分搅拌反应2h，离心去除上清，然后用1％酪蛋白溶液2ml进行封闭反应1个小时，然后用缓冲液清洗、溶解定容至5ml，即得荧光微球标记的hs-crp单克隆抗体。

b.荧光微球标记的mpo单克隆抗体

取粒径大小为300nm的荧光微球溶液0.5ml，用50mm，ph6.0的mes缓冲液2ml清洗去除微球溶液中的表面活性剂，然后50mm，ph6.0的mes缓冲液溶解微球至2ml，再用500ul10mg/ml活化剂edc和500ul50mg/ml稳定剂nhs进行活化，然后用50mm，ph6.0的mes清洗，去除剩余的活化剂，10mmpbs重新溶解微球，将活化好的荧光微球与mpo单克隆抗体混合，抗体终浓度为120ug/ml，最终体积为2ml，室温下，充分搅拌反应2h，离心去除上清，然后用1％酪蛋白溶液2ml进行封闭反应1个小时，然后用缓冲液清洗、溶解定容至5ml，即得荧光微球标记的mpo单克隆抗体。

c.荧光微球标记的lp-pla2单克隆抗体

取粒径大小为300nm的荧光微球溶液0.5ml，用50mm，ph6.0的mes缓冲液2ml清洗去除微球溶液中的表面活性剂，然后50mm，ph6.0的mes缓冲液溶解微球至2ml，再用500ul10mg/ml活化剂edc和500ul50mg/ml稳定剂nhs进行活化，然后用50mm，ph6.0的mes清洗，去除剩余的活化剂，10mmpbs重新溶解微球，将活化好的荧光微球与lp-pla2单克隆抗体混合，抗体终浓度为120ug/ml，最终体积为2ml，室温下，充分搅拌反应2h，离心去除上清，然后用1％酪蛋白溶液2ml进行封闭反应1个小时，然后用缓冲液清洗、溶解定容至5ml，即得荧光微球标记的lp-pla2单克隆抗体。

d.荧光微球标记的ox-ldl单克隆抗体

取粒径大小为300nm的荧光微球溶液0.5ml，用50mm，ph6.0的mes缓冲液2ml清洗去除微球溶液中的表面活性剂，然后50mm，ph6.0的mes缓冲液溶解微球至2ml，再用500ul10mg/ml活化剂edc和500ul50mg/ml稳定剂nhs进行活化，然后用50mm，ph6.0的mes清洗，去除剩余的活化剂，10mmpbs重新溶解微球，将活化好的荧光微球与ox-ldl单克隆抗体混合，抗体终浓度为120ug/ml，最终体积为2ml，室温下，充分搅拌反应2h，离心去除上清，然后用1％酪蛋白溶液2ml进行封闭反应1个小时，然后用缓冲液清洗、溶解定容至5ml，即得荧光微球标记的ox-ldl单克隆抗体。

e.荧光微球标记的f2-isop单克隆抗体

取粒径大小为300nm的荧光微球溶液0.5ml，用50mm，ph6.0的mes缓冲液2ml清洗去除微球溶液中的表面活性剂，然后50mm，ph6.0的mes缓冲液溶解微球至2ml，再用500ul10mg/ml活化剂edc和500ul50mg/ml稳定剂nhs进行活化，然后用50mm，ph6.0的mes清洗，去除剩余的活化剂，10mmpbs重新溶解微球，将活化好的荧光微球与f2-isop单克隆抗体混合，抗体终浓度为120ug/ml，最终体积为2ml，室温下，充分搅拌反应2h，离心去除上清，然后用1％酪蛋白溶液2ml进行封闭反应1个小时，然后用缓冲液清洗、溶解定容至5ml，即得荧光微球标记的f2-isop单克隆抗体。

(3)滤血膜：将滤血膜裁剪成10cm×4mm每条。

(4)包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜(nc膜)

a.包被hs-crp硝酸纤维素膜：将羊抗鼠igg抗体用50mm/lph7.2的pb缓冲液稀释到1.0mg/ml的浓度，0.8ul/cm的划线速率在nc膜上端c线标注位置划线得到质控线，将羊抗人hs-crp多克隆抗体用稀释包被液稀释至1.0mg/ml的浓度，0.8ul/cm的划线速率在nc膜上t线标注位置划线得到检测线，检测线和质控线间隔为5mm，划线完毕后置于37℃干燥8小时即得包被有检测线和质控线的nc膜。

b.包被mpo硝酸纤维素膜：将羊抗鼠igg抗体用50mm/lph7.2的pb缓冲液稀释到1.0mg/ml的浓度，0.8ul/cm的划线速率在nc膜上端c线标注位置划线得到质控线，将羊抗人mpo多克隆抗体用稀释包被液稀释至1.0mg/ml的浓度，0.8ul/cm的划线速率在nc膜上t线标注位置划线得到检测线，检测线和质控线间隔为5mm，划线完毕后置于37℃干燥8小时即得包被有检测线和质控线的nc膜。

c.包被lp-pla2硝酸纤维素膜：将羊抗鼠igg抗体用50mm/lph7.2的pb缓冲液稀释到1.0mg/ml的浓度，0.8ul/cm的划线速率在nc膜上端c线标注位置划线得到质控线，将羊抗人lp-pla2多克隆抗体用稀释包被液稀释至1.0mg/ml的浓度，0.8ul/cm的划线速率在nc膜上t线标注位置划线得到检测线，检测线和质控线间隔为5mm，划线完毕后置于37℃干燥8小时即得包被有检测线和质控线的nc膜。

d.包被ox-ldl硝酸纤维素膜：将羊抗鼠igg抗体用50mm/lph7.2的pb缓冲液稀释到1.0mg/ml的浓度，0.8ul/cm的划线速率在nc膜上端c线标注位置划线得到质控线，将羊抗人ox-ldl多克隆抗体用稀释包被液稀释至1.0mg/ml的浓度，0.8ul/cm的划线速率在nc膜上t线标注位置划线得到检测线，检测线和质控线间隔为5mm，划线完毕后置于37℃干燥8小时即得包被有检测线和质控线的nc膜。

e.包被f2-isop硝酸纤维素膜：将羊抗鼠igg抗体用50mm/lph7.2的pb缓冲液稀释到1.0mg/ml的浓度，0.8ul/cm的划线速率在nc膜上端c线标注位置划线得到质控线，将羊抗人f2-isop多克隆抗体用稀释包被液稀释至1.0mg/ml的浓度，0.8ul/cm的划线速率在nc膜上t线标注位置划线得到检测线，检测线和质控线间隔为5mm，划线完毕后置于37℃干燥8小时即得包被有检测线和质控线的nc膜。

(5)吸水纸：将吸水纸裁剪成30cm×2.7cm每条。

(6)组装：将步骤(1)所得样品垫、步骤(2)所得的结合垫、步骤(3)所得的滤血膜、步骤(4)所得的nc膜和步骤(5)所得吸水纸依次粘贴于pvc底板上，贴好后用切条机切成宽4mm的试纸条，并置于五联体扣卡内，加入干燥剂封装即得。