用于光束扫描显微光谱的设备和方法与流程

本发明总体上涉及显微光谱装置和方法的领域，其中，激发光束通过显微镜物镜位于样品上或在样品上移动，并且其中，收集通过样品上的散射和/或反射形成的光束，以进行光谱分析。

更具体地，本发明涉及激光束扫描拉曼(raman)显微光谱装置和方法。还涉及一种全内反射荧光显微镜装置和方法。

尤其从文献ep198332a中已知一种通过光束扫描探测样品的光谱成像方法和系统。更准确地说，文献ep1983332a描述了一种放置在共焦显微镜的管中的扫描装置，以便插入在显微镜物镜与拉曼光谱仪的注射抑制滤光器之间。扫描装置包括在激光束的光路上串联布置的双检流计镜。双检流计镜具有彼此正交的旋转轴，以在样品表面上沿正交方向成角度地移动激光束。双镜光学系统使得有可能成角度地移动激发激光束，以便将激发激光束定位在样品表面的不同点。通过光的反向返回，这种双镜光学系统可以收集拉曼反向散射光束，以便将其传输到包括拉曼光谱仪的检测系统。这种双检流计镜系统的优点在于激光源和检测系统保持固定。这种装置可以在大约十分钟内通过拉曼光谱法以大约50×50个点的分辨率获得样品表面的一部分的图像。

其他专利文献描述了光束扫描显微镜装置(例如，参见wo2010/069987、us2005/128476或jp2001/091848)。

文献wo2015/159035a1描述了另一种光束扫描或光束角运动显微装置和方法，包括至少一个第一镜和一个第二镜，它们串联布置在光源与显微镜物镜之间的光束的光路上，第一镜根据第一预定旋转角度倾斜，第二镜根据第二旋转角度倾斜，使得光束的轴围绕显微镜物镜光瞳的中心枢转。该系统可以增加样品上的光束扫描面积，而没有渐晕效应。通过光的反向返回，该系统可以收集大量拉曼流。然而，该系统需要在串联布置的第一镜于第二镜的倾斜之间进行同步，并且相对昂贵。

本发明的一个目的是提出一种激发激光束移动或扫描显微光谱装置和方法，其中，扫描系统简单且便宜，同时可以扫描样品上的空间和/或角度延伸区域。

本发明的另一目的是在不改变测量的空间分辨率或测量质量的情况下增大测量场的空间范围。

本发明的另一目的是提高拉曼或荧光显微光谱测量的质量。

本发明的另一目的是减少在样品的确定点或通过扫描样品区域获得的拉曼或荧光显微光谱测量的获取持续时间。

为了弥补现有技术的上述缺点，本发明提出了一种光束扫描显微光谱装置，包括：至少一个光源，适于发射激发光束；显微镜物镜，沿显微光谱装置的主光轴布置，该显微镜物镜具有物焦平面和像焦平面；系统，用于沿与光束光轴横向的两个空间方向x、y移动激发光束，该显微镜物镜和移动系统适于使激发光束在样品上移动；光学系统，适于收集通过激发光束在样品上的反射、散射和/或透射而形成的光束；以及光谱检测系统，光谱检测系统适于接收通过反射、散射和/或透射形成的光束。

更具体地，根据本发明提出了一种激发光束移动系统，该激发光束移动系统包括：第一聚焦光学部件，适于接收激发光束并且将该激发光束聚焦到中间焦平面中的焦点；另一聚焦光学部件，布置在中间焦平面与显微镜物镜之间的光束的光路上，该另一聚焦光学部件适于分别在显微镜物镜的物焦平面或像焦平面中形成中间焦平面的图像；以及单个的扫描镜，布置在第一聚焦光学部件与中间焦平面之间的激发光束的光路上，该扫描镜为平面并且安装在载物台上、可绕横向的两个旋转轴旋转，该两个旋转轴在扫描镜的平面内，该扫描镜适于在中间焦平面中沿两个横向方向移动焦点，以便使焦点的图像分别在显微镜物镜的物焦平面或者像焦平面中沿两个横向方向移动。

单独或根据所有技术上可能的组合，根据本发明的光束扫描显微光谱装置的其它非限制性和有利特征如下：

-第一聚焦光学部件是复曲面镜；

-第一复曲面镜聚焦光学部件适于减小中间焦平面中的几何光学像差；

-第一聚焦光学部件包括至少一个透镜；

-第一聚焦光学部件安装在导轨上，该导轨适于调节第一聚焦光学部件与显微镜物镜之间的距离；

-另一聚焦光学部件是球面镜、复曲面镜或透镜；

-另一聚焦光学部件安装在另一导轨上，该另一导轨适于调节另一聚焦光学部件与显微镜物镜之间的距离；

-扫描镜被布置以便接收入射角小于或等于15度的激发光束；

-该装置还包括第一平面偏转镜和/或另一平面偏转镜，分别地，该第一平面偏转镜布置在第一聚焦光学部件的上游和/或该另一平面偏转镜布置在另一聚焦光学部件与显微镜物镜之间；

-可旋转的载物台包括压电型或音圈型的双轴旋转致动器；

-所述至少一个光源包括激光源型和/或发光二极管型的一个或多个源；

-显微光谱装置包括布置在第一聚焦光学部件的上游的共焦孔径，以使入射在第一聚焦光学部件上的激发光束准直；

-光谱检测系统包括拉曼光谱仪、相干反斯托克斯拉曼光谱仪、荧光光谱仪、光致发光光谱仪、阴极发光光谱仪、高光谱相机、光谱滤波器或可调谐带通滤波器；

-光谱检测系统适于根据激发光束在样品上的移动，测量和分析通过反射、散射和/或透射形成的光束；

-显微镜物镜是全内反射物镜，并且其中，另一聚焦光学部件适于在全内反射物镜的物焦平面中形成中间焦平面的图像，以便使经准直的激发光束在像焦平面中成角度地移动、并且收集样品上的全内反射光束。

本发明还提出了一种光束扫描显微光谱，包括以下步骤：通过光源发射激发光束；朝向第一聚焦光学部件引导激发光束引导并且将激发光束反射到单个平面扫描镜上，以便在激发光束反射在扫描镜上之后，将激发光束聚焦到中间焦平面中的焦点，朝向另一聚焦光学部件引导激发光束，然后朝向显微镜物镜引导激发光束，以便分别在显微镜物镜的物焦平面中或者像焦平面中形成中间焦平面的图像，并且使扫描镜绕两个横向旋转轴倾斜，以在中间焦平面中沿两个横向方向移动焦点，以便使焦点的图像分别在显微镜物镜的物焦平面或者像焦平面中沿两个横向方向移动；收集通过激发光束的反射、散射和/或透射而形成的光束，并且在光谱检测系统上接收通过反射、散射和/或透射形成的光束。

根据本发明的激发光束移动系统和方法可以在显微镜物镜的前焦平面中定位和/或扫描激发光束的位置或倾斜。移动系统基于同一个扫描镜。该系统比基于至少两个串联设置的扫描镜的现有技术的系统更简单、更快、更便宜。此外，这种移动系统提供了一种替代解决方案，以解决光束扫描期间的光束渐晕问题。

本发明的系统和方法适用于通过反射、透射、后向或前向散射进行的光谱测量。

当然，本发明的不同特征、替代和实施例可以根据各种组合而彼此关联，只要它们彼此不兼容或彼此不排斥。

通过非限制性示例给出的与附图相关的以下描述将允许很好地理解本发明包括的内容以及实现本发明的方式。此外，本发明的各种其他特征从参照附图进行的附加描述中显现出来，这些附图说明了本发明的非限制性实施例，其中：

图1示意性地示出了根据本发明第一实施例的光束扫描系统；

图2示意性地示出了安装在载物台上的绕两个横向旋转轴可旋转的平面镜；

图3示出了显微镜物镜的像焦平面中的光束扫描的示例；

图4示出了显微镜物镜的物焦平面中的光束扫描的另一示例；

图5示出了第一实施例的替代方案，其中，光束扫描系统用于透射测量；

图6示出了第一实施例的另一替代方案，其中，光束扫描系统与用于透射光谱测量的光谱仪相结合；

图7示出了第一实施例的又一替代方案，其中，光束扫描系统与用于透射测量的二维传感器相结合；

图8示出了第一实施例的又一替代方案，其中，光束扫描系统用于入射光束和透射光束。

应当注意，在这些图中，不同替代方案共有的结构和/或功能元件可以用相同的附图标记表示。

在图1中，示出了光束扫描系统100，该光束扫描系统100旨在插入在光源1与显微镜物镜5之间。

显示了(xyz)正交参考系统。图2的平面是(yz)平面。

作为非限制性示例，显微镜是共焦型，并且包括共焦孔径43。共焦孔径43布置在与显微镜物镜5的焦平面共轭的平面上。例如，共焦孔径43布置在透镜42的焦点处的平面中。

本文的扫描系统包括第一偏转镜m0、第一聚焦镜m1、扫描镜m2、第二聚焦镜m3和第二偏转镜m4。

偏转镜m0和偏转镜m4是平面镜。偏转镜m0和偏转镜m4仅用于在保持激发光束10与显微镜物镜5之间的沿显微镜的主光轴11的光学对准的同时，折叠激发光束。

有利的是，图1的光束扫描系统100在光阑2与显微镜物镜5之间形成了能够插入出显微镜的共焦部分和/或从显微镜的共焦部分移出的可选模块。激发光束10被准直并沿平行于z轴的方向传播。特别有利的是，将可选模块插入显微镜的共焦部分或从共焦部分移除不会修改共焦显微镜的光学调节。可选模块可以根据需要插入或移除，而无需修改光源1、共焦孔径43和物镜5的光学对准。

第一偏转镜m0接收经准直的激发光束10，并将该激发光束10向第一聚焦镜m1反射。举例来说，第一偏转镜m0具有至少15mm×15mm的尺寸和6mm的厚度。

有利的是，第一偏转镜m0通过接近镜m0正面上的调节螺钉安装在传统的点-线-面支架上。为了进行微调，在两个旋转轴(例如，一个旋转轴平行于x轴，并且另一旋转轴垂直于x轴)上，+/-1度的调节范围就足够了。有利的是，第一偏转镜m0可沿偏转镜m0的法线在+/-1mm的深度上调节位置。激发光束10相对于m0镜的法线的入射角优选在51度与57度之间的范围内可调(例如，大约54度的值)。在偏转镜m0上反射之后，激发光束10沿光轴110传播。

第一聚焦镜m1优选为复曲面镜或环形镜。第一聚焦镜m1具有绕z轴的第一曲率半径r1和绕x轴的第二曲率半径r2。第一聚焦镜m1例如为矩形，该第一聚焦镜m1的尺寸至少为15mm×10mm、厚度为6mm。激发光束10相对于第一聚焦镜m1的法线的入射角约为11度。第一聚焦镜m1实际上将激发光束10聚焦到与光轴垂直布置的中间焦平面20中的焦点上。此外，计算第一聚焦镜m1的复曲面形状，并从而校正由镜m1和镜m3引起的在焦平面6中的球面像差。

有利的是，第一聚焦镜m1可以通过接近镜m1后部的调节螺钉安装在传统的点-线-面支架上。为了进行微调，在两个旋转轴(例如，一个旋转轴平行于x轴，并且另一旋转轴垂直于x轴)上+/-1度的调节范围就足够了。有利的是，沿镜的法线的+/-1.5mm深度的微调也是可用的。此外，期望镜m1的旋转是可用的，以便粗略地和/或精细地将激发光束在镜m1上的入射角调节到相对于光轴110在大约8度到14度范围内的值。

根据替代方案，第一聚焦镜m1安装到平移导轨31，该平移导轨31根据与光轴11垂直的轴(在yz平面中)(换言之，沿y轴定向)定向。第一聚焦镜m1在该导轨31上的移动使得可以调节第一聚焦镜m1与显微镜的主光轴11之间的距离。作为非限制性示例，镜m1的深度的粗略调节可以将第一聚焦镜m1的位置调节到离显微镜的主光轴11大约50mm(-17mm/+33mm)的距离。

单个扫描镜m2布置在第一聚焦镜m1与中间焦平面20之间的激发光束10的光路上。

因此，第一聚焦镜m1接收经准直的激发光束10，并且在将激发光束10聚焦到中间焦平面20中的焦点21的同时，将该激发光束10向扫描镜m2反射。

图2示出了安装在载物台32上的具有两个横向旋转轴325、326的扫描镜m2的示例。扫描镜m2是平面镜。两个旋转轴325、326在扫描镜m2的平面内。例如，一个旋转轴325平行于x轴，并且另一旋转轴326近似平行于z轴。致动器321、致动器322、致动器323、致动器324使镜m2可以绕旋转轴325和/或326旋转。根据优选实施例，致动器321、致动器322、致动器323、致动器324是压电型或音圈型的致动器。

激发光束10在扫描镜m2上的入射角优选小于或等于15度(例如，大约8度)。

镜m2绕平行于x轴的旋转轴325的旋转实际上使中间焦平面20中的焦点21横向于x轴朝向另一焦点22、23、24或25移动。在第一近似中，焦点21、焦点22、焦点23、焦点24和焦点25位于中间焦平面20中。类似地，镜m2绕平行于z轴的旋转轴326的旋转实际上使中间焦平面20中的焦点21横向于z轴移动。这样，扫描镜m2可以沿与中间焦平面横向的两个方向移动该中间焦平面20中的焦点21。第一聚焦镜m1适于校正由镜m1和镜m3引起的球面像差。

在图1所示的示例中，当镜m2将光束聚焦到焦点21时，入射光束沿光轴111传播。类似地，当镜m2将光束分别聚焦到焦点22、焦点23、焦点24或焦点25时，入射光束分别沿光轴112、光轴113、光轴114或光轴115传播。

在镜m2的扫描期间中，绕每个旋转轴的旋转幅度约为6度。

第二聚焦镜m3优选为球面镜。在图1所示的示例中，第二聚焦镜m3具有300mm的曲率半径。根据显微镜物镜5的孔径和镜m2的扫描范围来确定第二聚焦镜m3的位置和尺寸，以限制光束在镜m3的边缘上的渐晕效应。激发光束10相对于第二聚焦镜m3的法线的入射角约为6度。第二聚焦镜m3可以收集由扫描镜m2反射的入射光束，而不管在扫描镜m2的扫描期间焦点在中间焦平面中的位置如何。第二聚焦镜m3将入射光束向第二偏转镜m4和/或显微镜物镜5反射。作为替代，第二聚焦镜m3是复曲面镜。在这种情况下，镜m1校正一部分光学像差，并且第二聚焦镜m3适于校正另一部分光学像差。

有利的是，第二聚焦镜m3可以通过接近镜m3后部的调节螺钉安装在传统的点-线-面支架上。为了进行微调，在两个旋转轴(例如，一个旋转轴平行于x轴，并且另一旋转轴垂直于x轴)上+/-1度的调节范围就足够了。有利的是，深度+/-1.5mm的微调也是可用的。此外，期望镜m3的旋转是可用的，以便粗略地和/或精细地将激发光束在镜m3上的入射角调节到相对于光轴110在大约5.75度至7.5度范围内的值。

根据替代方案，第二聚焦镜m3安装在平移导轨33上。第二聚焦镜m3在该导轨33上的移动使得可以调节第二聚焦镜m3与显微镜的主光轴11之间的距离。作为非限制性示例，镜m3的深度的粗略调节可以将第二聚焦镜m3的位置调节到距显微镜的主光轴11大约50mm的距离。

第二聚焦镜m3接收聚焦到中间焦平面的点21、点22、点23、点24或点25的入射光束，并且将该光束向第二偏转镜m4反射，或者在不使用偏转镜m4的情况下直接向显微镜物镜5反射。

第二聚焦镜m3可以将扫描镜m2的图像带回显微镜物镜5的光瞳。因此，当扫描镜m2的方向变化时，第二聚焦镜m3限制了显微镜物镜5的渐晕效应。

在图1所示的示例中，第二偏转镜m4接收激发光束并且将该激发光束向显微镜物镜5反射。举例来说，第二偏转镜m4具有30mm×45mm的矩形形状和6mm的厚度。

有利的是，第二偏转镜m4可以通过接近镜m4正面上的调节螺钉安装在传统的点-线-面支架上。为了进行微调，在两个旋转轴(例如，一个旋转轴平行于x轴，并且另一旋转轴垂直于x轴)上+/-1度的调节范围就足够了。有利的是，第二偏转镜m4可沿偏转镜m4的法线在+/-1mm的深度上调节位置。根据偏转镜m4与显微镜物镜5之间的距离，激发光束相对于镜m4的法线的入射角作为镜m2的扫描的函数在几度的范围内可变。在第二偏转镜m4上的反射之后，根据作为扫描镜m2的倾斜角，相对于显微镜物镜5的主光轴11以可变角度传播激发光束。

在图1和图3所示的第一实施例中，第二聚焦镜m3布置在距中间焦平面20预定距离处，以接收聚焦在中间焦平面的点21、点22、点23、点24或点25处的入射光束，并形成经准直的光束。因此，显微镜物镜5根据镜m2绕一个或两个旋转轴的扫描，接收具有可变倾斜度的经准直的光束，该可变倾斜度作为相对于绕与横向于显微镜物镜的光轴11的一个或两个旋转轴的镜m2的扫描的函数。第二聚焦镜m3准直来自中间焦平面20的一个点的光束。第二偏转镜将经准直的光束向显微镜物镜5反射。因此，在显微镜物镜5的物镜焦点51处，入射光束保持准直(见图3)。物焦平面51也被称为后焦平面。显微镜物镜5将入射光束10聚焦到显微镜物镜5的像焦平面52的点62。像焦平面52也被称为前焦平面。因此，扫描镜m2的角度倾斜使得可以沿x和/或y方向移动显微镜物镜5的像焦平面52中的点62。因此，可以通过改变单个扫描镜m2的倾斜度来扫描显微镜的像焦平面52的一区域，其他镜m0、m1、m2和m3保持固定。

在第一实施例中，第一聚焦镜m1和第二聚焦镜m3形成无焦光学系统。

简而言之，在第一实施例中，激发光束移动系统100可以沿横向于显微镜物镜的光轴11的两个空间方向(x、y)移动前焦平面52中的焦点62。

入射光束10可以用作激发光束，通过背散射、透射或反射产生光束。

一个特别有趣的应用涉及荧光或拉曼散射。在这种情况下，光源1有利地是激光源。

在拉曼背散射测量的配置中，显微镜物镜5收集由激发光束10在样品6的点62处的背散射或反射形成的背散射或反射光束30。收集到的光束30通过在镜m4、m3、m2、m1和m0上的连续反射跟随激发光束的反向路径。半反射板或二向色板类型的光学部件41可以将激发光束10与背散射或反射光束30分开。在共焦显微镜的情况下，收集到的光束30穿过共焦孔径43。

光学部件(例如，透镜42)将背散射或反射光束30聚焦在光谱仪44的输入狭缝上。

因此，光束扫描系统100可以将共焦显微镜转换成光束扫描荧光或拉曼显微镜，而无需修改共焦显微镜的光学调节。

在第一实施例的其它应用中，如图5至图8所示，透射测量与上述相同的激发光束移动系统100结合执行。在图5至图8中未示出布置在激发光束10的光路上的光束扫描系统100。

根据第一替代方案，如图5所示，另一物镜15用于收集透射光束70。移动系统100可以沿横向于显微镜物镜的光轴11的两个方向移动该显微镜物镜的前焦平面52中的焦点62。在该替代方案中，另一物镜15仅收集来自光轴11上的物镜15的视场中心的点60的信号，而不管激发点的位置，换言之，不管焦点62的(x、y)位置。物镜15将透射光束70聚焦在光谱仪44上或直接聚焦在检测器上。

该第一替代方案的应用例如可以测量光束在平面波导中的传播。为此，将波导放置在样品6的平面中，在远离光轴的激发点62处激发波导的一端，并且通过在位于光轴11上的波导的另一端处的传输来收集信号。

该第一替代方案的另一应用包括通过快速扫描样品表面和收集透射光束70的完整性，来测量在物镜5的视场中的整个透射光束70，以便在样品的整个体积或整个表面上集成信息。

根据第二替代方案，如图6所示，另一物镜15用于收集来自任何焦点62的透射光束72。在该第二替代方案的应用的具体示例中，激发点62在样品平面中沿单一方向(例如，x或y)移动，并且根据激发点62沿扫描方向的位置，沿光谱仪44的输入槽的长度收集透射光束72。

根据第三替代方案，如图7所示，另一物镜15用于收集来自激发点62的透射光束72，并且在二维矩阵传感器45上形成透射光束72的图像。通过在xy平面中移动样品上的激发点62，因此，根据激发点62，通过透射形成样品的图像。该替代方案尤其适用于共焦显微镜强度测量，例如，通过在每个点对样品进行透射测量，或者使用高光谱相机进行超光谱显微镜测量。为了获得光谱信息，建议添加一个滤波器，以便选择特定的光谱带。该滤波器可以具有固定的光谱带，并被另一滤波器代替，以改变光谱范围。作为替代方案，滤波器是可调谐带通滤波器。

根据第四替代方案，如图8所示，使用第二光束扫描系统102，该第二光束扫描系统102布置在透射光束72的光路上，该透射光束72在此由另一物镜15准直。第二光束扫描系统102包括光学部件m4、光学部件m3、光学部件m2、光学部件m1和光学部件m0(与布置在激发光束10的光路上的光束扫描系统100的光学部件类似)。此外，两个光束扫描系统100和102的两个扫描镜m2同步。在第二光束扫描系统102的输出端，透射光束80具有固定的方向，而不管激发点62在样品的xy平面中的位置如何。透射光束80然后被发送到光谱仪或检测器上。

在图4所示的第二实施例中，第二聚焦镜m3布置在距中间焦平面20预定距离处，以便接收聚焦在中间焦平面20的一个点21、点22、点23、点24或点25处的激发光束10，并形成聚焦在显微镜物镜5的物焦平面51中的一个点61处的光束。绕扫描镜m2的两个旋转轴的可变倾斜度可以修改物焦平面51中的点61的xy位置。因此，显微镜物镜5接收聚焦光束，并在像焦平面52中形成经准直的光束，该经准直的光束具有可变倾斜度，以作为镜m2绕横向于显微镜物镜的光轴11的一个或两个旋转轴的扫描的函数。换言之，第二聚焦镜m3使中间焦平面20的图像形成在显微镜物镜5的物焦平面51中。第二偏转镜m4将经准直的光束向显微镜物镜5反射。因此，在显微镜物镜5的物焦平面51中，入射光束聚焦(见图4)。显微镜物镜5将入射光束10准直在显微镜物镜5的像焦平面52中。因此，扫描镜m2的角度倾斜可以调节和/或修改显微镜物镜5的像焦平面52中的激发光束10相对于横向于主光轴11的两个旋转轴的倾斜角α。

因此，可以通过调节单个扫描镜m2的倾斜度来调节显微镜的像焦平面52中的激发光束的倾斜角α，其他的镜m0、镜m1、镜m2和镜m3保持固定。显微镜物镜5收集在样品6上反射或背散射的光束30。

在第二实施例中，第一聚焦镜m1、第二聚焦镜m3和显微镜物镜5形成无焦光学系统。

在第二实施例中，激发光束移动系统100可以绕横向于显微镜物镜的光轴11的两个旋转轴来调节或扫描前焦平面52中的经准直的激发光束的倾斜角α。

在该第二实施例中，物镜5输出端的光束直径主要取决于光束扫描系统100输入端的光束直径(例如，4mm)、镜m3与中间焦平面20之间的距离(例如，大约200mm)以及物镜放大率(例如，100倍)。在该示例中，物镜5输出端的光束直径约为20m，这决定了xy横向空间分辨率。另一方面，这允许了针对tirf或tirr模式的沿z轴的极轴向分辨率。

在第二实施例的应用中，显微镜物镜5是全内反射荧光(tirf)物镜。与第一实施例类似，显微镜因此适于以确定的入射角α在样品6中执行全内反射荧光测量。在另一应用中，显微镜物镜5是全内反射拉曼(tirr)物镜。因此，为了获得全内反射，显微镜适于根据样品光学指数，以确定的入射角α在样品6中进行全内反射拉曼光谱测量。

根据另一替代方案，以这样的方式控制扫描镜m2的倾斜，以便在显微镜的像焦平面52中调节或扫描激发光束的倾斜角α，其他的镜m0、镜m1、镜m2和镜m3保持固定。在另一应用中，显微镜物镜5收集反射在样品6上的光束。因此，显微镜适于在根据显微镜物镜5的数值孔径确定的角度范围内，以确定的入射角α或根据在显微镜物镜5的数值孔径确定的角度范围内根据入射角α进行椭圆测量。例如，对于具有大约0.95的数值孔径的显微镜物镜5，角度α的角度范围从大约0度延伸到72度。有利的是，在椭圆偏振测量应用中，光源1从单色或多色光源当中选择以用于以一个或若干个确定的波长进行测量，或者从宽光谱光源当中选择以用于光谱测量。

根据具体实施例，可以省略偏转镜m0和/或偏转镜m4。在这种情况下，入射光束的光轴通常被由第一聚焦镜m1、扫描镜m2和第二聚焦镜m3形成的光学系统偏离。

根据上述实施例中任一个的替代方案，第一聚焦镜m1由第一基于透镜的聚焦光学系统l1代替。特别有利的是，第一基于透镜的聚焦光学系统l1优选地对中间焦平面20中的球面像差进行校正。

作为替代或补充，第二聚焦镜m3布置在扫描镜m2与显微镜物镜5之间的第二基于透镜的聚焦光学系统l3代替。第二基于透镜的聚焦光学系统l3可以与镜m1或基于透镜的光学系统l1结合使用。

与根据第一实施例的显微镜物镜5结合的移动系统100可以用于将测量点62定位到前焦平面的确定点，例如，样品6上。激发光束形成光点62，该光点62适于根据扫描镜m2绕一个或两个旋转轴的倾斜而移动并精确定位在显微镜物镜的前焦平面中。此外，通过光的反向返回，移动系统100适于反射或反向散射信号的共焦收集。

根据包括粒子探测器系统的具体实施例，例如，基于图像捕获和处理系统，样品表面上的一个或几个粒子的位置被预先定位，并且测量点62自动定位在每个粒子上，以便逐个测量。

在所谓的微斑点应用中，根据扫描镜m2的一系列可变倾斜角(根据一个或两个方向)，对测量点62的不同位置进行样品的映射，具有空间微观分辨率。在本应用中，在两次连续运动之间进行每次测量。因此，扫描镜的控制需要多次启动和停止，这意味着相对较高的总获取持续时间。

移动系统100还适于在样品上斑点的连续或几乎连续移动期间，在一系列预定时间执行一系列测量，以限制两次连续测量之间的下降时间。这种飞行测量方法(或swift模式)可以比使用微斑点模式更快获得空间分辨测量。

在另一所谓的宏观斑点应用中，在样品上斑点62移动期间检测到的信号以这样的方式集成，以便在比激光斑点62更大尺寸的表面上获得空间平均测量。宏观斑点的形状可以是预定的，例如，圆盘形、环形、正方形、矩形，或者适合于所考虑的对象的形状，例如，由成像系统检测的生物形式。

根据另一替代方案，通过沿样品上的一条线移动测量点62来获得一系列测量，并且在光谱仪44的输入槽的纵向方向上形成该线的图像。光谱仪配备有二维相机类型的传感器，因此可以非常快速地获得沿样品上的一条线的一系列光谱。

与根据第二实施例的显微镜物镜5结合的移动系统100适于在前焦平面中以预定入射角α用准直激发光束照射样品。特别有利的是，相同的显微镜物镜5和移动系统100用于收集由激发光束反射在样品上而形成的光束，反射光束相对于显微镜物镜的光轴11形成与角度α对称的角度。根据第二实施例的移动系统100应用于全内反射荧光(tirf)显微光谱测定法或全内反射拉曼(tirr)显微光谱测定法或椭圆偏振法中。

根据第二实施例的移动系统100还适于以可变入射角α用经准直的激发光束照射样品，以便确定入射角α，从而可以获得tirf、tirr或椭圆偏振类型的测量的最大灵敏度。

当然，在所附权利要求的框架内，可以对本发明进行各种其他修改。