作为牙龈炎诊断物的中性粒细胞失调的生物标志物的制作方法

作为牙龈炎诊断物的中性粒细胞失调的生物标志物


背景技术：

1.牙龈(gum/gingiva)是口部软组织衬里的一部分，围绕牙齿并在牙齿周围提供密封。牙龈缘是龈沟上皮和口腔上皮之间的界面。这一界面存在于牙龈最冠状点处，也称为边缘牙龈的冠部。牙龈沟，也称为龈沟，是位于未附着的牙龈组织的壁与牙釉质和/或牙骨质之间的围绕牙齿的空间。
2.牙龈炎是作为牙龈疾病初始阶段的牙龈炎症。牙龈炎的直接原因是牙菌斑
‑
在牙齿和牙龈上持续形成的细菌的柔软、粘性、无色膜。如果不通过日常刷牙和用牙线洁牙去除牙菌斑，则其产生可刺激牙龈组织的毒素，从而引起牙龈炎。在牙龈疾病的这一早期阶段，损伤可以逆转，因为将牙齿固持在适当位置的骨和结缔组织尚未受到影响。在未经治疗的情况下，牙龈炎可成为牙龈疾病的晚期，即牙周炎，并对牙齿和下颌造成永久损伤。
3.健康的牙龈紧实，呈淡粉色，紧紧地贴合在牙齿周围。起初，通过目视检查可能无法检测出牙龈炎，但随着其进展，症状变得更加明显。牙龈炎的典型体征和症状包括当刷牙或用牙线洁牙时可能出血的红色、肿胀、触痛性牙龈。牙龈疾病的另一体征是牙龈已从牙齿退缩或拉开，给予牙齿细长外观。牙龈疾病可导致在牙齿与牙龈之间形成凹穴，其中牙菌斑和食物残渣聚集。即使疾病未进展，一些人也可能经历口中复发口臭或不良味道。
4.与牙周炎相比，牙龈炎更容易治疗，并且可以用良好的口腔卫生来解决，如更长时间且更频繁的刷牙、用牙线洁牙和使用抗菌漱口水。牙龈炎越早得到治疗，永久性损伤的机会就越少。因此，在牙龈炎的早期阶段诊断牙龈炎的方法允许在病状进展之前起始治疗。此类方法还可适于随时间推移监测口腔健康和治疗。


技术实现要素：

5.已鉴别出指示与牙龈炎相关的中性粒细胞失调的生物标志物。提供了诊断牙龈炎的方法、监测口腔健康和对牙龈炎的治疗的反应的方法、鉴别和评估调节与牙龈炎相关的中性粒细胞失调并且适用于治疗牙龈炎的化合物和组合物的方法，其中测量生物标志物水平。
附图说明
6.图1在条形图中并排显示从实例1测量的趋化因子的对照和测试数据。
7.图2显示来自实例1的对照(健康)侧和测试(牙龈炎)侧的mif水平对天。
8.图3显示来自实例1的对照(健康)侧和测试(牙龈炎)侧的mip1a水平对天。
9.图4显示在实例1中研究每个时间点，来自对照(健康)侧和测试(牙龈炎)侧的mif/mip1a比率。
具体实施方式
10.牙龈沟液(gcf)是可在牙龈缘处或牙龈沟内收集的炎性渗出物。本文提及的方法涉及流体的生物化学分析，作为评定口腔健康，诊断患有早期牙龈炎的个体中的牙龈炎，确
认对疑似患有牙龈炎的个体的诊断，监测个体的口腔健康，和监测针对牙龈炎进行治疗个体中对治疗的反应的非侵入性手段。
11.牙龈炎的早期检测允许在症状出现和损伤发生之前进行治疗和消退。本文所提供的方法提供主动地维持良好的牙龈健康并且更有效地最小化并解决牙龈问题的工具。所述方法由此适用于努力控制炎症并维持健康的粉红色无痛口腔。本文中的方法是适用于安定发炎牙龈并且有助于努力实现积极、健康的生活方式的整体口腔健康工具套件的一部分。
12.趋化因子mif、mip1a、cxcl1、cxcl5、cxcl8、cxcl2和cxcl6等等存在于个体的牙龈沟液中。中性粒细胞是牙龈组织中的主要防御细胞。患有牙龈炎的个体，即使在病状的极早期阶段，也经历中性粒细胞募集到包括牙龈沟的受影响区域。随着中性粒细胞的存在增加，存在局部环境的变化，如存在的这些趋化因子的量的变化。
13.牙菌斑形成的区域中的趋化因子水平可在人与人之间极大地变化。也就是说，存在人与人之间的蛋白质产生的宽基线，无论此人是具有健康牙龈还是患有牙龈炎。因此，基线变化将趋化因子水平用作诊断物是困难的，因为无法准确地建立指示健康牙龈的量范围和指示牙龈炎的量范围。
14.已开发通过替代地采用趋化因子比率来消除基线问题的鉴别并监测牙龈炎的方法。使用比率使由基线差异引起的问题最小化。不管基线如何，牙龈沟液中趋化因子mif水平的显著提高，联合趋化因子mip
‑
1a、cxcl1、cxcl5、cxcl8、cxcl2和cxcl6的水平的广泛降低是牙龈炎的特征。因此，通过使用趋化因子的模式化作为牙龈炎的诊断指示物，在牙龈沟液中评定中性粒细胞趋化因子失调作为牙龈炎的量度。也就是说，gcf中mif水平的提高和mip
‑
1a、cxcl1、cxcl5、cxcl8、cxcl2和cxcl6水平的降低提供了基于mif∶mip
‑
1a、mif∶cxcl1、mif∶cxcl5、mif∶cxcl8、mif∶cxcl2和mif∶cxcl6的比率的诊断机会，其中比率提高指示牙龈炎。
15.本文所提供的方法包括定量牙龈沟中的趋化因子水平，包括mif和一种或多种选自组mip
‑
1a、cxcl1、cxcl5、cxcl8、cxcl2和cxcl6的另外的趋化因子，并计算比率mif∶mip
‑
1a、mif∶cxcl1、mif∶cxcl5、mif∶cxcl8、mif∶cxcl2和mif∶cxcl6中的一种或多种。
16.gcf中的趋化因子可使用从个体获得的gcf样品来定量。存在三种收集gcf的广泛实践的方法。最常用的gcf收集方法用专门设计的吸收性滤纸作为根管纸针(endodontic paper point)或龈沟液取样纸条(periopaper)来进行。将根管纸针或龈沟液取样纸条插入牙龈沟中，并原位静置5到60秒，通常30秒，以允许gcf由纸吸附。gcf在生理盐水中从根管纸针或龈沟液取样纸条洗脱。另一种gcf收集方法，即牙龈洗涤技术，由用等渗溶液灌注gcf作为固定体积的汉克氏平衡溶液(hank
′
s balanced solution)组成。收集的流体表示含有细胞和呈血浆蛋白形式的可溶性组分牙龈沟液的稀释液。第三种gcf收集方法是将具有特定直径的毛细管插入牙龈沟的入口中，并且流体通过毛细管作用迁移到管中。可评估收集的gcf的中性粒细胞趋化因子失调，其指示牙龈炎。
17.可以使用可商购的试剂盒分析收集的gcf以测量mif以及mip
‑
1a、cxcl1、cxcl5、cxcl8、cxcl2和cxcl6中的一种或多种的量。此类试剂盒的实例来自的flowcytomix
tm
试剂盒(原bender流式细胞术，非磁珠)、来自invitrogen
tm
的人细胞因子组(非磁珠)、来自的bio
‑
plex pro
tm x
‑
plex定制分析(磁珠)和(iv)来自millipore
tm
的试剂盒(磁
珠)。可使用具有来自invitrogen
tm
的磁珠知bd
tm
流式微珠阵列(cytometric bead array；cba)人增强灵敏度试剂盒(流式细胞术，非磁珠)的多重试剂盒。
18.对样品中的mif水平进行定量。另外，对一种或多种选自由以下组成的组的另外的趋化因子的水平进行定量：mip1a、cxcl1、cxcl5、cxcl8、cxcl2和cxcl6。在一些实施例中，对mif水平进行定量，并且还对选自由以下组成的组的一种另外的趋化因子进行定量：mip1a、cxcl1、cxcl5、cxcl8、cxcl2和cxcl6。在一些实施例中，对mif水平进行定量，并且还对选自由以下组成的组的两种、三种、四种、五种或六种另外的趋化因子进行定量：mip1a、cxcl1、cxcl5、cxcl8、cxcl2和cxcl6。对mif和另外的趋化因子的以下组合进行定量并计算比率：
19.表1：mif加一到六种另外的趋化因子的组合
20.[0021][0022]
与健康个体中相比，在患有牙龈炎的个体中，牙龈沟液中比率mif∶mip1a、mif∶cxcl1；mif∶cxcl5；mif∶cxcl8；mif∶cxcl2；和mif∶cxcl6更高，因为mif的水平提高和mip1a、cxcl1、cxcl5、cxcl8、cxcl2和cxcl6的水平降低是牙龈炎的特征。
[0023]
在一些实施例中，所述方法包含对mif和mip1a进行定量。在一些实施例中，计算mif与mip1a的比率(mif∶mip1a)，并且如果mif∶mip1a比率高于5000，并且mif水平高于10,000且mip1a低于10，则指示牙龈炎。另一方面，如果mif∶mip1a比率高于5000，且mif等于或小于10,000且mip1a等于或小于10，则指示健康状况。
[0024]
一些实施例涉及治疗已鉴别为患有牙龈炎的个体的方法。治疗方法可包含鉴别个体，并且然后治疗个体的牙龈炎。可通过从个体获得牙龈沟液的样品并且评估样品中存在的趋化因子比率来鉴别个体。mif与一种或多种另外的趋化因子一起定量，并且计算一种或多种mif与另外的趋化因子的比率。一种或多种另外的趋化因子选自由以下组成的组：mip1a、cxcl1、cxcl5、cxcl8、cxcl2和cxcl6；并且mif与另外的趋化因子的一种或多种比率选自由以下组成的组：mif∶mip1a、mif∶cxcl1；mif∶cxcl5；mif∶cxcl8；mif∶cxcl2；和mif∶cxcl6。在一些实施例中，将一种或多种计算出的mif与另外的趋化因子比率与健康参考比
率进行比较。健康参考比率是计算的比率中相同趋化因子的比率。健康参考比率表示未患有牙龈炎的个体的比率。如果计算的比率大于健康参考比率，则将个体鉴别为患有牙龈炎。在一些实施例中，将一种或多种计算出的mif与另外的趋化因子的比率与牙龈炎参考比率进行比较。牙龈炎参考比率是计算的比率中相同趋化因子的比率。牙龈炎参考比率表示患有牙龈炎的个体的比率。如果计算的比率小于牙龈炎参考比率，则将个体鉴别为未患有牙龈炎。在一些实施例中，对mif和mip1a进行定量，并且计算mif∶mip1a比率。如果mif∶mip1a比率高于5000，且mif水平高于10,000且mip1a低于10，则将个体鉴别为患有牙龈炎。如果mif∶mip1a比率高于5000，且mif等于或小于10,000且mip1a等于或小于10，则将个体鉴别为未患有牙龈炎。可治疗被鉴别为患有牙龈炎的个体以解决牙龈炎。在一些实施例中，通过向个体的口腔施用口腔护理组合物来治疗被鉴别为患有牙龈炎的个体，所述口腔护理组合物包含一种或多种选自由以下组成的组的成分：精氨酸、磷酸锌、氧化锌、柠檬酸锌、三氯生、二葡糖酸氯己定、百里酚、薄荷醇、桉树醇、水杨酸甲酯、生理盐水、抗生素和氟化物。在一些实施例中，所述方法包含通过对样品中的两种、三种、四种、五种或六种另外的趋化因子进行定量，并计算两种、三种、四种、五种或六种mif与另外的趋化因子的比率，将个体鉴别为患有牙龈炎。在一些实施例中，使用流式微珠阵列、流式细胞术或elisa斑点分析来对mif和另外的趋化因子进行定量。
[0025]
一些实施例涉及监测个体对治疗的反应的方法。所述方法包含在第一时间点，从个体获得牙龈沟液的样品，并评估样品中存在的趋化因子比率。然后，在一段时间之后，在第二时间点，从个体获得牙龈沟液的样品，并评估样品中存在的趋化因子比率。将来自第一时间点的结果与来自第二时间点的结果进行比较。在一些实施例中，在第一与第二时间点之间的时间段内治疗个体的牙龈炎。在一些实施例中，在第一时间点和第二时间点来自个体的牙龈沟液的样品。在一些实施例中，在第一时间点和两个或更多个子序列时间点来自个体的牙龈沟液的样品。第一时间点样品、第二时间点样品和任何其它后续时间点样品中存在的趋化因子比率各自进行评估，其中对于每个时间点，将mif与一种或多种另外的趋化因子一起定量，并且计算一种或多种mif与另外的趋化因子的比率。一种或多种另外的趋化因子选自由以下组成的组：mip1a、cxcl1、cxcl5、cxcl8、cxcl2和cxcl6；并且mif与另外的趋化因子的一种或多种比率选自由以下组成的组：mif∶mipla、mif∶cxcl1；mif∶cxcl5；mif∶cxcl8；mif∶cxcl2；和mif∶cxcl6。在一些实施例中，对mif和mip1a进行定量，并且计算mif∶mip1a比率。可治疗被鉴别为患有牙龈炎的个体以解决牙龈炎。在一些实施例中，对于每个时间点，所述方法包含对样品中的另外两种、三种、四种、五种或六种趋化因子进行定量，并计算一种、两种、三种、四种、五种或六种mif与另外的趋化因子的比率。在一些实施例中，使用流式微珠阵列、流式细胞术或elisa斑点分析来对mif和另外的趋化因子进行定量。在一些实施例中，在时间点之间通过向个体的口腔施用口腔护理组合物来治疗个体的牙龈炎，所述口腔护理组合物包含一种或多种选自由以下组成的组的成分：精氨酸、磷酸锌、氧化锌、柠檬酸锌、三氯生、二葡糖酸氯己定、百里酚、薄荷醇、桉树醇、水杨酸甲酯、生理盐水、抗生素和氟化物。从先前时间点的结果到在稍后时间点的结果，mif与其它趋化因子的比率的降低指示个体正在变化到更健康的状态，并且牙龈炎正在得到解决。
[0026]
实例
[0027]
实例1
[0028]
在21天的口腔卫生禁制(abstinence)后，在人研究受试者中成功地诱导了牙龈炎，如由牙龈炎症参数的显著增加所证明。趋化因子分析显示，仅巨噬细胞抑制因子(mif)在研究的诱导阶段期间显著增加，而中性粒细胞趋化因子mip
‑
1a、cxcl1、cxcl5、cxcl8、cxcl2和cxcl6在牙龈炎诱导后最初或在整个牙龈炎诱导阶段期间减少。数据证明，在牙龈炎发作后发生宿主稳态的显著变化，其中大部分反应是对中性粒细胞的宿主趋化性因子的抑制。
[0029]
实验程序：
[0030]
以分开口腔设计采用实验性牙龈炎的支架诱导生物膜过度生长模型，以使21名患者经历21天诱导的牙龈炎实验。每个人都充当自己的对照，并且在卫生实施(清除和消退)期间使用标准氟化物洁齿剂。牙龈沟液(gcf)、牙菌斑和唾液在实验性牙龈炎清除(第
‑
14天)前、在基线(第0天)并且在测试第四天(第4天)、第七天(第7天)、第十四天(第14天)和第21天(第21天)时进行采样，且第二十八天(第28天)和第三十五天(第35天)经采样以分析消退因子。对于gcf样品采集，首先将待采样部位用棉卷分离并轻轻风干。将纸条(龈沟液取样纸条；oraflow inc.，美国纽约州史密斯敦(smithtown，new york，usa))或纸针(iso 30)(dentsply
‑
de
‑
trey gmbh，德国康斯坦茨(konstanz，germany))轻轻地放入凹穴内30秒，直到感觉到最小的阻力。将样品在4℃下洗脱过夜到500μl磷酸盐缓冲生理盐水(pbs)中。在以400g离心4min后，移出纸针/条；将两个纸针/条和上清液在
‑
20℃下冷冻直到分析为止。分析gcf的中性粒细胞趋化因子，用于微生物组分析的牙菌斑样品，同时针对中性粒细胞收集唾液。使用用于牙龈沟液的多重免疫分析来检测中性粒细胞趋化因子，包括mif、mip
‑
1a、cxcl1、cxcl5、cxcl8、cxcl2和cxcl6。
[0031]
结果和讨论：
[0032]
共招募了二十一名受试者，包含10名女性和11名男性参与者，其年龄在18
‑
35岁之间，平均年龄为23.33(中值＝22；标准差＝4.37；标准误差＝0.95)。所有二十一名参与者均完成研究且遵守研究方案，没有报告不良事件。一名受试者由于家庭紧急情况在第7天错过一次预约。
[0033]
结果显示，关于临床参数，在基线第0天时，测试侧与对照侧之间没有差异。数据证明，从基线到第21天，测试侧上的所有牙龈炎症参数显著增加，其在重新实施口腔卫生措施后在第35天时减少回到基线水平。在从健康到疾病的转变中观察到临床参数的显著变化。与来自先前的实验性牙龈炎研究的发现一致，在本研究中的牙龈炎诱导期间，与对照侧相比，在测试侧中，牙龈指数(gi)、牙菌斑指数(pi)、探测时出血(bop)和牙龈沟液(gcf)体积统计显著更高。
[0034]
基于使用k均值聚类算法由第21天时的牙龈指数评分确定的牙龈炎症严重程度，在21名受试者研究群体中鉴别高反应者组(16名受试者)和低反应者组(5名受试者)。五名低反应者在第21天时各自的gi≤1.5，而十六名高反应者中的每一个在同一时间点时的gi≥1.8，这与临床上可察觉的牙龈炎一致。
[0035]
使用用于牙龈沟液的多重免疫分析来检测中性粒细胞趋化因子，包括mif、mip
‑
1a、cxcl1、cxcl5、cxcl8、cxcl2和cxcl6，生成数据。来自对照侧的数据示于下表2中。来自测试侧的数据示于下表3中。图1在条形图中并排显示所测量的趋化因子的对照和测试数据。
[0036]
发现与对照侧相比，在测试侧中，在牙龈炎诱导期间仅一种中性粒细胞趋化因子，
即巨噬细胞迁移抑制工厂(mif)显著增加，其为在gcf中发现的最丰富的中性粒细胞趋化因子。在测试侧中，其从基线水平(中值＝1557.62pg/样品)到第4天时的第一个时间点(中值＝4005.15pg/样品)统计显著增加，增加2.6倍，并且在整个牙龈炎期间保持升高。其在牙龈炎消退后(第28天)和研究结束时(第35天)返回到基线水平。已知这种中性粒细胞趋化因子是中性粒细胞功能的中央调节因子。其表达与牙龈炎诱导紧密相关。在先前的人牙龈炎研究中，已报道mif在较年轻个体中增加且较年长个体中降低。
[0037]
此外，在基线(第0天)时，低反应者组(在第21天时鉴别)就其较低的mif水平来说与高反应者清楚地分离。当低反应者在研究结束第35天时恢复健康时，mif仍然低。其它趋化因子均未显示出与临床反应的此种明显关联；低gi反应者在基线和研究结束时具有低mif水平。
[0038]
基线时接下来三种最丰富的中性粒细胞趋化因子(cxcl1；测试侧中值＝99.97pg/样品且对照侧中值＝112.47pg/样品：cxcl5；测试侧中值＝36.55pg/样品且对照侧中值＝38.37pg/样品：和il
‑
8(cxcl8)；测试侧中值＝156.83pg/样品且对照侧中值＝155.83pg/样品)。在测试侧中，cxcl1和cxcl5显示gcf水平的短暂(第4天和第7天)降低。然而，在第14天时，虽然牙菌斑指数、牙龈指数和bop部位仍在增加，但这两种趋化因子的量返回到基线水平。相比之下，il
‑
8在整个牙龈炎期间显示减少。这是对牙龈炎诱导期间cxcl1水平降低的首次报告。先前的一份报告描述了cxcl5的减少，且先前的两份报告描述了il
‑
8的减少。
[0039]
接下来三种最丰富的趋化因子(cxcl2；测试侧中值＝3.51pg/样品且对照侧中值＝3.7pg/样品：cxcl6；测试侧中值＝3.05pg/样品且对照侧中值＝3.18pg/样品：和mip1a(ccl3)；测试侧中值＝2.61pg/样品且对照侧中值＝3.14pg/样品)显示不同表达模式。如针对cxcl1和cxcl5所描述，cxcl2证明支架区域中gcf水平的短暂降低(减少的第4天和第7天：在第14天恢复到基线)。相比之下，cxcl6和mip1a在整个牙龈炎期间显示与il
‑
8类似的减少。
[0040]
最后，在测试侧中，两种丰度最低的中性粒细胞趋化因子(cxcl12；测试侧中值＝1.6pg/样品且对照侧中值＝1.74pg/样品；和ccl7；测试侧中值＝0.51pg/样品且对照侧中值＝0.58pg/样品)显示在整个牙龈炎诱导期间的轻微增加。然而，由于检测水平低，来自这两种趋化因子的数据可能不具有相关意义。
[0041]
中性粒细胞趋化因子发现的总结
[0042]
这些数据证明，在从临床健康到牙龈炎的初始转变期间，发生了趋化因子利用模式的显著变化。在这一实验模型中，在临床健康组织中发现的最丰富的中性粒细胞趋化因子mif显著增加，并且中性粒细胞趋化因子mip
‑
1a、cxcl1、cxcl5、cxcl8、cxcl2和cxcl6的浓度显著降低。
[0043]
表2和3中的数据用于生成mif：趋化因子比率，并且从来自对照侧和测试侧的比率的比较推导出用于指示健康或牙龈炎诊断的分离点。
[0044]
图2显示来自对照(健康)侧和测试(牙龈炎)侧的mif水平对天。
[0045]
图3显示来自对照(健康)侧和测试(牙龈炎)侧的mip1a水平对天。
[0046]
图4显示在研究的每个时间点来自对照(健康)侧和测试(牙龈炎)侧的mif/mip1a比率。贯穿测试日(第4天、第7天、第14天和第21天)，对照侧上的mif∶mip1a比率为约2000，而测试侧上的mif∶mip1a比率为约11,000。低于5000的mif∶mip1a比率可指示健康。mif∶
mip1a比率大于5000，其中mif水平高于10,000且mip1a低于10指示牙龈炎，而mif∶mip1a比率大于5000，其中mif等于或小于10,000且mip1a等于或小于10指示未患有牙龈炎。
[0047]
表2：对照侧数据
‑
不同研究访视期间以pg/样品表示的趋化因子总量的中值水平，
[0048][0049]
表3：测试侧数据
‑
不同研究访视期间以pg/样品表示的趋化因子总量的中值水平，
[0050]