玉米果皮厚度的测量方法及应用与流程

本发明涉及农产品测量
技术领域：
，具体是一种玉米果皮厚度的测量方法及应用。
背景技术：
：玉米果皮是由通过子房壁发育形成的果皮和珠被发育形成的种皮愈合而成，受母体遗传的控制。果皮是玉米籽粒重要的组成部分，果皮的薄厚对保护籽粒胚和胚乳免受病虫害侵入(董艺兰等2011)、爆裂玉米膨化特性(mohamedetal.1993)、玉米籽粒脱水速率(stroshineetal.1987)、籽粒乙醇生产效率(dienetal.2002)、鲜食玉米蒸煮品质(choeandrocheford2012)等具有重要的意义。由于果皮的薄厚直接影响到鲜食玉米的口感，一直是鲜食玉米品质育种的重要选择目标性状。研究果皮厚度变化及其遗传规律，对鲜食玉米品质育种及生产具有重要的指导意义。果皮厚度是典型的数量性状，薄果皮具有部分显性，广义遗传力较高(70％-90.5％)，受环境影响较小，控制玉米果皮厚度的基因位点在1.4～5.9个之间。有三种形态变化影响果皮厚度的变化：果皮细胞层数、胚面和背胚面细胞的差异性增厚以及单个果皮细胞壁的增厚。消费者偏好的果皮厚度约为35-60μm，生产上，甜玉米杂交种的果皮厚度在50-148μm之间，4-30层细胞组成。果皮偏厚是我国鲜食玉米品质不高的主要原因。前人对鲜食玉米果皮厚度的鉴定方法进行了大量的研究，摸索出了一些测定方法：螺旋测微尺法(wolfetal.1969；helmandzuber1972；martinetal.1980；choeetal.2012；杜彦超2013)、显微测微尺法(wolfetal.1969；choeetal.2012；杜彦超2013；于永涛等2015；朱敏等2016)、果实硬度计法(张士龙等2012)、品尝法。国际上通用的方法是螺旋测微尺法。然而，这些方法在评定果皮厚度性状时既有自身的优势又有各自的缺点：显微测微尺法和螺旋测微尺法测量精度高，但需要较高的实验条件、鉴定效率低；便携式果实硬度计具有操作简单、便于携带、适于在田间操作等优点，但是硬度计所显示的压强值受到果皮厚度、果皮结构和胚乳质地等因素影响，结果略显粗糙，尤其是在测量糯玉米果皮厚度的可靠性上还有待商榷，这些缺陷使得这些方法很难真正在育种实践中加以应用。品尝法是目前在育种上应用最广、操作最简单、为大多数科技工作者认可的一种鲜食玉米果皮厚度评定方法，但是易受鉴定人员主观判断和环境条件影响，鉴定结果容易造成误差，甚至造成有利等位基因的丢失。如何快速、准确地测量玉米的果皮厚度，一直以来是困扰科研工作者的悬而未决的难题。技术实现要素：本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。本发明还有一个目的是提供一种玉米果皮厚度的测量方法，其操作简单快速、剥皮容易且干净、测量结果准确性高。为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种玉米果皮厚度的测量方法，包括以下步骤：玉米籽粒用蒸馏水淹没后经高压灭菌处理或者蒸煮处理，取出后将玉米籽粒进行切割，先将顶部横切，取下顶部，再将剩余部分竖立并沿长轴方向纵切，分成胚面和背胚面，然后从顶部、胚面、背胚面分别剥离果皮，将剥离的果皮置于甘油溶液中软化处理，再擦去果皮多余的甘油溶液置于空气中平衡处理，最后将果皮平铺在铝板上，使用涂层测厚仪测量果皮厚度。优选的是，所述玉米籽粒为成熟期的玉米籽粒，其高压灭菌处理时的温度为105°、时间为6-10min。优选的是，所述玉米籽粒为成熟期的玉米籽粒，其蒸煮处理的时间为50-55min。优选的是，所述玉米籽粒为鲜食期的玉米籽粒，其蒸煮处理的时间为20min。优选的是，高压灭菌处理或者蒸煮处理时，玉米籽粒始终容纳于玻璃瓶中并用蒸馏水淹没。优选的是，甘油溶液中甘油和水的比例为3:1。优选的是，软化处理的时间为20-24h，平衡处理的时间为24h。优选的是，切割时将玉米籽粒放置在载玻片上，剥离果皮时采用尖头镊子。本发明所述的玉米果皮厚度的测量方法用于鲜食玉米育种中薄果皮自交系及薄果皮杂交种的选育。本发明所述的玉米果皮厚度的测量方法用于果皮厚度基因定位以及分子标记和基因克隆中的表型鉴定。本发明至少包括以下有益效果：本发明采用高温灭菌处理或者蒸煮处理，最后测量的结果更接近鲜食玉米品尝时果皮的实际情况，更能反应鲜食玉米食味品质。传统的浸泡籽粒太硬且不易切割，剥皮时果皮粘连胚乳，高温灭菌或蒸煮后籽粒软、易切割、剥皮也不粘连，相比于传统的单纯浸泡处理时间缩短6倍以上，且籽粒切割和剥皮更容易，切割和剥皮效率提高2倍以上。本发明的方法操作简单、制皮容易且剥皮干净、测量结果准确性高，本发明的方法测量获得的数据可以用于鲜食玉米育种中薄果皮自交系及薄果皮杂交种的选育。此外，分离群体果皮厚度表型数据结合群体的基因型数据，可开展果皮厚度的基因定位，挖掘薄果皮有利等位基因，可进一步应用于分子标记的开发和以及薄果皮功能基因的图位克隆的基础研究中。本发明中使用的涂层测厚仪采用电磁感应和涡流效应两种原理，可无损测量磁性金属基材(如钢、铁及其合金)上非磁性涂镀层的厚度(如油漆、塑料、铜、铬、锌等)，及非磁性金属基材(如铜、铝、锌、锡等)上的非导电涂镀层的厚度(氧化膜、塑料、油漆等。本发明首次将涂层测厚仪应用到测量玉米果皮厚度上，将玉米果皮平铺在一块非磁性金属板(铝板)上，根据涡流效应工作原理，快速准确的测量出果皮厚度。本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。附图说明图1为本发明的其中一个实施例中不同测量方法测量bc1f1分离群体不同部位果皮厚度的频率分布图。具体实施方式下面结合附图和实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得；在本发明的描述中，术语“横向”、“纵向”、“轴向”、“径向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，并不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。<实施例1>田间种植16份不同类型的玉米自交系，在成熟期，每份材料收获代表性的1个果穗，晒干，得到玉米干籽粒，备用。每个果穗选取果穗中部代表性的30粒籽粒，放入玻璃瓶中进行高压灭菌或者蒸煮试验。当剥离难易度越容易，果皮爆裂比率越低，籽粒软硬度为“软”是最合适的高压灭菌或蒸煮条件表1不同温度和高压灭菌时间对玉米干籽粒果皮剥离的影响表2不同蒸煮时间对玉米干籽粒果皮剥离的影响通过表1和表2可知，玉米干籽粒高压灭菌处理时最适合的温度为105°、时间为6-10min。蒸煮处理时最适合的时间为50-55min。表3玉米干籽粒直接浸泡后对果皮剥离的影响从表3中可以看出，传统浸泡后的玉米籽粒太硬且不易切割，即使浸泡时间加长，剥皮时果皮粘连胚乳，影响测量结果的准确性，本发明通过蒸煮的方法使操作时间大大缩短，提升效率。<实施例2>田间种植4种不同类型的玉米自交系，分别是：郑58(马齿型普通玉米自交系)、昌7-2(硬粒型普通玉米自交系)、m002(糯玉米自交系)、超甜805(甜玉米自交系)。在成熟期，分别收获1个代表穗，晒干保存备用。每个果穗上选育果穗中部代表性的1个籽粒，利用本发明的方法和螺旋测微尺法分别对每种材料的一个籽粒的不同部位的果皮厚度进行测量，每个部位测量20次。按照本发明的方法：步骤一、将4份玉米自交系籽粒分别装于4个50ml的玻璃瓶内，加20ml蒸馏水淹没，盖上盖子，备用；步骤二、将装有玉米籽粒的4个玻璃瓶均放入高压灭菌锅内，在温度为105°下灭菌10min；步骤三、从高压灭菌锅中取出4个玻璃瓶，将一个玻璃瓶内的玉米种子和蒸馏水一同倒入一个培养皿中，在载玻片上用壁纸刀将玉米种子顶部横切，取下顶部，再将剩余部分竖立并沿长轴方向纵切，分成胚面和背胚面，然后用尖头镊子从顶部、胚面、背胚面分别剥离果皮；步骤四、将剥离的果皮置于甘油溶液(甘油：水＝3:1)中软化24h，再擦去果皮多余的甘油溶液置于空气中平衡24h，最后平衡后的果皮平铺在铝板上，使用涂层测厚仪分别测量顶部、胚面、背胚面的果皮厚度。按照螺旋测微尺法测量：将4份玉米自交系籽粒分别装于4个50ml的玻璃瓶内，加20ml蒸馏水淹没浸泡20h，单面刀片切除籽粒的基部，将顶部和中部切分开，在籽粒侧面胚面与背胚面交界处的用刀切开果皮，分别剥取顶部、胚面、背胚面3个部位果皮组织，剥离的果皮浸泡在甘油:水＝3:1的溶液中软化24小时，取出果皮，用纸擦干果皮表面的溶液，放置在空气中平衡24小时后，用螺旋测微尺测量各部位厚度。表4两种方法测量不同类型材料玉米顶部果皮的比较表5两种方法测量不同类型材料玉米背胚面果皮的比较表6两种方法测量不同类型材料玉米胚面果皮的比较表4-6给出了对于同一个部位的果皮利用两种方法分别测试了20次数据后，得到了各自对应的最大值、最小值、均值、标准差，可知，本发明的方法测得的标准差均比螺旋测微尺法小，精度高，测量结果准确。<实施例3>田间种植12份不同类型的玉米自交系及杂交种，在成熟期，每份材料收获1个代表果穗，晒干保存备用。每个果穗上选育果穗中部代表性的10个籽粒，即每1份材料含有10个玉米籽粒。果皮处理分别按照本发明的方法以及国际通用的螺旋测微尺法进行。按照本发明的方法：步骤一、每份材料取10个籽粒，分别装于12个50ml的玻璃瓶内，加20ml蒸馏水淹没，盖上盖子，备用；步骤二、将装有玉米籽粒的12个玻璃瓶均放入高压灭菌锅内，在温度为105°下灭菌10min；步骤三、从高压灭菌锅中取出12个玻璃瓶，将一个玻璃瓶内的玉米籽粒和蒸馏水一同倒入一个培养皿中，在载玻片上用壁纸刀将玉米籽粒顶部横切，取下顶部，再将剩余部分竖立并沿长轴方向纵切，分成胚面和背胚面，然后用尖头镊子从顶部、胚面、背胚面分别剥离果皮；步骤四、将剥离的果皮置于甘油溶液(甘油：水＝3:1)中软化24h，再擦去果皮多余的甘油溶液置于空气中平衡24h，最后平衡后的果皮平铺在铝板上，使用涂层测厚仪分别测量顶部、胚面、背胚面的果皮厚度。按照螺旋测微尺法测量：每份材料取10个籽粒，分别装于12个50ml的玻璃瓶内，加20ml蒸馏水淹没浸泡20h，单面刀片切除籽粒的基部，将顶部和中部切分开，在籽粒侧面胚面与背胚面交界处的用刀切开果皮，分别剥取顶部、胚面、背胚面3个部位果皮组织，剥离的果皮浸泡在甘油:水＝3:1的溶液中软化24小时，取出果皮，用纸擦干果皮表面的溶液，放置在空气中平衡24小时后，用螺旋测微尺测量各部位厚度。表7两种方法测量不同类型材料玉米籽粒顶部果皮的比较表8两种方法测量不同类型材料玉米籽粒背胚面果皮的比较表9两种方法测量不同类型材料玉米籽粒胚面果皮的比较表10两种测量方法的相关性分析**表示在p<0.01水平极显著相关从以上表7-表10可以看出，利用本发明测量顶部和背胚面果皮厚度比螺旋测微尺法方法，变异幅度小，因此准确性更高。在测量胚面果皮厚度时，本发明测量的平均标准差比螺旋测微尺法稍高，但是差异不明显，可能是由于干籽粒胚面果皮有更多褶皱导致。从以上表7-表10首次发现普通玉米常用自交系相比于其他类型玉米材料的果皮都较厚，利用其改良鲜食玉米种质时往往会导致果皮增厚，因此还需要进一步扩大样本，筛选薄果皮型优良普通玉米自交系；同时发现糯玉米自交系中的万m，甜玉米杂交种中的万甜2000果皮较薄，是选育薄果皮型鲜食玉米自交系或杂交种的重要种质资源。薄果皮品种市场前景广阔，万甜2000是甜玉米区域试验的对照品种，也是生产上的主流品种。本实施例中首次以近几年我国在玉米育种上的普通玉米、鲜食玉米骨干自交系和生产上所用的重要杂交种为材料，量化果皮厚度表型，促进鲜食玉米果皮育种由经验育种向精准数字育种的升级。自交系和杂交种遗传上是一致的，就是说同一自交系或杂交种果皮厚度测量结果只受玉米生长发育环境和测量方法影响，排除了遗传因素对玉米果皮测量的影响。在不考虑玉米发育环境因素的影响前提下，螺旋测微尺法测量结果比本发明的方差大，故测量误差偏大，本发明的方法测得的数据更为精确，参考性更强。<实施例4>田间种植80份鲜食玉米杂交种，在鲜食期，每份材料收获1个代表穗，并于-20度冰箱保存备用。每个果穗上选取果穗中部代表性的10个籽粒，即每1份材料含有10个玉米籽粒。80份鲜食玉米杂交种的具体材料名称如下：南澳162、南澳193、65、75、hs1601、sh2r-185、sh2r-186、金糯262、博宝、彩甜糯6号、菜玉甜6、丰蜜、奉甜糯72、高原丽人、海6、韩育多彩玉米、黑玫瑰15、黑香糯、恒香糯2号、华耘华糯402、吉农糯7号、吉甜16、佳糯668、稼彩甜糯262、金冠220、金冠597、金糯1607、金甜顺666、金香玉228、金银868、京科糯2000e、京科糯2010、京科糯2016、京科糯569、京科糯617、京科糯928、京科甜307、晶甜6号、肯糯1812、肯糯1813、垦粘1号、农科糯968、农科甜601、农科玉336、秋双甜478、瑞甜、润糯73、润甜糯876、石甜玉1号、双色甜玉米、斯达糯31、斯达糯32、斯达糯47、斯达甜221、斯达甜222、斯达甜224、斯达甜225、苏玉糯1702、天紫23、甜糯父本*五紫糯、甜玉米f1、万彩糯118、万彩糯3号、万糯2000、万糯2000、万糯2018、万甜2000、徽甜糯1号、先甜88、先甜90号、先正达甜玉米、云甜玉9、郑白甜糯1、中科糯602、中农大甜413、中糯336、中硕甜糯933、中甜401、珠玉糯1号、珠玉甜638果皮处理分别按照本发明的方法以及国际通用的螺旋测微尺法进行。按照本发明的方法：步骤一、每份鲜食玉米杂交种取10个籽粒，分别装于80个50ml的玻璃瓶内，加20ml蒸馏水淹没，盖上盖子，备用；步骤二、将装有玉米籽粒的80个玻璃瓶蒸煮20min；；步骤三、取出80个玻璃瓶，将一个玻璃瓶内的玉米籽粒和蒸馏水一同倒入一个培养皿中，在载玻片上用壁纸刀将玉米籽粒顶部横切，取下顶部，再将剩余部分竖立并沿长轴方向纵切，分成胚面和背胚面，然后用尖头镊子从顶部、胚面、背胚面分别剥离果皮；步骤四、将剥离的果皮置于甘油溶液(甘油：水＝3:1)中软化24h，再擦去果皮多余的甘油溶液，置于空气中平衡24h，最后平衡后的果皮平铺在铝板上，使用涂层测厚仪分别测量顶部、胚面、背胚面的果皮厚度。按照螺旋测微尺法测量：每份鲜食玉米杂交种取10个籽粒，分别装于80个50ml的玻璃瓶内，加20ml蒸馏水淹没浸泡6h，单面刀片切除籽粒的基部，将顶部和中部切分开，在籽粒侧面胚面与背胚面交界处的用刀切开果皮，分别剥取顶部、胚面、背胚面3个部位果皮组织，剥离的果皮浸泡在甘油:水＝3:1的溶液中软化24小时，取出果皮，用纸擦干果皮表面的溶液，放置在空气中平衡24小时后，用螺旋测微尺测量各部位厚度。表11两种测量方法测量80份鲜食玉米杂交种果皮厚度的比较分析由于80份材料数据量很大，本发明通过表8展示最终的统计数据，表11中各个部位的最大值、最小值、均值、标准差都是80份材料对应的80个数据计算出来的平均值。从上表11可以看出，本发明所述方法在顶部测量优于螺旋测微尺法，在胚面果皮厚度测量上准确度明显优于螺旋测微尺法，在背胚面上比螺旋测微尺法稍差。本实施例所用材料是鲜食期鲜食玉米杂交种的籽粒，杂交种遗传上是一致的，就是说同一杂交种果皮厚度测量结果只受玉米生长发育环境和测量方法影响，排除了遗传因素对玉米果皮测量的影响。在不考虑玉米发育环境因素的影响前提下，螺旋测微尺法测量结果比本发明的方差大，故测量误差偏大，本发明的方法测得的数据更为精确，参考性更强。在80份材料中筛选出果皮较薄的4份鲜食玉米杂交种，如下表12所示，其中甜糯型鲜食玉米杂交种2份、甜玉米杂交种1份、糯玉米杂交种1份，可用于优质鲜食玉米生产或薄果皮种质资源加以利用。表12筛选出的鲜食玉米杂交种<实施例5>田间种植239份bc1f1单株分离群体，在成熟期，每份材料收获一个代表穗，晒干保存备用。每个果穗上选取果穗中部代表性的10个籽粒，即每一份含有10个玉米籽粒。239份bc1f1单株是以m002为供体亲本，郑58为轮回亲本构建的回交群体。表13两种测量方法的相关性分析**表示在p<0.01水平极显著相关表13说明了本发明测得的果皮厚度与螺旋测微尺法测量的果皮厚度呈极显著正相关，两种方法准确性都很高。附图1展示了两种不同测量方法测量239份bc1f1单株的不同部位果皮的变化分布图，图中dc:顶部-本发明所述方法；dq：顶部-螺旋测微尺法；bpc：背胚面-本发明所述方法；bpq：背胚面-螺旋测微尺法；pc:胚面-本发明所述方法；pq:胚面-螺旋测微尺法。附图1中本发明的方法和螺旋测微尺法都能够准确区分遗传分离群体不同材料果皮厚的差异，且两种方法测量同一部位果皮相关系数达到极显著水平。与螺旋测微尺法相比，本发明的方法在确保准确性的前提下，提高了玉米果皮厚度鉴定的效率。本发明的方法测量的数据可用于玉米果皮厚度qtl定位研究中，可进一步开发出果皮厚度的分子标记。此外，根据本发明的测量方法，筛选出5份果皮厚度小于80微米的bc1f1单株材料(如下表14)，可进一步用于薄果皮型鲜食玉米自交系的选育工作。表145份薄果皮bc1f1单株不同部位果皮厚度bc1f1植株编号顶部背胚面胚面平均数455562.3778.8775.5072.25432958.3575.0089.1374.16423160.0173.0898.6777.25451750.6688.4494.0977.73453754.6992.5387.7478.32本发明中用到的玉米籽粒材料均来自于2018年种植在天津市农业科学院武清农业创新基地院内，种植2行区，5米行长。本发明中所有表格中关于顶部、胚面、背胚面的测量的最大值、最小值、均值(或平均数)、标准差的数值单位都是μm。尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。当前第1页12