复方珍珠解毒口服液指纹图谱构建和制备方法与流程

本发明属于药物分析
技术领域：
，具体涉及复方珍珠解毒口服液指纹图谱方法的建立。
背景技术：
：复方珍珠解毒口服液是由珍珠层粉、金银花、土茯苓、地黄、甘草、龟甲等六味药材是通过现代化工艺按照一定的处方比例精制而成的中药复方制剂。具有清热凉血，养阴解毒的作用，适用于因热毒瘀阻肌肤所致的轻型粉刺，症见皮疹以红色丘疹、黑头或白头粉刺为主，伴有少量脓头者。复方珍珠解毒口服液作为一种中药复方制剂，所含的中药种类和化学成分较多，在质量的控制和评价方面存在着一定的困难。根据现有的执行标准是国家药品监督管理局标准（试行）（ws-5267（b-0267）-2017z），该标准仅使用薄层色谱法对绿原酸、甘草苷和落新妇苷三种化学成分进行鉴别和采用高效液相仅检测绿原酸一种化学成分的含量作为复方珍珠解毒口服液的质量控制的标准，忽略了中药复方珍珠解毒口服液的多种类、多成分之间的协同作用，不能全面、准确、客观的评价复方珍珠解毒口服液的质量，难以真正的体现复方珍珠解毒口服液的内在质量。中药指纹图谱技术是指某些中药材或中药制剂经适当处理后，采用一定的分析手段，得到能够标示其化学特征的色谱图或光谱图，是一种综合的，可量化的鉴定手段，具有专属性强、稳定性好、重复性好、精密度高等的特点，适用于中药材的真伪鉴别及多种中药的成分的质量控制，能较全面的反映中药所含的多种化学成分的相对关系，能体现中药化学成分的复杂性和相关性，能真正全面、客观、准确的评价中药复方制剂的内在质量。因此，利用高效液相建立复方珍珠解毒口服液的指纹图谱方法对复方珍珠解毒口服液的质量控制及提高复方珍珠解毒口服液的质量有着重大的意义，能确保产品质量的稳定和均一。技术实现要素：发明目的：利用高效液相色谱仪建立一种复方珍珠解毒口服液的指纹图谱方法，以解决上述
背景技术：
中的问题。技术方案：为实现上述的目的，本发明实现的技术方案如下：本发明通过利用高效液相色谱仪建立复方珍珠解毒口服液的指纹图谱方法，具体的步骤如下：(1)复方珍珠解毒口服液供试品溶液的制备：精密量取复方珍珠解毒口服液适量，用溶剂定容，摇匀，即得。(2)对照品溶液的制备：分别精密称定适量的绿原酸、毛蕊花糖苷、甘草苷和落新妇苷对照品，分别用甲醇定容得各对照品溶液。(3)色谱条件设定：色谱柱为c18柱，流动相为乙腈—磷酸水溶液，进样量为5～20μl，柱温为30℃～40℃，流速为0.8ml/min～1.2ml/min,检测波长为200～400nm。(4)测定：分别精密吸取供试品溶液和各对照品溶液，注入高效液相色谱仪中测定，记录液相色谱信息。(5)将所得到的液相色谱信息导入中国药典委的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”软件进行分析与，处理，得到复方珍珠解毒口服液指纹图谱。作为优选的，所述步骤（1）的供试品溶液的制备为：精密量取复方珍珠解毒口服液5ml，用50%甲醇定容至50ml的容量瓶中，摇匀，即得。作为优选的，所述步骤（2）对照品溶液的制备：精密称取绿原酸对照品0.73mg，置25ml容量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，摇匀，得浓度为28.99μg/ml的绿原酸对照品溶液；精密称取毛蕊花糖苷对照品0.38mg，置25ml容量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，摇匀，得浓度为9.74μg/ml的毛蕊花对照品溶液；精密称取甘草苷对照品0.50mg，置25ml容量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，摇匀，得浓度为18.62μg/ml的甘草苷对照品溶液；精密称取落新妇苷对照品0.27mg，置25ml容量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，摇匀，得浓度为10.14μg/ml的落新妇苷对照品溶液；作为优选的，所述步骤（3）色谱条件的设定为：优选的，色谱柱为agilent5tc-c18(2)（250x4.6mm,5μm）；优选的，以乙腈为流动相a，以0.2%磷酸水溶液为流动相b；优选的，检测波长为327nm，优选的，流速为1ml/min，优选的，进样量为10μl，优选的，柱温为30℃，优选的，采用梯度洗脱，梯度洗脱过程中，所述流动相a和流动相b的变化为：0-5min，流动相a为10%-20%，流动相b为90%-80%；10-15min，流动相a为20%-30%，流动相b为80%-70%；15-30min，流动相a为30%-30%，流动相b为70%-70%；30-40min，流动相a为30%-10%，流动相b为70%-90%。作为优选的，所述步骤（5）使用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”处理与分析复方珍珠解毒口服液的色谱信息，即得复方珍珠解毒口服液的指纹图谱。优选的，选择10批复方珍珠解毒口服液的指纹图谱中均存在的色谱峰作为共有峰；优选的，用平均值计算法计算相似度的结果，并生成标准对照指纹图谱；优选的，计算各共有峰的相对保留时间及各共有峰相对保留时间与参照峰相对保留时间的比值。其中，在本发明的过程中，主要对色谱条件、检测波长、流速等条件进行了选择和优化。(1)色谱条件的选择和优化：实验考察了不同的色谱柱对样品分离效果的影响，比如色谱柱xselect®hssc18sb、inertrsil®ods-3和agilent5tc-c18(2),结果显示，3个色谱柱当中，样品通过色谱柱agilent5tc-c18(2)的分离效果是最佳的，所得的色谱峰峰形对称、均匀分布，基线平稳，检测的效果为最佳。实验考察了不同的流动相系统对样品分离效果的影响，分别是对乙腈-0.1%冰醋酸、乙腈-0.05%磷酸、乙腈-0.2%磷酸、乙腈-甲醇-水（57:40:3）-0.2%磷酸和乙腈-0.5%磷酸5个流动相系统进行考查。其中，是以乙腈-0.2%磷酸水溶液的结果最佳，所得的色谱峰数量较多，色谱峰分布均匀，基线平稳，提高了色谱图的分离度，一定程度上减少了色谱峰的拖尾现象，有利于色谱指纹图谱的检测和分析。(2)检测波长的选择：采用二极管阵列检测器（dad）对在190～400nm扫描得到的色谱图进行各波长的比较分析，并设定334nm、327nm、291nm、237nm和220nm这5个波长同时进行检测。检测的结果说明，在327nm检测下，色谱峰的数量多，分离效果好、峰形对称、峰吸收好、基线平稳。因此，最终确定本发明的检测波长为327nm。(3)流速的选择：实验中对低流速和高流速进行了考察，因复方珍珠解毒口服液中存在较多的同分异构体以及极性比较相似的成分，在0.8ml/min～1.2ml/min中，是以1ml/min的流速为最佳的流速，在该流速下，液相色谱峰的分离效果最佳，色谱图美观、基线平稳、各色谱峰的保留时间适宜。综上所述，由于采用了上述的技术方案，本发明的有益效果是：本发明利用高效液相色谱建立复方珍珠解毒口服液的指纹图谱方法，能够有效的解决复方珍珠解毒口服液单一成分控制质量的问题，能全面、准确、客观的评价复方珍珠解毒口服液的质量，保证产品的稳定和均一。【附图说明】图1：绿原酸对照品色谱图；图2：毛蕊花糖苷对照品色谱图；图3：甘草苷对照品色谱图；图4：落新妇苷对照品色谱图；图5：复方珍珠解毒口服液样品色谱图；图6：各批次样品复方珍珠解毒口服液hplc指纹图谱及对照指纹图谱。色谱峰分别对应：a为绿原酸、b为毛蕊花糖苷、c为甘草苷、d为落新妇苷。【具体实施方式】利用高效液相色谱仪建立一种复方珍珠解毒口服液的指纹图谱方法的实例。1.仪器与试药仪器：安捷伦1260infinitⅱ高效液相色谱仪（安捷伦科技（中国）有限公司）、岛津lc20a高效液相色谱仪（岛津企业管理）（中国）有限公司）、kq-500da型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、shb-ⅳ双a循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸易有限公司）、gh-202型分析天平（a&dcompany,limited）试药：甲醇、磷酸、乙醇、盐酸等均为分析纯；乙腈、甲醇均为色谱级，均购自赛默飞世尔科技中国有限公司；纯净水，购自杭州娃哈哈集团有限公司；绿原酸对照品（批号110753-201716，质量分数99.3%）、毛蕊花糖苷对照品（批号111530-201713，质量分数99.2%）甘草苷对照品（批号111610-201607，质量分数93.1%）、落新妇苷（批号111798-201504，质量分数93.9%）均购自中国食品药品检定研究院；复方珍珠解毒口服液（批号181001、190302），来自广西慧宝源医药科技有限公司。2.实验方法2.1复方珍珠解毒口服液供试品溶液的制备精密量取复方珍珠解毒口服液5ml，用50%甲醇定容至50ml的容量瓶中，摇匀，即得。2.2对照品溶液的制备精密称取绿原酸对照品0.73mg，置25ml容量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，摇匀，得浓度为28.99μg/ml的绿原酸对照品溶液；精密称取毛蕊花糖苷对照品0.39mg，置25ml容量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，摇匀，得浓度为9.74μg/ml的毛蕊花对照品溶液；精密称取甘草苷对照品0.50mg，置25ml容量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，摇匀，得浓度为18.62μg/ml的甘草苷对照品溶液；精密称取落新妇苷对照品0.27mg，置25ml容量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，摇匀，得浓度为10.14μg/ml的落新妇苷对照品溶液；3.色谱条件设定色谱柱：agilent5tc-c18(2)（250x4.6mm,5μm），流动相：以乙腈为流动相a，以0.2%磷酸水溶液为流动相b，梯度洗脱，检测波长：327nm，流速：1ml/min，进样量：10μl，柱温：30℃，表1:梯度洗脱的时间程序表4.方法学的考查(1)精密度实验：精密度实验取同一批次的复方珍珠解毒口服液5ml，按照所述的供试品制备方法制备供试品，在优化的色谱条件下，连续检测6次，记录色谱信息，以2号峰绿原酸（s）为参照物，计算剩余9个共有峰的相对保留时间以及相对峰面积。结果显示，各主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的比值无明显的变化，其相对应的rsd值分别在0.006%～0.154%和0.989%～4.520%，rsd<5%，表明本发明的实验方法仪器的精密度高，数据见表1。(2)稳定性实验：取同一批次的复方珍珠解毒口服液5ml，按照所述的供试品制备的方法制备供试品溶液，在优化的色谱条件下，分别在0、4、8、12、24小时准确吸取10μl注入高效液相色谱仪中测定，记录色谱信息，以2号峰绿原酸（s）为参照物，计算剩余9个共有峰的相对保留时间以及相对峰面积。结果显示，各主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的比值无明显的变化，其相对应的rsd值分别在0.035%～1.121%和0.363%～4.743%，rsd<5%，表明供试样品溶液制备后24h内稳定，数据见表1。(3)重复性实验：取同一批次的复方珍珠解毒口服液5ml，按照所述的供试品制备的方法平行制备6份供试品溶液，在优化的色谱条件下，分别注入高效液相色谱仪中测定，记录色谱信息，以2号峰绿原酸（s）为参照物，计算剩余9个共有峰的相对保留时间以及相对峰面积。结果显示，各主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的比值无明显的变化，对应的rsd值分别在0.016%～0.106%和0.092%～3.702%，rsd<5%,表明本发明的实验方法重复性好，数据见表1。表1：复方珍珠解毒口服液指纹图谱方法学验证数据结果(4)(5)将检测所得的色谱图利用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”软件进行分析处理，可得复方珍珠解毒口服液对照指纹图谱。(6)将图5复方珍珠解毒口服液的色谱图与各对照品色谱图对比可见，鉴定的绿原酸、毛蕊花糖苷、甘草苷、落新妇苷4种成分的分离效果好，色谱峰的峰形对称。其中，绿原酸、毛蕊花糖苷、甘草苷、落新妇苷4种化学成分的保留时间分别为10.354min、16.582min、16.892min和17.732min。5.利用指纹图谱对复方珍珠解毒口服液进行质量控制及评价(1)复方珍珠解毒口服液指纹图谱的测定：取10批复方珍珠解毒口服液样品按照所述的供试品制备方法制备供试品溶液，按照所述的色谱条件检测供试品溶液，记录10批（编号为s1～s10）复方珍珠解毒口服液的指纹图谱。(2)利用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”软件对10批复方珍珠解毒口服液的指纹图谱进行自动匹配（编号为s1～s10），选择编号为s1（样品编号为1）作为参照图谱，生成的对照指纹图谱记录为r。各批次样品之间的指纹图谱的相似度结果见表3。表310个批次的复方珍珠解毒口服液指纹图谱的相似度评价结果（相关系数法）s1s2s3s4s5s6s7s8s9s10rs110.9990.9970.9950.9960.9980.9930.9930.9870.9930.998s20.99910.9980.9960.9970.9990.9950.9930.9880.9930.998s30.9970.99810.9990.9990.9980.9920.9910.9910.990.998s40.9950.9960.999110.9970.9910.990.9910.990.997s50.9960.9970.999110.9980.9920.990.9910.9910.998s60.9980.9990.9980.9970.99810.9940.9930.9880.9930.998s70.9930.9950.9920.9910.9920.99410.9990.9950.9990.998s80.9930.9930.9910.990.990.9930.99910.9950.9990.997s90.9870.9880.9910.9910.9910.9880.9950.99510.9960.995s100.9930.9930.990.990.9910.9930.9990.9990.99610.997r0.9980.9980.9980.9970.9980.9980.9980.9970.9950.9971从表3中可以看出，10个批次样品的指纹图谱与r的相似度均在0.900以上，说明复方珍珠解毒口服液10个样品批次的化学成分总体上较为相近。6.总结本发明首次利用高效液相仪器及“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”软件建立复方珍珠解毒口服液的指纹图谱方法。本发明建立的复方珍珠解毒口服液指纹图谱方法可应用于复方珍珠解毒口服液的质量控制，可用于鉴别复方珍珠解毒口服液产品的真伪，能够有效的解决复方珍珠解毒口服液单一成分控制质量的问题，能全面、准确、客观的评价复方珍珠解毒口服液的质量，保证产品的稳定和均一。上述所揭露的实施方式，仅为便于理解本申请而采用的实施方式，并非用以限定本申请。其它的任何的未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12