一种具有荧光增强和光学放大效应的微纳复合结构及其制备方法与流程

本发明涉及光谱学分析检测技术领域，更具体地，涉及一种具有荧光增强和光学放大效应的微纳复合结构及其制备方法。

背景技术：

荧光的光学探测和成像技术，由于其非接触、易集成、抗电磁干扰等特点，成为探究纳米世界的重要工具和手段。由于纳米尺度下，荧光分子团簇较小，甚至是单分子荧光，因而荧光强度较弱，荧光探测难以达到较强的灵敏度；另一方面，由于光学衍射极限的存在，传统的光学显微观测极限只能到200nm左右，这不利于纳米尺度的荧光成像。因此，荧光增强与超分辨成像是基于荧光的光学探测和成像的研究重点与热点。

然而，要获得高的增强因子，需要复杂的纳米制造工艺，对结构进行精细的设计。而以真空溅射、涂覆等简单方式制备的贵金属纳米结构基底来增强荧光，增强因子往往只有几到几十。因而，如何用简单的方法或结构来有效地增强荧光，依然是荧光增强的研究重点与难点。

另一方面，实现光学显微镜下纳米尺度材料或结构的可视化观测，还需要突破光学衍射极限，但现有突破衍射极限的方法需要对单分子荧光的精准调控，并对激光光束有特殊的要求。

junsun等报道了一种基于聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)涂层大面积au@ag纳米棒阵列的等离子体增强荧光基底，将au@ag纳米棒组装在sio2/si晶片上形成大面积衬底，在最佳pmma层厚度(56nm)下，显示最大的荧光增强因子。(junsunect.uniformandreproducibleplasmon-enhancedfluorescencesubstratebasedonpmma-coated,large-areaau@agnanorodarrays.nanoresearch2018,11(2):953–965.)

但对于单光子荧光材料来说，增强荧光的增强因子仍然较小(几到十几倍增强)。因而，亟需一种能够用简单的方式实现对多种荧光材料的有效增强和实现荧光的超分辨成像。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服现有荧光成像的方式不能满足多种荧光材料的需求的缺陷和不足，提供一种具有荧光增强和光学放大效应的微纳复合结构，以贵金属纳米结构作为基底，再结合介质微球，具有荧光增强效应，可用于检测微弱荧光，实现不同纳米荧光材料的荧光成像。

本发明的又一目的是提供一种具有荧光增强和光学放大效应的微纳复合结构的制备方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种具有荧光增强和光学放大效应的微纳复合结构，包括等离激元层、隔离层、荧光层、保护层和介质微球层；其中等离激元层由聚合物和贵金属纳米材料组成，隔离层由聚合物组成，荧光层由荧光材料组成，保护层由聚合物组成，介质微球层由介质微球组成。

本发明以贵金属纳米结构作为基底，结合介质微球(microsphere,ms)，制备介质微球/贵金属纳米材料的微纳复合结构。由于介质微球具有的“纳米喷流”效应，能够将光束能量集中到亚波长范围，提高入射光的能量密度，而荧光强度与入射场强度的平方成正比，因而，利用介质微球可以实现物质的“放大”，同时能够增强荧光。本发明利用介质微球的“纳米喷流”以及贵金属纳米材料的等离子体共振的双重效应，可以实现对多种荧光材料的有效荧光增强，并且实现光学显微镜下尺寸低至100nm的荧光颗粒的超分辨成像。

优选地，所述的聚合物为聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯、聚对苯二甲酸丙二醇醋中的一种。

更优选地，所述聚合物为pmma，由广州市梓兴化玻仪器有限公司生产。

优选地，所述贵金属纳米材料为金或银纳米材料。

更优选地，所述贵金属纳米材料为金纳米棒(aunr)。

优选地，所述纳米材料的结构为纳米棒、纳米颗粒、纳米星、纳米线中的一种。

优选地，所述荧光材料为量子点(quantum,qd)、有机荧光染料、上转换纳米材料中的一种。

优选地，所述的介质微球为二氧化硅微球(sio2)、聚苯乙烯微球(ps)、二氧化钛微球(tio2)、三聚氰胺甲醛微球(mf)中的一种。

优选地，所述隔离层厚度为4～12nm。

本发明还保护上述具有荧光增强和光学放大效应的微纳复合结构的制备方法，包括如下步骤：

s1.将聚合物和贵金属纳米材料的混合溶液分散于基底，制得具有等离激元层的结构；

s2.将聚合物溶液涂分散于步骤s1制得的具有等离激元层的结构上，在200～300℃进行退火处理，制得具有隔离层的结构；

s3.将荧光材料溶于溶剂中，分散于步骤s2制得的结构的隔离层上，制得具有荧光层的结构；

s4.将聚合物溶液分散于步骤s3制得的结构的荧光层上，制得具有保护层的结构；

s5.将介质微球溶解于水中，分散于步骤s4制得的结构的保护层上，干燥制得具有介质微球层的微纳复合结构。

优选地，所述基底的制备方法为：

先用乙醇擦去硅片的碎屑后，分别在丙酮、乙醇和水中，25～30℃进行超声清洗15～30min，再置于高压的氮气流下，将硅片表面吹干，即得到干燥干净的硅片，作为基底。

优选地，所述乙醇的质量浓度75％～95％。

更优选地，所述基底的具体制备方法为：

首先将硅片用硅刀切割至块状，用蘸有乙醇(质量浓度75％～95％)的擦镜纸擦去碎屑；然后用干净的镊子将硅片放入丙酮溶液中，25～30℃进行超声清洗15～30min；取出硅片放入乙醇溶液中(质量浓度75％～95％)，再次在25～30℃超声清洗15～30min；取出硅片，放入去离子水中，25～30℃超声清洗15～30min；最后用镊子夹取硅片，置于高压的氮气流下，快速将硅片表面吹干，即得到干燥干净的硅片，作为基底。

优选地，聚合物和贵金属纳米材料的混合溶液的制备方法为：将聚合物溶解于丙酮中，再加入贵金属纳米材料，搅匀，其中聚合物和金属纳米材料的质量比为1～3:1～3，制得聚合物和贵金属纳米材料的混合溶液。

更优选地，聚合物和贵金属纳米材料的混合溶液的制备方法为：首先将pmma固体分割为块状，以便于后续溶解；将pmma用去离子水和乙醇(质量浓度75％～95％)分别在25～30℃超声清洗15～30min，后置于高压氮气流下吹干，再在pmma中加入丙酮溶液，搅匀，转速1000～2000rpm，时间24～30h，即得到pmma的丙酮溶液；再加入aunr，搅匀，转速1000～2000rpm，时间5～10h，制得聚合物和贵金属纳米材料的混合溶液；在aunr溶液中混入适量的pmma溶液将有利于旋涂时aunr的分散和aunr薄膜的形成。

进一步地，步骤s1的具体操作可以为：

将洗净干燥的硅片置于旋涂机上，用移液枪取0.05～0.1ml聚合物和金属纳米材料的混合溶液滴在硅片上，设置旋涂速度2000～3000rpm，旋涂时间20～30s，旋涂形成均一的aunr薄膜，即制得具有等离激元层的结构。

优选地，步骤s2和步骤s4所述聚合物溶液的浓度为0.4～2.0mg/ml。

进一步地，步骤s2的具体操作可以为：

用移液枪取0.05～0.1mlpmma溶液滴在步骤s1制得的具有等离激元层的结构上，在旋涂速度4000～5000rpm下旋涂20～30s，形成厚度为4～12nm的pmma纳米薄膜，接着在200℃下对样品进行3min的退火处理，即制得具有隔离层的结构。

进一步地，步骤s3的具体操作可以为：

将需要进行荧光增强的荧光材料分散到正己烷中，用旋涂的方式在隔离层上旋涂20～30s，制得具有荧光层的结构。

步骤s4在荧光层上再制备一层隔离层，操作与步骤s2相同，用作保护层，防止光漂白效应对于荧光的衰减。

进一步地，步骤s4的具体操作可以为：

将介质微球分散在水中，超声处理，用移液管取0.05～0.1ml该溶液分散于步骤s4制得的保护层上，之后将其置于60～80℃的干燥箱中干燥24～30h，即得到具有介质微球层的微纳复合结构。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明用旋涂、自组装等简单的方式制备贵金属纳米结构基底，结合介质微球，制备了介质微球/贵金属纳米材料的微纳复合结构，结合了介质微球的纳米喷流和贵金属纳米材料的等离子体共振双重效应，可以实现对多种荧光材料的有效荧光增强，以及实现光学显微镜下尺寸低至100nm的荧光颗粒的超分辨成像，可以作为具有荧光增强和光学放大效应的结构，用于微弱荧光的检测和荧光成像，实现对于微纳荧光材料的可视化追踪和探测。该复合结构的制备方法简单，易于操作。

附图说明

图1为介质微球/贵金属纳米材料微纳复合结构的荧光增强原理示意图。

图2为隔离层厚度为4nm时qd/aunr样品的表征图片。

图3为隔离层厚度为8nm时qd/aunr样品的表征图片。

图4为隔离层厚度为12nm时qd/aunr样品的表征图片。

图5为实施例1、4、5不同隔离层厚度下aunr结构基底对于量子点荧光的增强光谱。

图6为不同直径的mf微球对于量子点荧光的增强光谱。

图7为微纳复合结构对于量子点荧光的增强复合结构的示意图。

图8为qd、qd/aunr、mf/qd、mf/qd/aunr四种样品所得到的量子点荧光光谱。

图9为实施例1制得各样品在光学显微镜下的超分辨成像：(a)纳米荧光颗粒的透射电镜图片；(b)明场下焦点在荧光层表面图片；(c)介质微球处的荧光层图片；(d)暗场下焦点在荧光层表面图片；(e)介质微球处的荧光层图片。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非另有说明，本发明实施例采用的原料试剂为常规购买的原料试剂。

本发明提供了一种具有荧光增强和光学放大效应的微纳复合结构及其制备方法，以下实施例具体举例说明。

实施例1

一种具有荧光增强和光学放大效应的微纳复合结构，包括等离激元层、隔离层、荧光层、保护层和介质微球层；其中等离激元层由pmma和aunr组成，隔离层由pmma组成，荧光层由cdse量子点组成，保护层由pmma组成，介质微球层由mf介质微球组成。

上述微纳复合结构的制备方法，包括如下步骤：

s1.首先将硅片用硅刀切割至1cm×1cm，用蘸有质量浓度75％的乙醇的擦镜纸擦去碎屑；然后用干净的镊子将硅片放入丙酮溶液中，常温条件下进行超声清洗15min；取出硅片放入质量浓度75％的乙醇,再次在常温条件下超声清洗15min；取出硅片，放入去离子水中，常温条件下超声清洗15min；最后用镊子夹取硅片，置于高压的氮气流下，快速将硅片表面吹干，即得到干燥干净的硅片，留作基底使用；

将pmma固体(广州市梓兴化玻仪器有限公司提供)分割为小块，以便于后续溶解；将pmma用去离子水和酒精分别在常温下超声清洗15min，后置于高压氮气流下吹干；然后称取pmma固体放入锥形瓶中，之后加入25ml的丙酮溶液，搅拌，将锥形瓶放在磁力搅拌机中常温条件下以1000rpm的转速搅拌24h，即可得到pmma的丙酮溶液；

用移液枪将分散在丙酮中的aunr取出，按照aunr与pmma质量比1:1配制成混合溶液，并将混合溶液置于磁力搅拌机中，设置转速为1000rpm，25℃下搅拌5h，以得到均一的混合溶液；

将已洗净干燥的硅片置于旋涂机上，用移液枪将混合溶液取0.05ml滴在硅片上，设置旋涂速度2000rpm，旋涂时间20s，旋涂形成均一的aunr薄膜，即完成对等离激元层的制作。

s2.用移液枪取0.05ml的0.4mg/mlpmma溶液滴在步骤s1制得的样品上，在旋涂速度4000rpm下旋涂20s，形成厚度为4nm的pmma纳米薄膜，接着在200℃下对样品进行3min的退火处理，即完成隔离层的制作。

s3.正己烷为溶剂，配制0.3mg/ml的cdse量子点溶液；将步骤s2制得的样品置于旋涂台上；用移液枪量取0.05ml的量子点溶液并分散在样品上；设置旋涂速度2000rpm，时间20s，进行旋涂，即可将量子点转移到基底，形成均匀膜层，利于之后的观察。

s4.用移液枪量取0.05ml2.0mg/ml的pmma丙酮溶液分散在量子点薄膜之上，设置旋涂速度4000rpm，时间20s，进行旋涂，即可完成pmma保护层的制作。

s5.将mf介质微球(直径为10μm)分散在去离子水中，超声分散15min，以使微球分散均匀，再用移液枪量取0.05ml上述mf介质微球溶液分散在步骤s4制得的样品的表面，再将其放入60℃的干燥箱中干燥24h，制得微纳复合结构mf/qd/aunr。

实施例2

一种具有荧光增强和光学放大效应的微纳复合结构，包括等离激元层、隔离层、荧光层、保护层和介质微球层；其中等离激元层由pmma和aunr组成，隔离层由pmma组成，荧光层由cdse量子点组成，保护层由pmma组成，介质微球层由mf介质微球组成。

上述微纳复合结构的制备方法，包括如下步骤：

本实施例的制备方法与实施例1相同，区别在于，步骤s2所述退火温度替换为300℃。

实施例3

一种具有荧光增强和光学放大效应的微纳复合结构，包括等离激元层、隔离层、荧光层、保护层和介质微球层；其中等离激元层由pmma和aunr组成，隔离层由pmma组成，荧光层由上转换纳米材料组成，保护层由pmma组成，介质微球层由mf介质微球组成。

上述微纳复合结构的制备方法，包括如下步骤：

本实施例的制备方法与实施例1相同，区别在于，步骤s2所述cdse量子点替换为上转换纳米材料。

实施例4

一种具有荧光增强和光学放大效应的微纳复合结构，包括等离激元层、隔离层、荧光层、保护层和介质微球层；其中等离激元层由pmma和aunr组成，隔离层由pmma组成，荧光层由上转换纳米材料组成，保护层由pmma组成，介质微球层由mf介质微球组成。

上述微纳复合结构的制备方法，包括如下步骤：

本实施例的制备方法与实施例1相同，区别在于，步骤s2所述pmma溶液浓度替换为1mg/ml。

实施例5

一种具有荧光增强和光学放大效应的微纳复合结构，包括等离激元层、隔离层、荧光层、保护层和介质微球层；其中等离激元层由pmma和aunr组成，隔离层由pmma组成，荧光层由上转换纳米材料组成，保护层由pmma组成，介质微球层由mf介质微球组成。

上述微纳复合结构的制备方法，包括如下步骤：

本实施例的制备方法与实施例1相同，区别在于，步骤s2所述pmma溶液浓度替换为2mg/ml。

实施例6

一种具有荧光增强和光学放大效应的微纳复合结构，包括等离激元层、隔离层、荧光层、保护层和介质微球层；其中等离激元层由pmma和aunr组成，隔离层由pmma组成，荧光层由上转换纳米材料组成，保护层由pmma组成，介质微球层由二氧化硅微球组成。

上述微纳复合结构的制备方法，包括如下步骤：

本实施例的制备方法与实施例1相同，区别在于，步骤s5所述mf介质微球替换为二氧化硅微球。

实施例7

一种具有荧光增强和光学放大效应的微纳复合结构，包括等离激元层、隔离层、荧光层、保护层和介质微球层；其中等离激元层由pmma和aunr组成，隔离层由pmma组成，荧光层由上转换纳米材料组成，保护层由pmma组成，介质微球层由ps微球组成。

上述微纳复合结构的制备方法，包括如下步骤：

本实施例的制备方法与实施例1相同，区别在于，步骤s5所述mf介质微球替换为直径100nm的ps微球。

实施例8

一种具有荧光增强和光学放大效应的微纳复合结构，包括等离激元层、隔离层、荧光层、保护层和介质微球层；其中等离激元层由ps和aunr组成，隔离层由ps组成，荧光层由上转换纳米材料组成，保护层由ps组成，介质微球层由mf微球组成。

上述微纳复合结构的制备方法，包括如下步骤：

本实施例的制备方法与实施例1相同，区别在于，所述pmma替换为ps。

实施例9

一种具有荧光增强和光学放大效应的微纳复合结构，包括等离激元层、隔离层、荧光层、保护层和介质微球层；其中等离激元层由ps和银纳米颗粒组成，隔离层由ps组成，荧光层由上转换纳米材料组成，保护层由ps组成，介质微球层由mf微球组成。

上述微纳复合结构的制备方法，包括如下步骤：

本实施例的制备方法与实施例1相同，区别在于，步骤s1所述aunr替换为银纳米颗粒。

对比例1

本对比例的制备方法与实施例1相同，区别在于，本对比例不包含步骤s5，制得qd/aunr。

对比例2

本对比例的制备方法与对比例1相同，区别在于，本对比例步骤s2调节pmma溶液的浓度为1mg/ml，制得qd/aunr。

对比例3

本对比例的制备方法与对比例1相同，区别在于，本对比例步骤s2调节pmma溶液的浓度为2mg/ml，制得qd/aunr。

对比例4

本对比例的制备方法与实施例1相同，区别在于，本对比例包含步骤s1中硅基底的清洁与准备，不包含步骤s1中等离激元层的制作，步骤s5的mf介质微球直径替换为1μm，制得mf/qd。

对比例5

本对比例的制备方法与对比例4相同，区别在于，本对比例的mf介质微球直径替换为5μm，制得mf/qd。

对比例6

本对比例的制备方法与对比例4相同，区别在于，本对比例的mf介质微球直径替换为8μm，制得mf/qd。

对比例7

本对比例的制备方法与实施例7相同，区别在于，本对比例不包含步骤s5，制得qd/aunr。

图1为介质微球/贵金属纳米材料的微纳复合结构的荧光增强原理示意图，左侧的图是荧光材料在没有微纳复合结构时，在激发光下没有荧光增强的效果图，右侧的是在荧光材料在复合结构中，在激发光下，产生了荧光增强的效果图，该微纳复合结构结合了介质微球的纳米喷流效应和金纳米棒的等离子体效应，在相同的激发条件下，能够实现显著的荧光增强。

性能测试

1、测试方法

测试样品1组：对比例1、2、3

测试样品2组：对比例4、5、6

测试样品3组：实施例1

测试样品4组：实施例7、对比例7

同时，选用相同浓度的qd用旋涂的方式在硅基底上制作qd样品，作为参考。

将以上测试样品1、2、3组依次置于连接有电荷感光元件(charge-coupleddevice，ccd)的显微分光光度计的三维移动平台上，在白光光源下，调节平台位置和焦点位置，在仪器所连电脑画面中找到清晰的样品表面图像。切换光源，选取365nm的光作为激发光，在暗场下观察不同样品中量子点荧光的强度。

将测试样品4组的纳米荧光材料置于显微分光光度计的三维移动平台上，选取的显微镜头的放大倍数为40倍，数值孔径为0.6，工作距离为1.8mm。在白光下通过调节三维移动平台和焦距来观测。之后切换光源，在365nm光源的激发下，观测实施例7和对比例7(有/无微球)的纳米荧光材料。

2、结果分析

沿图中蓝色虚线的位置，做高度与位置的曲线图，如图所示，根据台阶的平均高度差，即可得到隔离层的厚度。用不同浓度的pmma溶液旋涂得到的不同厚度的pmma隔离层的荧光增强效果分析如下：当pmma溶液的浓度分别为0.4、1和2mg/ml时，所得到的隔离层厚度分别为4(图2)、8(图3)、12nm(图4)。图5为不同隔离层厚度下aunr结构基底对于量子点荧光的增强光谱。改变隔离层的厚度，可以观测到金纳米结构基底对于荧光的不同增强效果，当没有隔离层时，aunr的等离子体共振效应表现为对荧光的猝灭，量子点荧光减弱；当隔离层厚度逐渐增加时，等离子体共振效应逐渐由对荧光的猝灭转变为对荧光的增强，当隔离层厚度为8nm时，这种增强效果最强，量子点荧光增强了22倍；当隔离层厚度进一步增加时，等离子体共振效应减弱，荧光增强效应也因此减弱。因而，通过对比实验结果发现，8nm的隔离层厚度下可以取得最优的荧光增强效果。

图6为不同直径的mf微球对于量子点荧光的增强光谱。不同直径的mf微球对量子点的荧光增强效果分析如下：由于介质微球的纳米喷流效应，mf微球的存在会对入射光有汇聚作用，从而能够提高入射光的能量密度，因而可以增强荧光，所以，mf/qd样品中的荧光强度都比qd样品的强。这种对于光的汇聚作用，会随着mf微球直径的增加而增强，因而，随着微球直径的增加，mf/qd样品的荧光强度也在增加，当mf微球直径为10μm时，荧光强度增加了26倍。

通过光谱测量，可以定量的观测到微纳复合结构对于荧光的增强效果。

图7为实施例1制得的微纳复合结构的示意图，可以看到，该微纳复合结构从下到上由基底、等离激元层、聚合物隔离层、荧光层、聚合物保护层、介质微球层六部分组成，其中，聚合物隔离层的厚度为8nm，微球直径为10μm。

图8为实施例1制得的微纳复合结构对量子点荧光增强光谱，图中四条曲线分别为qd、对比例1制得的qd/aunr、对比例4制得的mf/qd、实施例1制得的mf/qd/aunr四种样品中量子点的荧光光谱。插图为365nm激发下复合结构的光学显微镜暗场荧光图片，其中红色亮斑处是微球所在的位置。可以看到，相比于单纯的量子点(qd)样品来说，mf/qd/aunr复合结构中对于量子点荧光有高达260倍的增强，而只有微球存在时，mf/qd结构的量子点荧光增强了26倍，只有等离激元层存在时，qd/aunr结构的量子点荧光增强了22倍。可以看到，微纳复合结构对于荧光层的荧光增强效果比单独微球或等离激元层存在时提高了一个数量级。

图9为实施例7制得的微纳复合结构对于荧光微粒的放大成像图片。其中，图9a为纳米荧光颗粒的透射电镜图，可以看到，选取的荧光微粒直径分布均匀，为100nm左右。图9b、c分别为焦平面在荧光层和微球处的带有荧光层的微纳复合结构的亮场光学显微镜图片，图9d、e分别为b、c对应的暗场荧光图片(激发光波长为365nm)。可以发现，由于光学衍射极限的存在，在光学显微镜下我们无法分辨出荧光颗粒(图9b)。在微球的帮助下，由于微球的光学放大作用，调节焦平面，我们可以在光学显微镜下看到荧光颗粒，但是成像还不够清晰(图9c)。在365nm的激发下，由于微纳复合结构对于荧光的增强效应，使得荧光颗粒的亮度更明显(图9d)，这种荧光增强再加上介质微球的光学放大作用，我们能够区分出单个纳米荧光颗粒，成功实现了光学显微镜下对于100nm尺度下荧光材料的超分辨成像(图9e)。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。